房顫患者卒中后微栓子與血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、淋巴細(xì)胞表面凋亡因子相關(guān)性研究

黃小麗 董禮全

（山東大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，山東威海 264200）

房顫是一種常見(jiàn)的心臟電活動(dòng)紊亂伴隨心房機(jī)械功能障礙的心律失常，是缺血性卒中最重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，而我國(guó)對(duì)房顫合并缺血性卒中的診斷率偏低[1-2]。臨床上對(duì)房顫患者發(fā)生卒中后的病理存在不同認(rèn)知，不確定腦部是否有微栓子形成；且相比于心血管，腦血管對(duì)抗血小板聯(lián)合抗凝治療的耐受性更差，用藥后更易引發(fā)出血[3]，故臨床需要更多指標(biāo)進(jìn)行病情評(píng)估。微栓子信號(hào)（microembolic signals，MES）是經(jīng)顱多普勒超聲所能檢測(cè)到的血流中通過(guò)的微小顆粒信號(hào)，既往研究多集中于其對(duì)復(fù)發(fā)性缺血性卒中有預(yù)警作用[4]。另有研究表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）和淋巴細(xì)胞表面凋亡因子（CD95）的表達(dá)可能與缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但尚無(wú)針對(duì)房顫合并急性缺血性卒中這一患病人群的研究，且MES與上述血液指標(biāo)的關(guān)系尚不清楚[5-6]。本研究旨在探究房顫患者卒中后MES變化，以及MES與Treg和CD95的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年10月至2021年1月山東大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科收治的房顫合并急性缺血性卒中患者111例作為試驗(yàn)組，其中男性91 例，女性20例；年齡58～75歲，平均年齡（69.1±4.3）歲；患房顫時(shí)間1～4年，平均患房顫（3.30±0.47）年。將試驗(yàn)組按照MES結(jié)果分為兩個(gè)亞組，分別為陽(yáng)性亞組和陰性亞組。陽(yáng)性亞組28 例，其中男性20例，女性8例；年齡59～74歲，平均年齡（68.5±2.2）歲；房顫時(shí)間1～3年，平均房顫（2.16±0.29）年。陰性亞組83例，其中男性71例，女性12例；年齡58～77歲，平均年齡（68.8±3.4）歲；房顫時(shí)間1～3年，平均房顫（2.55±0.21）年。選取同期收治的不伴房顫的缺血性卒中患者73例作為對(duì)照組，其中男性38例，女性35例；年齡58～75歲，平均年齡（70.5±3.2）歲。試驗(yàn)組與對(duì)照組、試驗(yàn)組兩個(gè)亞組患者之間的年齡、性別構(gòu)成比等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已獲得山東大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所納入患者均已簽署知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①急性缺血性卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)臨床確診[7]；②符合2014年英國(guó)健康和臨床療效國(guó)家研究院（NICE）房顫診療指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)臨床確診[8]；③患者急性缺血性卒中發(fā)病1周內(nèi)；④美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評(píng)分≤20分[9]；⑤患者可配合影像學(xué)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴腫瘤、免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、急性感染性疾病者；②近4周有外傷史或外科手術(shù)史者；③病情危重不能完成研究者；④大腦中動(dòng)脈主干梗死而不能取得超聲血流信號(hào)者。

1.2 方法 MES檢測(cè)：患者入院后24 h內(nèi)完成經(jīng)顱多普勒超聲（TCD）的MES監(jiān)測(cè)（EMS-9EBX2P 型超聲診斷儀，生產(chǎn)商：深圳市德利凱醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）。患者取安靜仰臥位，由2名神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師共同監(jiān)測(cè)。以2 MHz探頭取得腦梗死病灶側(cè)大腦中動(dòng)脈清晰信號(hào)，固定頭架，深度50～60 mm，兩點(diǎn)間距大于6 mm，取樣容積為6～12 mm。采用1995年第9屆國(guó)際腦血液循環(huán)會(huì)議制定的標(biāo)準(zhǔn)判斷MES信號(hào)：①時(shí)程短暫，持續(xù)時(shí)間＜300 ms的顆粒信號(hào)；②強(qiáng)度較背景血流信號(hào)≥3dB；③單向出現(xiàn)于多普勒頻譜中；④音頻為“劈啪音”或“鳥(niǎo)鳴聲”；⑤在心動(dòng)周期內(nèi)隨機(jī)出現(xiàn)；⑥在2個(gè)監(jiān)測(cè)深度存在時(shí)間延遲。檢測(cè)完畢回放每個(gè)微栓子信號(hào)，除外偽差和干擾。檢測(cè)時(shí)間60 min，將監(jiān)測(cè)結(jié)果MES≥1定義為MES陽(yáng)性。Treg、CD95檢測(cè)：患者入院24 h內(nèi)采集肘靜脈血2 mL，以二胺四乙酸抗凝，6 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)（EPICS XL-4型流式細(xì)胞儀，美國(guó)貝克曼公司生產(chǎn)）。每份樣本取4支流式專(zhuān)用試管，加入全血標(biāo)本100 μL，冰上避光孵育30 min，加入Optilyse C溶血素500μL，室溫避光30 min，加入2 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），1 200 r/min離心5 min，棄上清。分別加入熒光標(biāo)記抗體及同型對(duì)照，其中Treg為小鼠抗人熒光單抗CD25-FITC、CD4-PE-Cy5及同型對(duì)照（生產(chǎn)商：法國(guó)Immunotech公司），CD95為小鼠抗人熒光單抗CD95-PE及同型對(duì)照（生產(chǎn)商：晶美生物公司）。加入0.5 mLPBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。以FS-SS設(shè)門(mén)分析外周血Treg細(xì)胞（CD25表達(dá)熒光強(qiáng)度＞100者為CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）和淋巴細(xì)胞表面CD95的表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo) ①M(fèi)ES檢測(cè)情況。MES陽(yáng)性率=[MES陽(yáng)性例數(shù)/總例數(shù)]×100%。②血Treg水平及淋巴細(xì)胞表面CD95水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用[例（%）]表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，用（）表示，其中方差齊者行t檢驗(yàn)、方差不齊者行t′檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)組和對(duì)照組患者M(jìn)ES陽(yáng)性率及CD95、Treg水平比較 試驗(yàn)組患者M(jìn)ES陽(yáng)性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。試驗(yàn)組患者Treg水平低于對(duì)照組，而CD95水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表 1。

表1 試驗(yàn)組和對(duì)照組患者M(jìn)ES陽(yáng)性情況、Treg和CD95水平的比較

2.2 兩亞組外周血Treg、CD95水平比較 MES陽(yáng)性亞組患者Treg水平低于陰性亞組，MES陽(yáng)性亞組患者CD95水平高于陰性亞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.05），見(jiàn)表 2。

表2 MES陽(yáng)性亞組與MES陰性亞組Treg、CD95比較（，%）

表2 MES陽(yáng)性亞組與MES陰性亞組Treg、CD95比較（，%）

組別 例數(shù) Treg CD95 MES陽(yáng)性亞組 28 7.49±1.78 36.97±2.73 MES陰性亞組 83 9.48±2.72 33.76±1.13 t′值 4.42 6.05 P值 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

相比腦動(dòng)脈狹窄導(dǎo)致缺血性卒中患者，房顫導(dǎo)致的栓塞沒(méi)時(shí)間形成側(cè)支循環(huán)，急性卒中時(shí)缺血半暗帶相對(duì)小，壞死腦組織多，致殘率高。MES是經(jīng)顱多普勒超聲所能檢測(cè)到的血流中通過(guò)的微小顆粒信號(hào)，這些小顆粒本質(zhì)上多為微小血栓碎片[10]。MES增加是急性缺血性腦卒中復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)因子[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于不伴房顫的卒中患者，房顫合并急性缺血性卒中患者超聲檢查的MES陽(yáng)性率高（P＜0.05）。分析其原因，一方面可能是由于房顫患者心房?jī)?nèi)栓子脫落急性卒中發(fā)生以后仍可能有部分贅生物殘存并且脫落；另一方面可能是心房?jī)?nèi)再次形成新的不穩(wěn)定的贅生物體積更小、數(shù)量更多，也更容易脫落。

腦卒中后往往還伴隨著應(yīng)激反應(yīng)及繼發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)。Treg是重要的免疫細(xì)胞，是重要的卒中后炎癥反應(yīng)的保護(hù)因子。卒中發(fā)生后，急性期其血循環(huán)濃度越低，可能腦損傷越重[12-13]。CD95為凋亡因子，可能與腦卒中時(shí)機(jī)體啟動(dòng)神經(jīng)元缺血受損后的凋亡反應(yīng)及繼發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞增生反應(yīng)有關(guān)[14-15]。本次研究結(jié)果顯示：試驗(yàn)組患者Treg水平低于對(duì)照組、CD95水平高于對(duì)照組；MES陽(yáng)性亞組患者Treg水平低于MES陰性亞組、CD95水平高于MES陰性亞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。這提示急性卒中后的應(yīng)激狀態(tài)中，房顫且MES陽(yáng)性患者的免疫失調(diào)更嚴(yán)重、炎癥反應(yīng)更為劇烈、神經(jīng)元凋亡更嚴(yán)重。

綜上所述，房顫合并缺血性卒中患者在急性期進(jìn)行微栓子信號(hào)檢查及外周血Treg、CD95的檢測(cè)有助于對(duì)其病理過(guò)程的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，微栓子的存在可能加重Treg介導(dǎo)的免疫失調(diào)及CD95參與的凋亡反應(yīng)，因此對(duì)于存在微栓子的這類(lèi)患者，更積極的抗凝治療和更緊密的臨床相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，對(duì)于患者獲得更好的預(yù)后可能有積極意義。