基于微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的HER2基因擴(kuò)增用于乳腺癌TNM分期的研究

黃 波，張藝超，林建山

(深圳市寶安人民醫(yī)院普外二區(qū)，廣東 深圳 518101)

乳腺癌是威脅女性健康的惡性腫瘤之一，每年乳腺癌新發(fā)100多萬例，死亡40多萬例[1]。乳腺癌類型較多，因而明確乳腺癌類型，制定合適的治療方案，準(zhǔn)確評(píng)估預(yù)后，才能取得最佳的治療效果[2]。有研究顯示，人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)作為多變量分析中的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，可判斷乳腺癌的惡性程度[3]。HER2的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)、乳腺癌患者HER2基因表達(dá)的規(guī)律及TNM分期等在臨床實(shí)踐中對(duì)于預(yù)測(cè)患者的預(yù)后、提高乳腺癌診治水平有著積極的意義[4]。目前，可通過免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)HER2蛋白的表達(dá)，通過熒光原位雜交方法(fluorescence in situ hybridization,FISH)檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增的水平[5]。然而現(xiàn)有的HER2檢測(cè)方法，結(jié)果判讀具有主觀性，也易受到取樣及處理方法的影響，且HER2存在基因融合、斷裂等現(xiàn)象，F(xiàn)ISH檢測(cè)結(jié)果存在假陰性的可能[6]。微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技術(shù)是一種新型的絕對(duì)定量PCR方法，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)相比，其具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確、檢測(cè)的線性范圍寬、特異度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，極具發(fā)展?jié)摿7]，但其結(jié)果的可靠性有待進(jìn)一步證實(shí)。因此，本研究選擇我院收治的乳腺癌患者的標(biāo)本進(jìn)行研究，分析ddPCR技術(shù)用于HER2基因擴(kuò)增的價(jià)值及在評(píng)估乳腺癌TNM分期中的應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

從我科乳腺癌標(biāo)本庫中選擇2015～2017年行手術(shù)治療的100例乳腺癌患者的標(biāo)本作為觀察組，其中TNMⅠ～Ⅱ期71例，Ⅲ～Ⅳ期29例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)檢查確診為乳腺癌；IHC 3+或FISH法檢測(cè)HER2陽性；年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝腎功能不全；合并其他腫瘤；嚴(yán)重精神病史；存在其他重大器官疾?。慌R床資料缺失。同期選擇80例乳腺增生患者的組織標(biāo)本作為對(duì)照組。2組患者的年齡、絕經(jīng)比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 患者臨床資料比較

1.2 方法

構(gòu)建HER2基因擴(kuò)增ddPCR方法：采用QX200 ddPCR系統(tǒng)檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增，將MixDNA樣品按16∶4的比例混合，制備反應(yīng)混合物。取20 μL反應(yīng)體系置于微滴發(fā)生器的樣品孔中，每孔加入70 μL微滴生成油，合上微滴生成儀，覆蓋墊圈墨盒，啟動(dòng)生成儀，形成20 000個(gè)納米級(jí)的油包水微滴。每孔取40 μL油包水微滴加入96孔板。鋁箔熱封膜密封，置于Bio-Rad C1000熱封膜儀上，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)常規(guī)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)。將96孔板放入QX200微滴檢測(cè)儀中，利用檢測(cè)儀自帶的控制分析軟件設(shè)置樣本孔條件，啟動(dòng)檢測(cè)儀，根據(jù)泊松分布原理獲得標(biāo)本起始分子的絕對(duì)拷貝數(shù)，將結(jié)果導(dǎo)出并保存。檢測(cè)HER2基因相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)，相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)(n)=目標(biāo)基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù)，當(dāng)n≤1.2時(shí)為陰性，當(dāng)n>1.2時(shí)為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HER2基因相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)檢測(cè)

觀察組患者HER2基因相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組中TNM Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者HER2基因相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)高于TNM Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HER2基因相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)與TNM分期呈正相關(guān)(r=0.632，P<0.05)。

圖1 HER2基因相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.2 ddPCR檢測(cè)分析乳腺癌患者TNM分期的價(jià)值

使用ddPCR技術(shù)檢測(cè)乳腺癌患者HER2基因分析TNM分期的敏感度和特異度均大于90%，且曲線下面積(areaundercurve,AUC)>0.95(圖2)，相關(guān)性分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明基于ddPCR技術(shù)的HER2基因相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)可作為評(píng)估乳腺癌患者TNM分期的參考依據(jù)。

圖2 ROC曲線圖

3 討論

2018年2月，國家癌癥中心發(fā)布了最新的全國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，乳腺癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤的首位，約占16.51%，乳腺癌的防控形勢(shì)非常嚴(yán)峻[8]。根據(jù)基因不同，可將乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B型(其中Luminal B型又細(xì)分為Luminal B HER2陰性型和Luminal B HER2陽性型)、HER2過表達(dá)型、三陰型[9]。不同類型乳腺癌治療方法也不同，Luminal A型乳腺癌以內(nèi)分泌治療為主；Luminal B型乳腺癌要考慮多種輔助治療相結(jié)合；三陰型乳腺癌尚無針對(duì)性治療方法，以化療為主；20%～30%的乳腺癌患者為Luminal B HER2陽性型，是各種分型中較為兇險(xiǎn)的一個(gè)亞型，相比其他類型乳腺癌其惡性程度更高，疾病進(jìn)展更快，更容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者的生命[10]。

HER2/neu基因是乳腺癌細(xì)胞中重要的表皮生長因子受體家族成員，也是目前乳腺癌治療的藥物靶點(diǎn)之一。有研究顯示，若乳腺癌患者HER2過表達(dá)，則其生存期極易縮短，導(dǎo)致不良結(jié)局[11]。現(xiàn)階段臨床應(yīng)用過程中參考《乳腺癌HER2檢測(cè)指南》，而該指南中推薦使用IHC與FISH和/或顯色原位雜交結(jié)合方案檢測(cè)HER2的表達(dá)，但均存在分析結(jié)果主觀性、檢測(cè)耗時(shí)長、操作繁瑣等缺點(diǎn)，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用存在一定的局限性[12-13]。

ddPCR技術(shù)是近年來臨床逐漸推廣應(yīng)用的新型檢測(cè)技術(shù)，可有效分析HER2基因拷貝數(shù)，定量分析HER2的DNA以及RNA水平[14]。ddPCR技術(shù)在使用過程中通過將反應(yīng)體系均分到大量反應(yīng)單元中，獨(dú)立進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)(熒光信號(hào)產(chǎn)生過程參考qPCR)，根據(jù)泊松分布和陽性比例計(jì)算核酸數(shù)量[15]。本研究采用ddPCR技術(shù)檢測(cè)乳腺癌患者的標(biāo)本，結(jié)果顯示，TNM Ⅲ～Ⅳ期的患者HER2基因相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)高于TNM Ⅰ～Ⅱ期的患者；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ddPCR技術(shù)檢測(cè)的HER2基因相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)與TNM分期呈正相關(guān)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ddPCR技術(shù)檢測(cè)乳腺癌患者HER2基因分析TNM分期的敏感度和特異度均大于90%，且AUC>0.95，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。ddPCR技術(shù)可對(duì)基因序列進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)，在檢測(cè)過程中無需采用標(biāo)準(zhǔn)品即可實(shí)現(xiàn)DNA的絕對(duì)定量；此外，ddPCR技術(shù)檢測(cè)HER2基因時(shí)，不依賴擴(kuò)增效率和Ct值，可有效避免PCR抑制劑的影響，對(duì)樣本容忍度較高。結(jié)合本研究進(jìn)一步分析認(rèn)為，ddPCR技術(shù)可有效分析HER2表達(dá)水平和拷貝數(shù)，通過精準(zhǔn)定量分析為乳腺癌分子分型提供數(shù)據(jù)支持，ddPCR計(jì)數(shù)可有效篩選出低豐度的基因表達(dá)并開展鑒定分析，對(duì)于乳腺癌患者病情的評(píng)估具有重要作用。

綜上所述，使用ddPCR技術(shù)檢測(cè)乳腺癌患者HER2基因相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)與乳腺癌TNM分期呈正相關(guān)，該方法預(yù)測(cè)TNM分期的敏感度和特異度均較高。但本研究并未詳細(xì)分析ddPCR技術(shù)檢測(cè)HER2基因相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)與乳腺癌患者預(yù)后質(zhì)量的關(guān)系，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。