昆明地區(qū)兒童流感嗜血桿菌分型研究

楊俊逸 袁 梅 張建英 徐 華 黃海林

（昆明市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南省昆明市 650103）

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hi）是兒童社區(qū)獲得性感染的重要病原菌，常引起非侵襲性感染（呼吸道感染）和侵襲性感染（菌血癥、腦膜炎等），嚴(yán)重危害兒童健康[1]。不同地區(qū)和人群Hi的分型結(jié)果不同，而細(xì)菌分型是疾病流行病學(xué)和疫苗研發(fā)的重要基礎(chǔ)。本文通過分析104株Hi標(biāo)本，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)分型和血清莢膜分型，以了解昆明地區(qū)兒童流感嗜血桿菌流行類型情況，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年1月至2020年12月，昆明市兒童醫(yī)院經(jīng)ATB細(xì)菌藥敏分析儀（廠家：法國(guó)梅里埃，型號(hào)：ATB1525EXPRESSION、質(zhì)控菌株為Hi標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49766）診斷為Hi感染的患兒標(biāo)本，去除同一患兒的重復(fù)標(biāo)本，共104株，包括87份痰、4份血、4份肺泡灌洗液、4份膿液、1份腦脊液、4份分泌物（眼結(jié)膜、傷口）標(biāo)本。研究取得患兒父母或法定監(jiān)護(hù)人同意并簽署知情同意書，經(jīng)院內(nèi)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①6個(gè)月～5歲兒童；②伴不同程度呼吸道感染癥狀；③診斷為Hi感染的患兒[2]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無法配合患兒；②近期應(yīng)用抗生素患兒。

1.2 方法 ①菌株的分離培養(yǎng)和鑒定。巧克力平皿上挑取可疑菌落，經(jīng)衛(wèi)星試驗(yàn)初步篩選后，采用全自動(dòng)微生物鑒定儀（法國(guó)梅里埃，型號(hào)：Vitek-2-compact 60）確診為Hi。嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[3]第4版操作。②生物學(xué)分型。根據(jù)Hi對(duì)靛基質(zhì)、吲哚、鳥氨酸脫羧酶生化反應(yīng)管（杭州濱和微生物試劑有限公司，批號(hào)：210104，規(guī)格：20支裝）反應(yīng)結(jié)果的差異，可以將Hi分為Ⅰ（+、+、+）、Ⅱ（+、+、-）、Ⅲ（-、+、-）、Ⅳ（-、+、+）、Ⅴ（+、-、+）、Ⅵ（-、-、+）、Ⅶ（+、-、-）、Ⅷ（-、-、-、）共8個(gè)生物型。③血清莢膜分型。血清學(xué)分型采用玻片凝集法，取5uL Hi菌懸液和等量莢膜型特異性抗血清（日本DENKA SEIKEN株式會(huì)社，批號(hào)：748106，規(guī)格：2 mL×6）混勻，1 min內(nèi)出現(xiàn)凝集為對(duì)應(yīng)的Hia-Hif莢膜型，不凝集則為無莢膜不可分型（Non-typeable H.influenzae，NTHi）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，對(duì)分型結(jié)果與標(biāo)本關(guān)系數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果

2.1 生物學(xué)分型結(jié)果 104株Hi中，生物型占比由高到低依次是：Ⅱ型47株（45.2%）、Ⅲ型40株（38.5%）、Ⅰ型8株（7.7%）、Ⅳ型5株（4.8%）、Ⅵ型3株（2.9%）、Ⅴ型1株（1.0%）。Ⅱ型和Ⅲ型最常見，其他生物型不多見，Ⅶ和Ⅷ型均未檢出。

2.2 血清莢膜型分型結(jié)果 血清莢膜型分型中，93株（89.4%）為不可分型流感嗜血桿菌（nontypeable Haemophilus influenza，NTHi），11 株（10.6%）為莢膜型，包括Hib型6株（5.8%）、Hie型3株（2.9%）、Hic型和Hif型各1株（1.0%）。

2.3 分型與標(biāo)本來源的關(guān)系 Hi生物學(xué)分型、血清莢膜型分型結(jié)果與標(biāo)本關(guān)系如表1所示。NTHi標(biāo)本來自痰、血、肺泡灌洗液、膿、分泌物。Hib標(biāo)本來自痰、血、膿、腦脊液。I型主要來自膿、腦脊液、血。眼分泌物均檢出Ⅱ型。來源于血、腦脊液的4株Hib均同為生物型Ⅰ型。其余血清莢膜型和生物型的關(guān)系不明顯。

表1 流感嗜血桿菌分型與標(biāo)本來源的關(guān)系（株）

3 討論

流感嗜血桿菌為革蘭陰性短小桿菌，是5歲以下兒童社區(qū)獲得性感染重要致病菌，主要引起呼吸道感染，此外還可導(dǎo)致菌血癥、關(guān)節(jié)炎、蜂窩織炎、中耳炎、鼻咽炎、腦膜炎等疾病。

國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)不同人群流行的Hi生物型各不相同。根據(jù)Hi對(duì)靛基質(zhì)、吲哚、鳥氨酸脫羧酶生化反應(yīng)管反應(yīng)結(jié)果的差異，可分成Ⅰ～Ⅷ共8種生物型。本研究顯示，Ⅱ型和Ⅲ型占比83%以上，是本地區(qū)最主要的流行生物型。但根據(jù)不同研究，昆明地區(qū)成人以Ⅲ型和Ⅳ型為主[4]；成都地區(qū)以Ⅰ和Ⅳ型為主[5]；而上海地區(qū)兒童以Ⅲ型為主[6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，不同生物型引起的疾病也不同，Ⅰ型常引起兒童急性下呼吸道感染和膿毒血癥，Ⅱ型引起呼吸道爆發(fā)性疾病，Ⅲ型引起組織蜂窩織炎，Ⅳ型引起新生兒敗血癥[7]。本研究結(jié)果顯示：血、腦脊液標(biāo)本中檢出Hib同時(shí)也檢出Ⅰ型生物型，且Ⅰ型主要來自膿、腦脊液、血標(biāo)本，說明Hib與I型可能存在一定關(guān)聯(lián)，以及Ⅰ型侵襲力較強(qiáng)容易導(dǎo)致膿毒血癥、腦膜炎；組織蜂窩織炎常見標(biāo)本傷口分泌物、膿液中檢出Ⅲ型，說明Ⅲ型可引起該類疾病發(fā)生；眼分泌物標(biāo)本均檢出Ⅱ型，可能與眼結(jié)膜炎有關(guān)，與上文所提到的文獻(xiàn)報(bào)道不一致，原因可能與標(biāo)本量較小有關(guān)，需要格外關(guān)注。

我國(guó)流感嗜血桿菌以無莢膜不可分型NTHi為主，但不同地區(qū)血清莢膜型構(gòu)成比有差異[8]。根據(jù)莢膜多糖抗原不同，流感嗜血桿菌可分為a、b、c、d、e、f 6個(gè)莢膜血清型和無莢膜不可分型NTHi。本研究顯示，NTHi占比約90%而成為本地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型，而本研究中的NTHi標(biāo)本來自痰、膿、血、分泌物等，說明NTHi主要會(huì)引起呼吸道非侵襲性感染，也可引起膿毒血癥等侵襲性感染；莢膜型僅占10%。文獻(xiàn)報(bào)道Hib型致病性和毒力最強(qiáng)，常引起肺炎、菌血癥等嚴(yán)重疾病[9]。本研究中Hib型標(biāo)本來源于痰、血、膿、腦脊液，證實(shí)了此觀點(diǎn)。Hif致病力其次，本文中Hif感染患兒被診斷為重癥肺炎。本次試驗(yàn)中，觀察到Hie標(biāo)本均來自痰，且菌落形態(tài)不是光滑露滴狀而是黏液型，值得我們注意?？傊訦ib疫苗推廣以來，高致病力的b型流感嗜血桿菌發(fā)病率明顯降低，與此同時(shí)，NTHi型流感嗜血桿菌成為主要流行血清型。因此，NTHi型疾病預(yù)防和疫苗研發(fā)十分重要。

綜上所述，流感嗜血桿菌是兒童社區(qū)獲得性感染的重要致病菌。昆明地區(qū)兒童可檢出Ⅰ～VI型，但以Ⅱ型和Ⅲ型為主，不同生物型呈現(xiàn)出關(guān)聯(lián)疾病，Ⅰ型可引起膿毒血癥，Ⅲ型可引起組織蜂窩織炎。另外，本地區(qū)主要流行NTHi型會(huì)引起呼吸道非侵襲性感染，也能引起菌血癥、組織蜂窩織炎等嚴(yán)重侵襲性感染。Hib等莢膜血清型雖然檢出率較低，但容易導(dǎo)致膿毒血癥，仍需警惕。