后海、后三里、大腸俞對(duì)大鼠便秘及胃腸運(yùn)動(dòng)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

李 碩，王海燕，馬愛團(tuán)

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院，保定 071000)

早在1979年12月，便秘就被列入世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦針灸治療的43種病癥之一。對(duì)于消化系統(tǒng)病譜，便秘是針灸治療的優(yōu)勢(shì)病種[1]。便秘是獸醫(yī)臨床常見疾病，西藥主要通過刺激胃腸運(yùn)動(dòng)進(jìn)行緩解，但長(zhǎng)期使用效果不理想。針灸治療動(dòng)物便秘取穴方便，療效確切。根據(jù)古籍記載和臨床經(jīng)驗(yàn)，后海(GV-1)能夠顯著緩解動(dòng)物便秘，后三里(ST-36)和大腸俞(BL-25)廣泛治療人和動(dòng)物的胃腸道疾病[2-4]。雖然臨床證實(shí)了這些穴位對(duì)便秘的治療效果，但獸醫(yī)針灸的基礎(chǔ)研究非常薄弱，目前，尚不明確不同穴位緩解便秘的作用途徑和作用機(jī)理是否一致，治療便秘的優(yōu)勢(shì)穴位是哪個(gè)等。本試驗(yàn)用洛哌丁胺建立大鼠便秘模型[5]，選擇臨床治療動(dòng)物便秘常用的GV-1、ST-36、BL-25，研究3個(gè)穴位對(duì)便秘大鼠的緩解作用，檢測(cè)針灸對(duì)胃腸動(dòng)力相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的影響，比較結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的完整性及變化，比較3個(gè)穴位的異同，探索治療便秘的優(yōu)勢(shì)穴位，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 選取SPF級(jí)SD大鼠60只[購自斯貝福(北京)生物科技有限公司]，體質(zhì)量(210±10)g，在ivc鼠房單只單籠飼養(yǎng)，自由飲水飲食，室內(nèi)溫度(21±2)℃，相對(duì)濕度(55±5)%。于墊料上放置濾網(wǎng)方便采集大鼠糞便和觀察糞便情況。

1.1.2 藥物 將鹽酸洛哌丁胺(2 mg·粒-1)(上海朝暉藥業(yè)有限公司)除去外面膠囊，將藥粉與蒸餾水混勻，制成混懸液備用。將枸櫞酸莫沙必利(5 mg·片-1)(魯南貝特有限公司)片劑壓成粉末，與蒸餾水混勻制成混懸液備用。

1.1.3 主要試劑與儀器 Go Taq?pCR Master Mix(A6001， Promega, USA)、GoScriptTMReverse Transcription System (A5001, Promega, USA)、Eastep?Super總RNA提取試劑盒 (LS1040, Promega，北京)、Rat VIP ELISA KIT、Rat SS ELISA KIT、Rat SP ELISA KIT、Rat 5-HT ELISA KIT (酶聯(lián)生物科技有限公司，上海)、冷凍離心機(jī)(Sigma公司)、SYNERGY HTX全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Bio Tek公司)、LightCycler?96全自動(dòng)熒光定量PCR儀(羅氏診斷產(chǎn)品有限公司，上海)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 60只SD大鼠(210±10)g適應(yīng)性常規(guī)飼養(yǎng)后，采用抽簽的方法隨機(jī)分為6組，即對(duì)照A組、模型B組、西藥治療C組、GV-1D組、ST-36 E組、BL-25 F組，每組10只，均單籠飼養(yǎng)。A組灌服生理鹽水，其他各組均灌服3 mg·(kg·d)-1洛哌丁胺混懸液，每天上午1次，建立便秘模型[5]。5 d后，糞便含水量下降，首粒黑便時(shí)間延長(zhǎng)，確定造模成功。每天上午繼續(xù)洛哌丁胺灌胃，同時(shí)在下午進(jìn)行不同治療，連續(xù)6 d。其中，C組灌服莫沙必利[1.38 mg·(kg·d)-1][6]，D、E、F組大鼠分別針刺GV-1、ST-36、BL-25 3個(gè)穴位。GV-1位于尾根與肛門之間的凹陷，直刺5 mm；ST-36雙側(cè)取穴，位于膝關(guān)節(jié)下方3寸(體寸)，脛骨前嵴外側(cè)0.5寸(體寸)，直刺6 mm；BL-25雙側(cè)取穴，位于背中線旁開1.5寸(體寸)，第4腰椎兩側(cè)，直刺5 mm。穴位定位及針刺操作參照羅永江等[7]及Xie等[2]的方法，采用Mac脈針灸針(0.16 mm×7 mm)快速直刺入穴位，每10 min進(jìn)行1次捻轉(zhuǎn)提插行針，留針30 min。 A組、B組和C組在大腿內(nèi)側(cè)的非穴位處針刺30 min。第7天心臟采血，根據(jù)美國獸醫(yī)協(xié)會(huì)推出的動(dòng)物安樂死指南頸椎脫臼安樂死。血液室溫靜置3 h，4 ℃ 3 500 r·min-1離心15 min，分離血清，分裝后置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。摘取結(jié)腸前段,置于4%甲醛溶液固定和超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)河北省動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物處理過程通過河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理使用委員會(huì)的動(dòng)物倫理學(xué)審查。

1.2.2 各組大鼠便秘情況評(píng)定 禁食不禁水，動(dòng)物試驗(yàn)處理后再用0.3 mL墨水灌胃，記錄首粒黑便時(shí)間。觀察記錄大鼠20粒糞便長(zhǎng)度、糞便含水量、體質(zhì)量。

糞便含水量：收集糞便稱取濕質(zhì)量，烘干箱90 ℃烘干6 h，稱取干質(zhì)量：[糞便含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%]

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè) 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)5-羥色胺(5-HT)、生長(zhǎng)抑素(SS)、血管活性腸肽(VIP)、P物質(zhì)(SP)含量。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)結(jié)腸組織5-羥色胺3受體(5-HT3R)mRNA、5-羥色胺4受體(5-HT4R)mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)腸組織HE染色，觀察腸道組織結(jié)構(gòu)，計(jì)數(shù)各組隱窩-絨毛軸中杯狀細(xì)胞數(shù)量。

表1 實(shí)時(shí)定量 PCR引物列表

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 本試驗(yàn)所有結(jié)果均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。試驗(yàn)過程中使用Excel數(shù)據(jù)庫記錄數(shù)據(jù)，并使用SPSS20.0分析軟件(IBM Corporation，Armonk，NY，USA)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。方差齊性檢驗(yàn)后，通過單因素方差分析(one way ANOVA)比較參數(shù)的差異性。LSD法進(jìn)行組間多重比較。差異的顯著性水平為P<0.05或P<0.01。

2 結(jié) 果

2.1 GV-1、ST-36、BL-25 對(duì)大鼠便秘指標(biāo)的影響

模型組大鼠首粒黑便時(shí)間延長(zhǎng)，糞便含水量下降，糞便顆粒長(zhǎng)度縮短，體重下降(P<0.01或P<0.05)。治療后GV-1組、ST-36組的首粒黑便時(shí)間縮短 (P<0.01)，與西藥治療組無顯著差異，接近對(duì)照組。與模型組比較，GV-1組、ST-36組、BL-25組糞便含水量分別增加12.86%、16.67%、14.59% (P<0.01)。GV-1組20粒糞便長(zhǎng)度與模型組有極顯著差別，并且優(yōu)于西藥治療組。GV-1組和ST-36組大鼠體重比模型組顯著增加 (P<0.05)，詳見表2和圖1。

2.2 GV-1、ST-36、BL-25 對(duì)便秘大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

由圖2可知，模型組大鼠血清5-HT含量升高(P<0.01)，針刺ST-36使血清中5-HT含量降低23.93%，與模型組有極顯著性差異；GV-1和BL-25分別降低5.41%和7.47%，與模型組也有顯著性差異(P<0.05)。模型組血清SS含量極顯著上調(diào)(P<0.01)。針刺GV-1使SS含量降低36.34%，具有極顯著差異，基本達(dá)到對(duì)照組水平。針刺ST-36 使SS含量下調(diào)13.46% (P<0.05)。模型組血清VIP含量顯著降低，BL-25組VIP含量極顯著升高27.48%(P<0.01)，達(dá)到對(duì)照組水平。模型組血清SP含量顯著降低(P<0.05)，BL-25組SP含量顯著升高22.75% (P<0.05)。

表2 GV-1、ST-36、BL-25 對(duì)大鼠便秘指標(biāo)的影響

A組. 對(duì)照；B組. 模型；C組. 西藥治療；D組. GV-1；E組. ST-36；F組. BL-25Group A. Control; Group B. Model; Group C. Western medicine treatment; Group D. GV-1; Group E. ST-36; Group F. BL-25圖1 GV-1、ST-36、BL-25對(duì)便秘大鼠20粒糞便顆粒長(zhǎng)度的影響Fig.1 Effect of GV-1, ST-36, BL-25 on the length of 20 fecal pellets in rats with constipation

2.3 GV-1、ST-36、BL-25 對(duì)大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)清晰完整，腸腺發(fā)達(dá)，黏膜上皮細(xì)胞連接緊密，固有層無炎癥或萎縮，有大量杯狀細(xì)胞，杯狀細(xì)胞在進(jìn)行HE染色時(shí)，黏原顆粒被染料溶解，多呈現(xiàn)出空泡狀[8]。模型組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)模糊，腸腺萎縮、腫脹，黏膜上皮缺失，杯狀細(xì)胞減少。GV-1組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)清晰，腸腺恢復(fù)正常，杯狀細(xì)胞變大、增多。ST-36 和BL-25 組較模型組黏膜上皮完整，腸腺增寬。此外，GV-1 組結(jié)腸隱窩-絨毛軸中的杯狀細(xì)胞數(shù)量(418.60±12.0)個(gè)，與模型組(381.80±8.62)個(gè)比較，差異顯著(P<0.01)， 優(yōu)于西藥治療組，ST-36、BL-25組杯狀細(xì)胞數(shù)量也有顯著增加(數(shù)據(jù)略)，達(dá)到西藥治療組水平。

圖2 GV-1、ST-36、BL-25對(duì)便秘大鼠神經(jīng)遞質(zhì)的影響Fig.2 The effect of GV-1, ST-36, BL-25 on neurotransmitters in constipation rats

→表示絨毛杯狀細(xì)胞→refers to villous goblet cells圖3 GV-1、ST-36、BL-25對(duì)大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的影響(400×)Fig.3 Effects of GV-1, ST-36, BL-25 on the tissue structure of rat colon (400×)

2.4 GV-1、ST-36、BL-25 對(duì)便秘大鼠結(jié)腸組織中5-HT3R、5-HT4R mRNA的影響

由圖4可知，與對(duì)照組比較，模型組結(jié)腸組織中5-HT3R mRNA相對(duì)表達(dá)量降低67.96% (P<0.01)。而針刺GV-1、ST-36，5-HT3R mRNA相對(duì)表達(dá)量比模型組分別增加36.07%、40.98% (P<0.05)，與西藥組無差異。模型組結(jié)腸組織中5-HT4R mRNA相對(duì)表達(dá)量降低42%(P<0.01)。而ST-36組5-HT4RmRNA相對(duì)表達(dá)量比模型組增加65.52%(P<0.01)，優(yōu)于西藥治療組。GV-1組、BL-25組5-HT4RmRNA相對(duì)表達(dá)量分別增加32.76%、37.93%，差異顯著(P<0.05)。

圖4 GV-1、ST-36、BL-25對(duì)便秘大鼠結(jié)腸組織中5-HT3R、5-HT4R mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 The effect of GV-1, ST-36, BL-25 on the relative expression of 5-HT3R and 5-HT4R mRNA in the colon tissue of constipated rats

3 討 論

獸醫(yī)針灸是我國優(yōu)秀的文化遺產(chǎn)，由于獸醫(yī)針灸的基礎(chǔ)研究相對(duì)滯后，嚴(yán)重影響其在動(dòng)物臨床上的應(yīng)用。消化系統(tǒng)疾病是獸醫(yī)臨床常見病，針灸治療快速有效，GV-1、ST-36和BL-25是治療便秘及其他消化系統(tǒng)疾病的代表穴位[2.9]。

后海(GV-1)為督脈之始穴，動(dòng)物的后海取穴方便，效果迅速，多用于腹瀉、便秘及其他胃腸道疾病的治療[2.9]。本試驗(yàn)表明，針刺GV-1能夠降低血清中SS含量。SS作為腸道抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，當(dāng)胃腸道中SS的含量高于正常水平時(shí), 則會(huì)使腸蠕動(dòng)變緩，分泌異常[10]。GV-1還可以降低血清中5-HT濃度，5-HT表達(dá)水平過高會(huì)產(chǎn)生興奮性毒性[11]，導(dǎo)致結(jié)腸部位環(huán)形肌收縮和舒張功能異常[12]。由于5-HT濃度的升高，結(jié)腸持續(xù)處于收縮狀態(tài)，與糞便結(jié)合更緊密，過多吸收糞便中水分，導(dǎo)致糞便中水分減少引起便秘。針刺GV-1后下調(diào)了5-HT血清中的含量，緩解洛哌丁胺造成結(jié)腸環(huán)形肌收縮和舒張功能異常[13]，加快糞便通過結(jié)腸時(shí)間從而緩解便秘癥狀。

后三里(ST-36)是治療各種消化系統(tǒng)疾病的重要穴位，其療效已經(jīng)過千百年的驗(yàn)證。研究表明，針刺ST-36可以上調(diào)結(jié)腸組織5-HT3R、5-HT4R mRNA相對(duì)表達(dá)量。5-HT3R屬于配體門控陽離子通道受體[14]，5-HT3R可以影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加間質(zhì)細(xì)胞的活性，從而提高胃腸道的運(yùn)動(dòng)能力。據(jù)報(bào)道，5-HT3R拮抗劑能抑制結(jié)腸蠕動(dòng)，減少消化液分泌，導(dǎo)致便秘發(fā)生[15-16]。5-HT4R能增強(qiáng)腸道平滑肌收縮，增加腸道分泌。推測(cè)5-HT3R 與5-HT結(jié)合增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度并刺激中樞和外周神經(jīng)元的興奮性，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，增加乙酰膽堿(ACH)含量[17]。5-HT 作用于腸道 5-HT4R，促進(jìn) ACH 分泌，增加腸道平滑肌收縮頻率，增強(qiáng)腸道平滑肌蠕動(dòng)，影響腸蠕動(dòng)和分泌，縮短在結(jié)腸的時(shí)間及水分重吸收[18]。ST-36還可以下調(diào)SS緩解便秘癥狀。

大腸俞(BL-25)是大腸背俞穴，廣泛治療便秘及其他腸道疾病。本試驗(yàn)表明，針刺BL-25可以提高血清中VIP和SP含量。研究證實(shí)，VIP能夠改變消化道運(yùn)動(dòng)功能，改善便秘癥狀[19]，或者通過VIP-cAMP-PKA-AQP3通路治療功能性便秘[20]。VIP可使內(nèi)臟血管、胃腸道平滑肌舒張，增加膽汁、小腸水電解質(zhì)的分泌[21]，同時(shí)具有正性肌力的作用[22]。SP是體內(nèi)最強(qiáng)的興奮平滑肌的物質(zhì)之一，可直接作用于腸道平滑肌[23]，使平滑肌收縮、蠕動(dòng)增強(qiáng)，促進(jìn)腸道排空，從而緩解便秘癥狀。

另外，針刺GV-1、ST-36、BL-25均可增加結(jié)腸杯狀細(xì)胞的數(shù)量，研究表明，結(jié)腸杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白，是結(jié)腸黏液層的重要成分[24]。杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白伴隨水分的擴(kuò)散分泌進(jìn)入腸腔，增加腸腔內(nèi)水分，緩解便秘。

4 結(jié) 論

針刺GV-1、ST-36、BL-25穴位均能改善便秘癥狀。GV-1可顯著降低血清中5-HT、SS含量，上調(diào)結(jié)腸組織中5-HT3R、5-HT4R mRNA表達(dá)。ST-36降低血清中5-HT含量，提高結(jié)腸組織中5-HT3R、5-HT4R mRNA表達(dá)。BL-25提高血清中VIP、SP含量，增加5-HT4R mRNA表達(dá)。3個(gè)穴位均能改善便秘大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)，增加杯狀細(xì)胞數(shù)量。綜上表明，GV-1治療便秘效果優(yōu)于ST-36和BL-25。