高溫和酶解處理水稻秸稈后植物促生物質(zhì)的鑒定及其效果研究

唐思宇，劉秋梅，孟曉慧，馬磊，劉東陽，黃啟為，沈其榮

高溫和酶解處理水稻秸稈后植物促生物質(zhì)的鑒定及其效果研究

唐思宇，劉秋梅，孟曉慧，馬磊，劉東陽，黃啟為，沈其榮

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)研究重點實驗室/江蘇省有機(jī)固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095

【】探究農(nóng)業(yè)廢棄物水稻秸稈對植物的促進(jìn)作用，質(zhì)譜鑒定并比較分析水稻秸稈高溫浸提液以及酶解液中可能存在的小分子促生物質(zhì)，驗證這些物質(zhì)對黃瓜生長的促進(jìn)效果。通過高溫水浸提的方式，在溫度115℃，浸提時間30 min的條件下制備水稻秸稈高溫浸提液；通過硫酸銨沉淀法濃縮哈茨木霉菌NJAU 4742在以水稻秸稈為唯一碳源下液體發(fā)酵產(chǎn)生的胞外酶，并利用該胞外酶降解水稻秸稈，從而制備水稻秸稈酶解液，將水稻秸稈高溫浸提液及酶解液稀釋成不同倍數(shù)后，通過黃瓜水培試驗驗證其促生效果，基于UHPLC-QE-MS非靶標(biāo)檢測技術(shù)對其中的促生物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，QE質(zhì)譜儀在采集軟件（Xcalibur 4.0.27，Thermo）的控制下，以信息相關(guān)采集模式對水稻秸稈高溫浸提液以及酶解液進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，通過自主編寫的R程序包（內(nèi)核為XCMS）對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理，然后與BiotreeDB（V2.1）自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋。最后通過黃瓜水培試驗驗證部分二級質(zhì)譜鑒定物質(zhì)的促生效果。水稻秸稈高溫浸提液和酶解液在適宜濃度下均能促進(jìn)黃瓜幼苗生長，其中水稻秸稈酶解液在稀釋100倍時對黃瓜有明顯促生效果，與CK相比，經(jīng)過酶解液處理的植株地上部干重、地下部干重和株高分別增加了52.64%、55.05%和21.43%，植株根尖數(shù)增加了31.95%；水稻秸稈高溫浸提液在稀釋50倍時促生效果最好，與CK相比，高溫浸提液處理后的植株地上部干重、地下部干重和株高分別增加了44.16%、63.38%和55.56%，植株根尖數(shù)增加了64.44%。UHPLC-QE-MS非靶標(biāo)檢測技術(shù)結(jié)果表明，在水稻秸稈高溫浸提液中鑒定出714種物質(zhì)，在酶解液中鑒定出638種物質(zhì)；基于二級質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，乙酰膽堿、左旋肉堿和肌醇可能是促生相關(guān)的功能物質(zhì)；外源添加3種功能物質(zhì)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品的研究結(jié)果表明，3種物質(zhì)均對黃瓜幼苗生長有顯著的促進(jìn)效果。1、10、100 μmol·L-1濃度的乙酰膽堿均能促進(jìn)黃瓜植株的生長，與CK 相比，1 μmol·L-1濃度的外源乙酰膽堿使黃瓜地上部干重增加54.69%，根系干重增加了73.67%，黃瓜根尖數(shù)增加了130.5%；外源左旋肉堿在0.1和1 mmol·L-1濃度下有利于黃瓜植株生長，與CK相比，黃瓜地上部干重分別增加了33.79%和30.19%，根系干重分別增加了44.97%和48.82%，黃瓜根尖數(shù)分別增加了41.8%和49.9%；在黃瓜水培體系中添加0.05、0.1 mmol·L-1濃度的外源肌醇可以促進(jìn)其生長，與CK相比，黃瓜地上部干重分別增加了36.66%和30.15%，根系干重增加了69.82%和51.78%，黃瓜根尖數(shù)分別增加了149.0%和96.7%。水稻秸稈高溫浸提液和酶解液均能顯著促進(jìn)黃瓜生長，LCMS分析結(jié)果及化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品添加試驗表明高溫浸提液和酶解液中乙酰膽堿、左旋肉堿和肌醇等小分子是關(guān)鍵性的功能物質(zhì)，對黃瓜具有顯著的促生效應(yīng)。

水稻秸稈；高溫浸提；酶解；液質(zhì)聯(lián)用；促生

0 引言

【研究意義】我國對農(nóng)產(chǎn)品的需求不斷增加，尋找提高作物生產(chǎn)力的新方法勢在必行。我國是世界上最大的谷物生產(chǎn)國和消耗國，水稻秸稈是主要的農(nóng)業(yè)固體廢棄物之一，如何提高水稻秸稈的再利用效率是當(dāng)前研究重點[1]。研究表明，秸稈還田可提高土壤有機(jī)質(zhì)含量和提升土壤肥力，進(jìn)而增加作物產(chǎn)量，對保持農(nóng)田生態(tài)平衡有重要意義[2-3]。但由于秸稈結(jié)構(gòu)中有大量難降解的木質(zhì)素和纖維素，傳統(tǒng)的秸稈還田技術(shù)在實際應(yīng)用過程中往往會產(chǎn)生各種問題[4]。木霉菌是一種廣泛存在于土壤、植物根際和葉面的腐生型真菌，是土壤微生物的重要群落之一[5-6]。作為一種有益真菌，研究發(fā)現(xiàn)木霉具有很強(qiáng)的分解纖維素能力[7]；木霉菌利用農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈作為發(fā)酵載體，在發(fā)酵過程中，秸稈中的有機(jī)廢物被微生物充分利用，進(jìn)而產(chǎn)生更多有利于植物生長的營養(yǎng)物質(zhì)，且對環(huán)境無危害[8-9]。本研究旨在尋找解決由水稻秸稈帶來的環(huán)境問題的新方法，通過高溫浸提及木霉酶解的方式從水稻秸稈中提取對植物生長具有促進(jìn)作用的成分，以稻草為原料生產(chǎn)植物生長促進(jìn)劑，為農(nóng)業(yè)廢棄物的利用提供新的途徑，對減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化學(xué)肥料的用量、提高秸稈高效低成本降解技術(shù)和改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】與化肥相比，植物產(chǎn)生的生物效應(yīng)劑為作物生長和土壤健康提供了一種更環(huán)保的方式[10]，其中腐殖質(zhì)（humic substances，HS）被廣泛認(rèn)為是一種植物生長促進(jìn)劑，主要由于它能夠增大植物根系及其分枝，或者使其有更大密度的根毛以及根表面積[11-12]。另外，水稻秸稈衍生的HS在腐爛期間顯著增加，導(dǎo)致土壤有機(jī)物溶解力增強(qiáng)[13]。研究表明與使用其他溶劑相比，用水提取秸稈中的HS具有更好的促生效果，水提物不會對植物產(chǎn)生化學(xué)毒性、能提高種子發(fā)芽率和促進(jìn)根的伸長[14]。水稻秸稈中的生物活性物質(zhì)對番茄幼苗生長有促進(jìn)作用，研究證實水稻秸稈中的HS主要由多酚類物質(zhì)和多糖組成[15]?！颈狙芯壳腥朦c】本試驗發(fā)現(xiàn)對水稻秸稈進(jìn)行高溫浸提后，其上清液對黃瓜生長有促進(jìn)作用，基于此現(xiàn)象，為尋求更節(jié)能高效的秸稈利用方式，利用哈茨木霉菌NJAU 4742對木質(zhì)纖維素的降解能力來釋放水稻秸稈中的小分子物質(zhì)，驗證水稻秸稈酶解產(chǎn)物對黃瓜的促生作用；利用UHPLC-QE-MS非靶標(biāo)檢測技術(shù)對水稻秸稈高溫浸提液以及酶解產(chǎn)物進(jìn)行物質(zhì)鑒定和比較分析，并篩選出其中主要的促生長物質(zhì)，并通過黃瓜水培試驗對這些功能物質(zhì)進(jìn)行了外源添加驗證分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】探究水稻秸稈高溫浸提液以及酶解液對黃瓜生長的促進(jìn)作用及其最適施用濃度，鑒定并分析水稻秸稈經(jīng)過高溫浸提或酶解后釋放的小分子物質(zhì)，篩選水稻秸稈中的促生物質(zhì)并進(jìn)行黃瓜水培驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 哈茨木霉菌NJAU 4742，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化利用重點實驗室提供。

1.1.2 供試植物 津春4號黃瓜，天津市黃瓜研究所提供。

1.1.3 供試秸稈 所使用的秸稈為南粳2728水稻秸稈。

1.1.4 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽培養(yǎng)基：硫酸銨5 g·L-1、磷酸二氫鉀15 g·L-1、硫酸鎂0.6 g·L-1、無水葡萄糖10 g·L-1、無水氯化鈣1 g·L-1、一水合硫酸錳1.6 mg·L-1、七水合硫酸亞鐵5 mg·L-1、七水合硫酸鋅1.4 mg·L-1、氯化鈷2 mg·L-1。

MS培養(yǎng)基（不含瓊脂、蔗糖和有機(jī)質(zhì)）：硝酸鉀1.90 g·L-1、硝酸銨1.65 g·L-1、磷酸二氫鉀0.17 g·L-1、硫酸鎂0.37 g·L-1、氯化鈣0.44 g·L-1、碘化鉀0.83 mg·L-1、硼酸6.2 mg·L-1、硫酸錳22.3 mg·L-1、硫酸鋅8.6 mg·L-1、鉬酸鈉0.25 mg·L-1、硫酸銅0.025 mg·L-1、氯化鈷0.025 mg·L-1、乙二胺四乙酸二鈉37.3 mg·L-1、硫酸亞鐵27.8 mg·L-1。

1.2 方法

1.2.1 水稻秸稈預(yù)處理 為了去除水稻秸稈中的雜質(zhì)并提高水稻秸稈中有機(jī)物的釋放，將水稻秸稈剪碎后用自來水多次沖洗，在55℃烘箱下干燥后研磨成粉末，過60目篩后在干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 水稻秸稈高溫浸提液的制備 取研磨并過60目篩的水稻秸稈粉末和去離子水混勻，保證秸稈含量為1%（w/v），在115℃下浸提30 min，待冷卻后離心棄沉淀，并用0.22 μm濾膜過濾上清液，濾液定義為水稻秸稈高溫浸提液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 哈茨木霉菌NJAU 4742液體發(fā)酵 選用1%（w/v）葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基作為液體發(fā)酵培養(yǎng)液，接入哈茨木霉菌NJAU 4742新鮮孢子液1 mL（孢子濃度為107spore·mL-1）后，在28℃、170 r/min條件下培養(yǎng)2 d；將培養(yǎng)好的木霉菌體用2層無菌紗布過濾，再用ddH2O沖洗3—4次，轉(zhuǎn)接到200 mL以1%（w/v）水稻秸稈粉末為唯一碳源的基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在28℃、170 r/min條件下培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵產(chǎn)物離心進(jìn)行固液分離，上清液過無菌濾膜，保存至4℃冰箱。

1.2.4 硫酸銨沉淀 在冰浴條件下，向1 L發(fā)酵粗酶液中加入516 g固體硫酸銨粉末（75%飽和度）。待硫酸銨粉末完全溶解后，將混合液置于4℃冰箱靜置過夜，使蛋白質(zhì)充分沉淀。沉淀結(jié)束后，將混合物在4℃、12 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液保留沉淀。沉淀用1—2倍沉淀物體積的PBS緩沖液重懸，將重懸后的粗酶液放入透析袋中透析12 h，每隔3 h更換一次透析液。收集透析后的粗酶液，用考馬斯亮藍(lán)染色法測定上清中蛋白質(zhì)的含量，并分裝保存在-80℃冰箱備用。

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳 分別制備5%的濃縮膠和10%的分離膠，待凝固后取15 μL液體發(fā)酵上清液以及濃縮的粗酶液和2 μL 10×Loading Buffer（含5%巰基乙醇和8 mol·L-1尿素）混合均勻后上樣6 μL，并在電壓為80 V，電流200 mA條件下電泳2—3 h。電泳結(jié)束后，將蛋白膠從玻璃板中取出，用去離子水清洗一遍后，放入固定液中進(jìn)行固定30 min；固定完成后取出蛋白膠沖洗，致敏30 min后水洗3次，每次10 min，銀染25 min，再水洗3次，每次1 min，最后放入顯色液中進(jìn)行顯色，待蛋白條帶顯色完全后，將蛋白膠放入終止液中終止顯色，并進(jìn)行掃描拍照。

1.2.6 水稻秸稈酶解液的制備 將1 g過60目篩的水稻秸稈粉末加100 mL去離子水，在115℃下，高壓滅菌30 min，4 000×離心10 min后棄上清，加入無菌水超聲波清洗5 min后棄上清，反復(fù)超聲清洗5次。將水洗后的水稻秸稈粉末轉(zhuǎn)入250 mL三角瓶并加無菌水80 mL，再加入20 mL 50 mmol·L-1的pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和0.5 mL濃縮粗酶液，同時設(shè)置加入滅活的粗酶液作為對照。體系在37℃，200 r/min條件下振蕩酶解3 d，酶解完成后將酶解產(chǎn)物10 000×離心10 min保留上清液，并置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 水稻秸稈高溫浸提產(chǎn)物及酶解產(chǎn)物的鑒定分析

1.2.7.1 水稻秸稈高溫浸提液及酶解液冷凍干燥 收集秸稈高溫浸提液和酶解液后，將樣品過0.22 μm無菌濾膜，裝入冷凍干燥瓶中，在-80℃冰箱中冷凍完全后，轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)的凍干箱中，設(shè)置預(yù)凍溫度后，啟動儀器直至樣品完全脫水凍干成粉末。

1.2.7.2 促生物質(zhì)提取 在20 mg粉末樣品中加入

1 000 μL提取液（甲醇﹕乙腈﹕水=2﹕2﹕1（v/v）），渦旋混勻30 s；利用球磨儀在35 Hz條件下研磨處理4 min，在冰上超聲5 min；重復(fù)研磨超聲步驟3次；-40℃條件下靜置1 h；將樣品4℃，12 000 r/min離心15 min；取上清置于進(jìn)樣瓶中備用。

1.2.7.3 上機(jī)檢測 本研究使利用UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters）1290 Infinity系列UHPLC系統(tǒng)（Agilent Technologies）對目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。流動相由25 mmol·L-1乙酸銨和25 mmol·L-1氨水（pH 9.75）的溶液（A）和乙腈（B）組成；在0—0.5 min，95% B; 0.5—7.0 min，95%—65%B；7.0—8.0 min，65%—40%B；8.0—9.0 min，40%B；9.0—9.1 min，40%—95%B；9.1—12.0 min，95%B條件下進(jìn)行梯度洗脫；流動相流速設(shè)置為0.5 mL·min-1，柱溫設(shè)置為25℃，自動進(jìn)樣器溫度設(shè)置為4℃，進(jìn)樣量為3 μL。

QE質(zhì)譜儀在采集軟件（Xcalibur 4.0.27，Thermo）的控制下，以信息相關(guān)采集（IDA）模式進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，在此模式下，采集軟件會連續(xù)評估全掃描質(zhì)譜圖。設(shè)定ESI源條件為：鞘氣流速為45 Arb，輔助氣流速為15 Arb，毛細(xì)管溫度400℃，全MS分辨率為70 000，MS/MS分辨率為17 500，碰撞能量為10/30/60，在NCE模式下，噴涂電壓分別為4.0 kV（正）或-3.6 kV（負(fù)）。

1.2.7.4 數(shù)據(jù)處理 用ProteoWizard軟件將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包（內(nèi)核為XCMS）進(jìn)行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理，然后與BiotreeDB（V2.1）自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋，算法打分的Cutoff值設(shè)為0.3。

1.2.8 黃瓜無菌苗培養(yǎng) 將黃瓜種子用50℃溫水浸泡10 min，再轉(zhuǎn)移至30℃水中浸泡3 h后，在超凈臺用70%無水乙醇溶液消毒3 min，再用含2%有效氯的次氯酸鈉溶液消毒3 min，用無菌水漂洗6次，洗去種子表面殘留的次氯酸鈉溶液，再將黃瓜種子均勻鋪在鏤空的網(wǎng)格上，網(wǎng)格架空于2 L的玻璃燒杯中，網(wǎng)格下加入滅菌過的1/4MS培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基液面稍微低于網(wǎng)格，用8層紗布和皮筋封牢燒杯口（發(fā)苗裝置用紗布包好后提前進(jìn)行115℃，30 min滅菌處理）。將玻璃燒杯置于30℃黑暗的恒溫培養(yǎng)箱中催芽2 d，當(dāng)種子長出芽白后將燒杯移至28℃溫室中繼續(xù)培養(yǎng)（16 h光照/8 h黑暗）。當(dāng)幼苗長出兩片子葉并生長至6 cm高度時，在無菌環(huán)境下用鑷子小心將黃瓜幼苗從燒杯中移出，轉(zhuǎn)接至50 mL三角瓶中，加入50 mL滅菌處理的1/4 MS培養(yǎng)液，用無菌棉花固定黃瓜苗，待黃瓜苗長至一葉一心時做后續(xù)試驗處理。

1.2.9 黃瓜水培試驗 黃瓜水培試驗于2020年4—7月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院溫室進(jìn)行，當(dāng)黃瓜無菌苗培育至一葉一心時，將長勢一致的黃瓜幼苗從50 mL三角瓶轉(zhuǎn)移至100 mL三角瓶中，并進(jìn)行處理。

水稻秸稈高溫浸提液/酶解液的黃瓜水培試驗設(shè)計：一共設(shè)置了4種不同的稀釋倍數(shù)，分別為將水稻秸稈高溫浸提液/酶解液稀釋25倍、50倍、100倍和200倍（分別標(biāo)注為25、50、100、200），設(shè)置只添加1/4MS營養(yǎng)液的處理作為空白對照（CK），每個處理設(shè)置6個生物學(xué)重復(fù)。每隔3 d更換營養(yǎng)液一次，更換時按照處理濃度補(bǔ)充高溫浸提液或酶解液，培育期間定期觀察記錄黃瓜植株的生長狀態(tài)，培養(yǎng)11 d后收苗并測量植株生長指標(biāo)。

外源添加氯化乙酰膽堿、左旋肉堿和肌醇的黃瓜水培試驗設(shè)計：3種物質(zhì)分別設(shè)置了不同的濃度梯度處理，其中氯化乙酰膽堿：1、10和100 μmol·L-1；左旋肉堿：0.1、1和5 mmol·L-1；肌醇：0.05、0.1和1 mmol·L-1。設(shè)置只添加1/4 MS營養(yǎng)液的處理作為空白對照（CK），每個處理設(shè)置6個生物學(xué)重復(fù)。每隔3 d更換一次三角瓶和營養(yǎng)液，更換三角瓶時按照處理濃度補(bǔ)充物質(zhì)，培育期間定期觀察記錄黃瓜植株的生長狀態(tài)，培養(yǎng)7 d后收苗并測量植株生長指標(biāo)。

1.2.10 植株生長指標(biāo)測定 植株葉面積用“長寬乘積法”計算，即根據(jù)黃瓜葉片長度和葉片最大寬度的乘積，再除以校正系數(shù)1.19可得到黃瓜葉片的面積[16]；莖粗使用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量；株高使用直尺測量；葉片葉綠素測量采用SPAD-502葉綠素儀測量新長成葉，選取葉片上5個點，去除偏差較大的值后取平均值；地上部/地下部鮮重選用百分之一天平稱量；地上部/地下部干重是將新鮮的植株樣品裝入信封徹底烘干后使用萬分之一天平稱量。

植株根系數(shù)據(jù)分析：將根系樣品放入樣品盤中完全展開，樣品盤預(yù)先加入適量清水，便于根樣分散以減少根重疊，利用根系掃描儀Epson Expression 10000XL掃描根系。掃描結(jié)束后，利用分析軟件進(jìn)行圖像分析及數(shù)據(jù)輸出，主要選取指標(biāo)為總根長、根尖數(shù)、總根表面積。

植株生長指標(biāo)均為5株水培黃瓜幼苗植株數(shù)據(jù)，去掉最大最小值后取3個數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析 采用IBM SPSS Statistics 21軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因素（one-way ANOVA）和Duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較（α=0.05），使用Origin9、AI作圖，圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 哈茨木霉菌NJAU 4742胞外蛋白分泌結(jié)果

圖1為哈茨木霉菌NJAU 4742在水稻秸稈誘導(dǎo)下發(fā)酵5 d的上清液和濃縮后粗酶液的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果及蛋白濃度測量結(jié)果。由圖1可見，木質(zhì)纖維素酶主要分布在100—40 kDa之間，圖1-A膠圖條帶顯示，硫酸銨沉淀法可以較好地濃縮發(fā)酵上清液中這部分的蛋白。濃縮后粗酶液的蛋白濃度相比濃縮前提高了10倍左右（圖1-B）。

圖A為胞外蛋白的電泳圖，圖B為不同樣品的蛋白濃度；T1：哈茨木霉菌NJAU 4742在水稻秸稈誘導(dǎo)下發(fā)酵5 d的上清液；T2：將T1進(jìn)行硫酸銨沉淀后的粗酶液

2.2 水稻秸稈酶解液的黃瓜水培試驗結(jié)果

外源添加水稻秸稈酶解液的黃瓜水培試驗結(jié)果表明，水稻秸稈酶解液對黃瓜幼苗生長有促進(jìn)作用。和CK相比，稀釋50倍和稀釋100倍處理的黃瓜幼苗新葉面積分別增加了546.16%和474.95%；葉綠素含量增加了44.55%和40.59%；莖粗分別增加了16.19%和22.38%；株高分別增加了16.07%和21.43%；地上部干重分別增加了44.01%和52.64%（圖2-B、2-C、2-D，表1）。根系掃描結(jié)果表明，高濃度的秸稈酶解液會抑制黃瓜根系生長，稀釋25倍處理的黃瓜幼苗的根系干重以及總根長、根表面積與CK相比都有所下降，而低濃度的酶解液對黃瓜根系生長影響不大，稀釋50倍和稀釋100倍的處理則可以明顯促進(jìn)黃瓜根系發(fā)育，和CK相比，其根系干重分別增加了54.08%和55.05%（圖2-E），根尖數(shù)分別增加了33.48%和31.95%（表1）。

圖2 水稻秸稈酶解液對黃瓜幼苗生長的影響

表1 水稻秸稈酶解液對黃瓜幼苗部分生長指標(biāo)的影響

CK：1/4MS營養(yǎng)液培養(yǎng)（空白對照）；200：水稻秸稈酶解液稀釋200倍處理黃瓜幼苗；100：秸稈酶解液稀釋100倍處理黃瓜幼苗；50：秸稈酶解液稀釋50倍處理黃瓜幼苗；25：秸稈酶解液稀釋25倍處理黃瓜幼苗。數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間在＜0.05 水平差異顯著

CK: 1/4MS nutrient solution culture (blank control); 200: rice straw enzymatic hydrolysate diluted 200 times to treat cucumber seedlings; 100: rice straw enzymatic hydrolysate diluted 100 times to treat cucumber seedlings; 50: rice straw enzymatic hydrolysate diluted 50 times to treat cucumber seedlings; 25: rice straw enzymatic hydrolysate diluted 25 times to treat cucumber seedlings. Different letters in the same column indicate significant differences between treatments at 0.05 level

2.3 水稻秸稈高溫浸提液的黃瓜水培試驗結(jié)果

外源添加水稻秸稈高溫浸提液的黃瓜無菌水培試驗結(jié)果表明（圖3和表2）。在黃瓜水培體系中外源添加不同稀釋倍數(shù)的水稻秸稈高溫浸提液均能不同程度地促進(jìn)黃瓜生長，其中促生效果最佳的為稀釋50倍和稀釋25倍的處理。與CK相比，用稀釋50倍的高溫浸提液處理的黃瓜植株的新葉面積和葉綠素含量分別增加了187.14%和12.20%。而稀釋25倍處理的黃瓜植株的新葉面積和葉綠素含量分別增加了294.96%和33.33%。和CK相比，稀釋50倍處理的植株在莖粗和株高上分別增加了13.66%和55.56%；而稀釋25倍處理的植株分別增加了14.69%和55.56%。外源添加水稻秸稈高溫浸提液還能明顯促進(jìn)黃瓜的根系發(fā)育，與CK相比，稀釋100倍、50倍、25倍處理的根系干重分別增加了18.24%、63.38%和55.27%。根系掃描分析結(jié)果表明，外源添加水稻秸稈高溫浸提液對植物根系的最大影響體現(xiàn)在根尖數(shù)量的變化上，4種不同稀釋倍數(shù)處理的根尖數(shù)量均有不同程度的增加，稀釋200倍、100倍、50倍和25倍處理的根尖數(shù)與CK相比，分別增加了10.33%、33.73%、64.44%和52.65%。

圖3 水稻秸稈高溫浸提液對黃瓜幼苗生長的影響

表2 水稻秸稈高溫浸提液對黃瓜幼苗部分生長指標(biāo)的影響

CK：1/4MS營養(yǎng)液培養(yǎng)（空白對照）；200：水稻秸稈高溫浸提液稀釋200倍處理黃瓜幼苗；100：高溫浸提液稀釋100倍處理黃瓜幼苗；50：高溫浸提液稀釋50倍處理黃瓜幼苗；25：高溫浸提液稀釋25倍處理黃瓜幼苗。數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間在＜0.05水平差異顯著

CK: 1/4MS nutrient solution culture (blank control); 200: rice straw high-temperature extract diluted 200 times to treat cucumber seedlings; 100: rice straw high-temperature extract diluted 100 times to treat cucumber seedlings; 50: rice straw high-temperature extract diluted 50 times to treat cucumber seedlings; 25: rice straw high-temperature extract diluted 25 times to treat cucumber seedlings. Different letters in the same column indicate significant differences between treatments at 0.05 level

2.4 液質(zhì)聯(lián)用結(jié)果

2.4.1 二級質(zhì)譜定性結(jié)果 為進(jìn)一步研究水稻秸稈中的促生成分，分別對水稻秸稈高溫浸提液以及酶解液進(jìn)行UHPLC-QE-MS非靶標(biāo)檢測，圖4為水稻高溫浸提液及酶解液的LCMS總離子流圖。結(jié)果表明，水稻秸稈高溫浸提液的出峰時間較為分散，主要出峰時間段為1—6 min（圖4-A），而酶解液中物質(zhì)的出峰時間段集中在5—7 min之間（圖4-B）。液質(zhì)聯(lián)用結(jié)果表明高溫浸提相比酶解對水稻秸稈中的功能物質(zhì)釋放的效果更為明顯。對待測樣品進(jìn)行峰識別、峰提取等處理后，基于BiotreeDB自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋，在水稻秸稈高溫浸提液中定性到714種物質(zhì)，而在水稻秸稈酶解液中通過二級質(zhì)譜共定性到638種物質(zhì)。

A：水稻秸稈高溫浸提液；B：水稻秸稈酶解液 A: Rice straw high-temperature extract; B: Rice straw enzymatic hydrolysate

為進(jìn)一步縮小促生物質(zhì)篩選范圍，本研究設(shè)置了對照處理（水稻秸稈酶解過程中設(shè)置的滅活對照，即在酶解體系中加入經(jīng)過煮沸30 min處理的粗酶液）并對其進(jìn)行了LCMS定性分析。黃瓜水培試驗結(jié)果表明，滅活對照處理的上清液不具有促生效果（數(shù)據(jù)未顯示），因此，在進(jìn)行二級質(zhì)譜定性物質(zhì)篩選時，可以優(yōu)先篩選在對照處理中未鑒定到但在酶解液/高溫浸提液樣品中相對含量較高的物質(zhì)。

2.4.2 二級質(zhì)譜定性物質(zhì)篩選 在LCMS液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果中，我們將水稻秸稈高溫浸提液及酶解液與CK（滅活對照）進(jìn)行對比分析，根據(jù)二級質(zhì)譜打分值（MS2 score ＞0.8）和值（＜0.05）進(jìn)行篩選，篩選出3種可能的促生物質(zhì)，結(jié)果如表3所示，它們分別是乙酰膽堿、左旋肉堿和肌醇。乙酰膽堿和左旋肉堿均為含氮化合物，一般選用ESI正離子模式檢測，而肌醇容易失去質(zhì)子帶負(fù)電荷，一般在ESI負(fù)離子模式中被檢測到。二級質(zhì)譜定性結(jié)果表明，乙酰膽堿、左旋肉堿在水稻秸稈高溫浸提液和酶解液中均存在，并且在水稻秸稈高溫浸提液中的相對含量要大于酶解液，而肌醇在水稻秸稈酶解液中的相對含量更大。3種物質(zhì)的二級質(zhì)譜圖及其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖5所示。

表3 二級質(zhì)譜篩選結(jié)果

2.5 外源添加二級質(zhì)譜定性物質(zhì)促生試驗結(jié)果

在黃瓜培養(yǎng)體系中外源添加不同濃度的氯化乙酰膽堿，結(jié)果表明，1、10、100 μmol·L-1濃度的氯化乙酰膽堿均能促進(jìn)黃瓜植株的生長，主要表現(xiàn)在新葉面積、植株莖粗、葉綠素含量以及植株干鮮重的增加上（圖6-A）。其中1 μmol·L-1處理的黃瓜植株和CK相比，新葉面積增加了103.91%；葉綠素含量增加29.44%；植株莖粗增加了16.46%（表4），植株地上部干重增加54.69%，根系干重增加了73.67%（圖6-A）。根系掃描結(jié)果表明，外源乙酰膽堿也能促進(jìn)黃瓜根系的生長，主要體現(xiàn)在植株總根長、根表面積以及總根尖數(shù)的增加上（表4）

在黃瓜水培體系中外源添加不同濃度的左旋肉堿（0.1、1和5 mmol·L-1），結(jié)果表明，在0.1 和1 mmol·L-1濃度下，外源左旋肉堿可以促進(jìn)黃瓜植株的生長，與CK相比，新葉面積分別增加了40.22%和23.85%；葉綠素含量分別增加了9.10%和14.68%；植株莖粗分別增加了12.80%和12.20%（表4），地上部干重分別增加了33.79%和30.19%，根系干重分別增加了44.97%和48.82%（圖6-B）。根系掃描結(jié)果和地上部生長指標(biāo)結(jié)果一致，0.1 mmol·L-1以及1 mmol·L-1濃度的左旋肉堿能夠促進(jìn)黃瓜根系生長，而5 mmol·L-1濃度處理和CK處理之間差異不明顯（表4）。上述結(jié)果均表明，在適宜濃度下，左旋肉堿能夠起到促進(jìn)黃瓜幼苗生長的作用。

圖5 篩選物質(zhì)的二級質(zhì)譜圖

圖6 不同濃度的氯化乙酰膽堿、左旋肉堿和肌醇對黃瓜幼苗生長的影響

在黃瓜水培體系中分別添加0.05和0.1 mmol·L-1濃度的外源肌醇可以促進(jìn)黃瓜生長。與CK處理相比，新葉面積分別增加了66.42%和51.56%；葉綠素含量分別增加了22.65%和24.04%；植株莖粗分別增加了20.43%和16.46%（表4），地上部干重分別增加了36.66%和30.15%，根系干重增加了69.82%和51.78%（圖6-C）。根系掃描結(jié)果表明，0.05和0.1 mmol·L-1的外源肌醇能夠促進(jìn)黃瓜根系生長發(fā)育，和CK處理相比，其總根長和側(cè)根數(shù)量都明顯增長；但1 mmol·L-1濃度處理和CK相比，植株地上部和地下部生長都受到了明顯抑制（表4）。結(jié)果表明外源肌醇在適宜濃度下才能起到促進(jìn)黃瓜生長的作用。

表4 不同濃度的氯化乙酰膽堿、左旋肉堿和肌醇對黃瓜幼苗部分生長指標(biāo)的影響

數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間在＜0.05水平差異顯著

Different letters in the same column indicate significant differences between treatments at 0.05 level

3 討論

水稻秸稈是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要的廢棄物之一，研究發(fā)現(xiàn)許多農(nóng)業(yè)廢棄物是生物效應(yīng)劑的潛在來源，對種子萌發(fā)有促進(jìn)作用[17]。水稻秸稈成分較為復(fù)雜，含有大量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和少量的礦質(zhì)元素，目前對水稻秸稈的再利用方式主要有秸稈焚燒、秸稈還田以及秸稈的資源化利用[18]。如何提高秸稈的資源化利用效率是當(dāng)前研究重點。本研究主要集中討論水稻秸稈經(jīng)過水熱處理以及哈茨木霉菌分泌的胞外蛋白酶解處理后的成分對作物生長是否有促進(jìn)作用。JIA 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，稻草的水熱處理會導(dǎo)致其半纖維素減少，同時纖維素和木質(zhì)素含量增加。稻草中存在簡單的酚類化合物，它們在處理過程中可能以細(xì)胞壁多糖片段的酯形式釋放到溶液中。MA等[15]研究了秸稈中的生物活性物質(zhì)對番茄幼苗生長的促進(jìn)作用。經(jīng)盆栽試驗證實，秸稈的裂解物主要由多酚類物質(zhì)和多糖組成，能促進(jìn)番茄幼苗生長。這一系列研究結(jié)果表明，水稻秸稈的水熱處理是一種可行的利用方式，具有較好的生物效應(yīng)和發(fā)展成生物肥料的潛力。稻草的酶解產(chǎn)物中包括多種不同的化合物，例如芳香醇、芳香酚、小分子醛、脂質(zhì)和烯烴等[20]。纖維素酶是生物降解過程中的關(guān)鍵酶。它們由三大類酶組成：內(nèi)切葡聚糖酶；纖維蛋白水解酶和β-葡萄糖苷酶[21-22]，這些酶主要由真菌產(chǎn)生，包括木霉和曲霉[21]。木霉菌因其高產(chǎn)纖維素酶而被廣泛研究[23]。黃瓜水培試驗結(jié)果表明，哈茨木霉菌NJAU 4742酶解水稻秸稈后的酶解液能顯著促進(jìn)黃瓜幼苗生長發(fā)育，在適宜濃度下，可以顯著促進(jìn)黃瓜幼苗的新葉萌發(fā)、提高黃瓜葉片的葉綠素含量以及植株地上/地下部干物質(zhì)的積累。研究發(fā)現(xiàn)，在設(shè)置的4個濃度梯度中，水稻秸稈高溫浸提液稀釋25倍和稀釋50倍這兩種處理的植株生長指標(biāo)相差不大，表明外源添加的水稻秸稈高溫浸提液達(dá)到一定濃度后，其促生效果將不再隨著濃度上升。同樣在水稻秸稈酶解液處理的水培試驗中，發(fā)現(xiàn)外源加入的酶解液濃度過高時，其促生作用大幅度下降，和對照相比，酶解液稀釋25倍處理對黃瓜根系發(fā)育有明顯抑制作用。這可能是因為秸稈酶解產(chǎn)物中存在某些刺激性物質(zhì)，這些物質(zhì)在濃度過高時反而不利于黃瓜幼苗的生長。

為了進(jìn)一步研究水稻秸稈高溫浸提/酶解后的成分，對水稻秸稈高溫浸提產(chǎn)物以及酶解產(chǎn)物進(jìn)行UHPLC-QE-MS非靶標(biāo)檢測。LCMS中ESI正離子模式適用于檢測大部分化合物，通過二級質(zhì)譜比對分析，在水稻秸稈高溫浸提液中鑒定出714種物質(zhì)，在水稻秸稈酶解液中鑒定出638種物質(zhì)。由于水稻秸稈成分的復(fù)雜性，二級質(zhì)譜結(jié)果中兩種產(chǎn)物的定性物質(zhì)數(shù)量過多，為了進(jìn)一步縮小篩選范圍的同時盡可能保證定性結(jié)果的準(zhǔn)確性，將兩種產(chǎn)物和對照組中定性到的物質(zhì)進(jìn)行比較分析，再結(jié)合值和二級質(zhì)譜打分值進(jìn)行篩選，主要選擇了乙酰膽堿、左旋肉堿和肌醇這3種具有代表性的物質(zhì)進(jìn)行研究，根據(jù)已有文獻(xiàn)報道，它們對作物生長可能有不同程度的促進(jìn)作用[24-26]。乙酰膽堿（ACh）是一種季銨化合物，類似于植物激素，也是一種神經(jīng)遞質(zhì)，存在于微生物、植物和動物的非神經(jīng)組織或器官中[27]。越來越多的證據(jù)表明乙酰膽堿具有非神經(jīng)元功能，外源乙酰膽堿在10-7—10-3mol·L-1濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)植物根系生長的作用[24,28]。本研究的結(jié)果表明，外源乙酰膽堿在1、10 和100 μmol·L-1均能顯著提高黃瓜植株的葉綠素含量和干重等生長指標(biāo)，同時能明顯促進(jìn)黃瓜根系的側(cè)根發(fā)育。左旋肉堿，又名維生素BT，屬于季銨鹽類化合物。動物、細(xì)菌、真菌和植物均可自然合成左旋肉堿[29-30]。有研究表明，外源施用1?mmol·L-1左旋肉堿可以通過增加有絲分裂和減少氧化應(yīng)激對大麥幼苗DNA的損傷來減輕鹽脅迫對植物的有害影響[31]。外源左旋肉堿還能賦予擬南芥幼苗更好的抗氧化脅迫能力，從而提高其對過氧化氫供應(yīng)的反應(yīng)的存活率；同時，左旋肉堿對脫落酸信號通路具有拮抗作用[25]。我們在黃瓜水培試驗中，分別在黃瓜根系外源添加了3種不同濃度的左旋肉堿，結(jié)果表明，在0.1和1 mmol·L-1濃度下，外源左旋肉堿可以促進(jìn)黃瓜植株的生長。在水稻秸稈高溫浸提產(chǎn)物和酶解產(chǎn)物中，通過液質(zhì)聯(lián)用還鑒定出大量的乙酰左旋肉堿，乙酰左旋肉堿也稱為ALCAR，是左旋肉堿的乙?；问?，其具有和左旋肉堿相似的功能，在脂肪酸氧化過程中促進(jìn)乙酰輔酶A（CoA）進(jìn)入線粒體的吸收，增加乙酰膽堿的產(chǎn)生，并觸發(fā)膜磷脂和蛋白質(zhì)的合成[32]。肌醇是植物組織培養(yǎng)基中最常用的四種維生素之一，屬于維生素B復(fù)合物的一種。肌醇不僅可以支持植物的抗氧化防御系統(tǒng)，還可以通過調(diào)節(jié)Na+、K+的穩(wěn)態(tài)和滲透平衡來減輕鹽脅迫對植物生理過程的抑制作用[33]。肌醇對植物的正常生長發(fā)育起著重要作用。研究表明，在干旱條件下，外源性肌醇顯著增加了葉片水勢和相對含水量。與水結(jié)合的肌醇可以作為脯氨酸有效維持細(xì)胞充盈。外源性肌醇會降低植物的H2O2、AP和CAT活性以及膜損傷和脯氨酸水平，可以通過保護(hù)葉片水分狀況來減輕干旱脅迫的危害[26]。本研究通過液質(zhì)聯(lián)用在ESI負(fù)離子模式下，從水稻秸稈酶解產(chǎn)物中檢測到肌醇的存在，并且發(fā)現(xiàn)其相對含量遠(yuǎn)高于水稻秸稈高溫浸提產(chǎn)物，同時通過黃瓜水培試驗也發(fā)現(xiàn)，在合適的濃度下，外源肌醇也能夠促進(jìn)黃瓜幼苗生長。

4 結(jié)論

水稻秸稈中存在能促進(jìn)植物生長的功能物質(zhì)，這些物質(zhì)可利用高溫浸提和酶催化水解作用被釋放到溶液中，通過液質(zhì)聯(lián)用在水稻秸稈的高溫浸提產(chǎn)物及酶解產(chǎn)物中鑒定篩選出乙酰膽堿、左旋肉堿以及肌醇3種典型的促生小分子物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)其均能顯著促進(jìn)黃瓜幼苗的生長。本研究的結(jié)果為農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用提供新的方向，具有很好的應(yīng)用前景。

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Identification of Functional Substances from Rice Straw Obtained by Pyrolysis and Enzymolysis and Its Effect

TANG SiYu, LIU QiuMei, MENG XiaoHui, MA Lei, LIU DongYang, HUANG QiWei, SHEN QiRong

Jiangsu Key Laboratory for Organic Solid Waste Utilization, Nanjing Agricultural University/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Waste Resource Utilization, Nanjing 210095

【】To explore the effect of agricultural wastes (rice straw) on plant growth, the identification and analyzation of the small molecules that may exist in the high-temperature extracts and enzymolysis solution of rice straw were performed, and the promoting effect of these substances on cucumber growth was also evaluated.【】The high-temperature extract solution of rice straw was prepared by high temperature water extraction at 115℃ for 30 min. The condensation of the extracellular proteins fromNJAU 4742 under the induction of rice straw was obtained by ammonium sulfate precipitation method, which was used to hydrolyze the rice straw to prepare rice straw enzymatic hydrolysate. The high-temperature extract and enzymolysis solution of rice straw were diluted into different times, and the growth-promoting effects were verified by cucumber hydroponic experiment. The high-temperature extract and enzymatic hydrolysis of rice straw were identified and compared by UHPLC-QE-MS non-target metabolomics detection technology. Under the control of the acquisition software (Xcalibur 4.0.27, Thermo), the QE mass spectrometer collects primary and secondary mass spectrometry data in the information-related acquisition mode for the high-temperature extract and enzymatic hydrolysate of rice straw. Through the self-written R program package (the kernel was XCMS), the original data was processed for peak identification, peak extraction, peak alignment and integration, and then it was matched with the BiotreeDB (V2.1) self-built MS database for substance annotation. Finally, the growth-promoting effects of some identified substances were verified by the cucumber hydroponic experiment.【】The results showed that both high-temperature extract and enzymatic hydrolysate liquid of rice straw could promote the growth of cucumber seedlings at appropriate concentrations, and the enzymatic hydrolysate of rice straw showed significant growth promoting effect on cucumber when diluted for 100 times. Compared with the CK, the dry weight of overground part, underground part and plant height of cucumber plants treated with 100 times dilution increased by 52.64%, 55.05% and 21.43%, respectively, and the number of plant root tips increased by 31.95%. The high-temperature extract of rice straw owned the best growth promotion effect when it was diluted 50 times, in which the dry weight of overground part, the underground part and the plant height of cucumber plants increased by 44.16%, 63.38% and 55.56%, respectively, and the number of plant root tips increased by 64.44%, compared with CK. The UHPLC-QE-MS non-target detection technology results showed that 714 different substances were identified in the high-temperature extract of rice straw and 638 different substances were identified in the enzymatic hydrolysis solution, among which acetylcholine, L-carnitine and myo-inositol were screened out. Meanwhile, the standard products of these three substances were added to the cucumber root system, and the results showed that they all had considerable promotion effect on cucumber growth. Acetylcholine at the concentration of 1 μmol·L-1, 10 μmol·L-1and 100 μmol·L-1could all promote the growth of cucumber. Compared with CK, the exogenous acetylcholine at 1 μmol·L-1concentration increases the dry weight of cucumber shoots by 54.69% and the dry weight of roots by 73.67%, the number of root tips increased by 130.5%; Exogenous L-carnitine was beneficial to the growth of cucumber plants at the concentration of 0.1 mmol·L-1and 1 mmol·L-1. Compared with CK, the dry weight of cucumber shoots increased by 33.79% and 30.19%, and the dry weight of roots increased by 44.97% and 48.82%, the number of cucumber root tips increased by 41.8% and 49.9%, respectively; Exogenous myo-inositol at the concentration of 0.05 mmol·L-1and 0.1 mmol·L-1could promote the growth of cucumber. Compared with CK, the dry weight of cucumber shoots increased by 36.66% and 30.15%, roots dry weight increased by 69.82% and 51.78%, and the number of cucumber root tips increased by 149.0% and 96.7%, respectively.【】In brief, both the high-temperature extract and the enzymatic hydrolysate of rice straw could significantly promote the growth of cucumber, and the acetylcholine, L-carnitine and myo-inositol were detected by LCMS in the pyrolysis and enzymatic hydrolysate of rice straw, which were considered as the functional substances in rice straw.

rice straw; high-temperature extraction; enzymatic hydrolysis; LCMS; growth promotion

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.010

2020-09-20；

2020-12-17

國家自然科學(xué)基金（31972513）、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（CX(18)3059）、江蘇省重點研發(fā)計劃（現(xiàn)代農(nóng)業(yè)）（BE2018338）

唐思宇，E-mail：2018103144@njau.edu.cn。通信作者劉東陽，Tel：025-84396853；E-mail：liudongyang@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李云霞）