褐飛虱中腸兩種氨肽酶N的鑒定及蛋白特性分析

林 莉, 余小強, 關(guān) 雄, 邵恩斯

(1.福建農(nóng)林大學, 國家菌草工程技術(shù)研究中心, 福州 350002; 2.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院動物科技學院, 福州 350007;3.福建農(nóng)林大學植物保護學院, 福州 350002; 4.華南師范大學生命科學學院, 廣州 510631)

褐飛虱Nilaparvatalugens是一種在水稻上危害性極大的半翅目(Hemiptera)刺吸式口器害蟲，同時，褐飛虱是多種水稻病毒的中間宿主，能夠傳播包括水稻齒矮病毒(rice rugged stunt virus, RRSV)及水稻草矮病毒(rice grassy stunt virus, RGSV)等多種病毒病害，對水稻生產(chǎn)造成嚴重的間接危害(Luetal., 2015)，這些都與褐飛虱消化系統(tǒng)中腸道內(nèi)的蛋白酶密切相關(guān)。褐飛虱腸道內(nèi)的蛋白酶種類眾多，氨肽酶N(aminopeptidase N, APN, EC 3.4.11.2)是其中重要的一類蛋白酶(Terraetal., 1996)。APN是M1外肽酶家族中的成員，該家族蛋白多含有一個鋅離子結(jié)合域HEXXHX18E和一個高度保守的GAMEN序列。研究顯示上述兩個保守功能域與APN酶活性密切相關(guān)(Luanetal., 2012)。APN主要以可溶性和膜結(jié)合蛋白的兩種形式存在于動植物體內(nèi)許多亞細胞器、細胞質(zhì)和膜成分中(Thieleetal., 1997)。在昆蟲體內(nèi)，APN分為膜結(jié)合蛋白和可溶蛋白兩類。其中膜結(jié)合APN主要存在中腸刷狀緣膜表面(Terraetal., 1996)，是一種通過糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)錨定附著在細胞膜上的糖蛋白(Knightetal., 1995)，并且優(yōu)先錨定在富含膽固醇的膜上(Zhuangetal., 2002)。在昆蟲體內(nèi)，外源蛋白進入消化道后首先被蛋白內(nèi)切酶水解成多種短肽，爾后羧肽酶及氨肽酶(包括APN)將這些短肽進一步水解成氨基酸(Wangetal., 2005)。昆蟲中腸APN還被報道是多種病原物的受體或結(jié)合位點。例如，鱗翅目和雙翅目昆蟲中腸APN被發(fā)現(xiàn)參與了蘇云金桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)Cry殺蟲毒素的毒理機制(Knightetal., 1994; Zhaoetal., 2017; Gómezetal., 2018; Guoetal., 2020)。在豌豆蚜Acyrthosiphonpisum等半翅目昆蟲體內(nèi)APN被發(fā)現(xiàn)是凝集素蛋白的受體(Angeluccietal., 2008; Fitchesetal., 2008)。

當前，多種昆蟲中腸APN已經(jīng)被鑒定并克隆(Cristofolettietal., 2003; Wangetal., 2005; Monteiroetal., 2014; Cantón and Bonning, 2019)。已鑒定出的昆蟲APN的分子量約60～200 kD(Sangadalaetal., 2001; Wangetal., 2005; Monteiroetal., 2014; Cantón and Bonning, 2019)。除了從昆蟲中腸提取APN之外，在大腸桿菌Escherichiacoli和動物細胞系中表達APN蛋白是獲得昆蟲中腸APN的重要途徑(Luoetal., 1999; Zhangetal., 2008)。相較于在大腸桿菌中表達的策略，Sf9及Sf21細胞真核表達體系更有利于制備完整功能活性的APN蛋白(Luoetal., 1999; Rangeletal., 2007; Aroonkesornetal., 2015; Linzetal., 2015)。鑒于中腸APN在昆蟲生理生化中的重要功能及其作為殺蟲毒素的受體的潛在可能，為了研究褐飛虱中腸外肽酶對其為害水稻植株的影響，并有針對性地開發(fā)對褐飛虱高效的殺蟲毒素，本研究以課題組在前期工作中鑒定的兩個褐飛虱中腸apn基因作為對象，驗證上述兩個APN蛋白在褐飛虱中腸中的表達，并通過果蠅DrosophilaS2細胞分別表達兩個NLAPN蛋白，對兩個NLAPN的酶活性及細胞膜結(jié)合功能進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 試蟲

褐飛虱蟲源由福建農(nóng)林大學福建省農(nóng)業(yè)植物病毒學研究所提供。幼蟲以新鮮水稻Oryzasativa為食，飼養(yǎng)在28℃和光周期14L∶10D條件下水培的水稻苗上。

1.2 氨肽酶N序列比對及系統(tǒng)進化分析

半翅目昆蟲唾液腺及腸道轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)下載自NCBI序列歸檔片段(sequence read archive, SRA)數(shù)據(jù)庫。包括褐飛虱唾液腺(SRR5149721)、褐飛虱腸道(SRR8189329)、灰飛虱Laodelphaxstriatellus唾液腺(SRR1617628)、灰飛虱腸道(SRR1617623)、豌豆蚜Acyrthosiphumpisim唾液腺(SRR7037541)、豌豆蚜腸道(SRR7037537)、褐翅椿象Halyomorphahalys唾液腺(SRX6717291，SRX6717292)及褐翅椿象腸道(SRX6717290)。經(jīng)質(zhì)量控制過濾后的原始數(shù)據(jù)利用Trinity Assembly(v2.8.5)在默認參數(shù)下進行組裝。組裝獲得的contig利用編寫的perl腳本去冗余后獲得Unigene序列。利用BLASTx(v2.7.0)軟件，分別針對NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(non-redundant, NR)及Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫比對獲得Unigene序列注釋信息。將獲得注釋信息的Unigene所編碼的蛋白提取出來獲得APN蛋白氨基酸序列。利用Bowtie軟件計算各轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄水平FPKM(fragments per kilo base per million mapped reads)值。利用RSEM(v1.3.1)(Li and Dewey, 2011)預測同一轉(zhuǎn)錄本在唾液腺及腸道中的相對表達量，并計算同一基因在中腸與唾液腺中的相對表達量(log2fold change, log2FC)以體現(xiàn)表達量差異。

利用MAFFT(v7.0)(Katoh and Standley, 2013)對褐飛虱、灰飛虱、豌豆蚜及褐翅椿象唾液腺及中腸轉(zhuǎn)錄組中鑒定出的APN蛋白序列比對。比對后的序列通過最大似然(maximum likelihood, ML)法進行系統(tǒng)進化樹分析。首先，通過ModelFinder(Kalyaanamoorthyetal., 2017)對系統(tǒng)進化樹模型參數(shù)及進化樹分支方案進行預測，爾后利用IQ-TREE(Nguyenetal., 2014)進化樹構(gòu)建軟件在10 000 ultrafast bootstraps(Minhetal., 2013)參數(shù)下構(gòu)建ML進化樹。將構(gòu)建好的進化樹上傳至在線進化樹注釋軟件Interactive Tree of Life(http:∥itol.embl.de)進行美化及標注。

1.3 NLAPN1和NLAPN4免疫定位分析

基于褐飛虱兩個中腸apn基因nlapn1(GenBank登錄號: MF741654.1)和nlapn4(GenBank登錄號: MF741657.1)序列，委托GenScript(南京)制備NLAPN1和NLAPN4多克隆抗體。褐飛虱4齡若蟲(雌雄隨機)中腸刷狀緣膜囊泡(brush border membrane vesicles, BBMVs)蛋白的制備參考文獻(Wolfersberger, 1993; Shaoetal., 2016)的方法。提取1 500頭4齡褐飛虱若蟲中腸，用玻璃勻漿器徹底研磨后與等體積的24 mmol/L MgCl2混合，冰上放置15 min，再次研磨使其徹底均質(zhì)化。在4℃ 2 500 g條件下離心15 min，收集上清。上清液在4 ℃ 30 000 g下離心30 min，棄上清。沉淀重懸于300 μL Lysis Buffer[20 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA(pH 8.0), 1 mmol/L MgSO4, 0.01% NaN3, 10%甘油, 2% CHAPS, 1 mmol/L PFSM, 1×Protease Inhibitor Cocktail, 羅氏, 美國]并存于-80℃?zhèn)溆?。褐飛虱中腸BBMVs樣品在10%的SDS-PAGE凝膠上電泳分離后，利用半干式轉(zhuǎn)膜儀(DYCP-40C，六一，北京)將凝膠上蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜用封閉液(PBS, pH 7.4, 5%脫脂奶粉, 0.01%吐溫20)于37℃封閉2 h。爾后用NLAPN1或NLAPN4多克隆抗體在室溫條件下孵育2 h，并用攜帶堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)標記的羊抗兔抗體(Sigma，美國)室溫孵育1.5 h。清洗后的PVDF膜用AP顯色試劑盒(Bio-Rad，美國)顯色觀察。

1.4 LC-ESI-MS/MS鑒定NLAPN1和NLAPN4

從1.3節(jié)中的SDS-PAGE凝膠中切除目的蛋白條帶，利用液相-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry, LC-ESI-MS/MS)進行序列與分子量的測定。相關(guān)測定委托諾禾生物有限公司(中國)完成。

1.5 NLAPN1和NLAPN4表達載體的構(gòu)建

基于褐飛虱兩個中腸apn基因nlapn1(GenBank登錄號: MF741654.1)和nlapn4(GenBank登錄號: MF741657.1)序列，委托生工生物有限公司(Sangon Biotech，上海)將nlapn1和nlapn4分別連接pUC18質(zhì)粒。設計5′端帶有FLAG標簽的nlapn1及nlapn4的引物(表1)分別克隆5′端帶有FLAG標簽序列且移除自身信號肽序列的兩個nlapn基因。同時，將引物NLAPN4-R替換為NLAPN4lackG-R克隆3′端不帶有GPI錨定信號肽序列的nlapn4lackG全長序列。將擴增的nlapns基因通過KpnⅠ和NotⅠ位點插入pMT/BiP/V5-His載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMT-nlapn1, pMT-nlapn4和pMT-nlapn4lackG。3個重組質(zhì)粒的3′端均帶有V5標簽序列，5′端帶有FLAG標簽，可用于后續(xù)利用標簽抗體檢測目的蛋白。上述克隆過程分別采用攜帶nlapn1和nlapn4的pUC18質(zhì)粒作為模板DNA。PCR反應體系(50 μL): 引物終濃度25 pmol/L, 高保真pfu DNA聚合酶(TaKaRa, 北京)5 U。PCR反應條件: 95℃ 2 min; 95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 2 min, 30個循環(huán); 72℃ 10 min。

表1 引物

1.6 NLAPN1和NLAPN4在果蠅S2細胞中表達和定位

果蠅S2細胞購于ThermoFisher中國公司。S2細胞在SFX-Insect(HyClone，美國)培養(yǎng)液中于28℃環(huán)境中培養(yǎng)。用TransIT-LT1轉(zhuǎn)染試劑(Mirus Bio，美國)將1.5節(jié)中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMT-nlapn1, pMT-nlapn4和pMT-nlapn4lackG轉(zhuǎn)染到3×106的S2細胞中，轉(zhuǎn)染步驟按試劑盒說明書執(zhí)行。轉(zhuǎn)染12 h后轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)染復合物至含有500 μmol/L CuSO4的新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h。將重懸后的S2細胞在2 000 g 4 ℃下離心3 min，收集含有分泌蛋白的胞外培養(yǎng)基。離心后的S2細胞沉淀清洗后用PBS重懸(135 mmol/L NaCl, 2 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 1.7 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)，并通過超聲波破碎儀(SCIENTZ-IID，新芝，寧波)超聲波處理(3×10 s, 3 min)。經(jīng)4℃ 12 000 g離心10 min。上清用0.45 μm的過濾膜(Millipore Sigma, 美國)過濾，作為細胞裂解物的可溶組分。沉淀清洗3次后重懸于PBS(1∶10, w/v)中，作為細胞裂解物的不溶組分。分別將上述轉(zhuǎn)染細胞的可溶組分、不可溶組分及胞外培養(yǎng)基于10%的SDS-PAGE凝膠分離后，利用半干式轉(zhuǎn)膜儀(DYCP-40C，六一，北京)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜用封閉液(PBS, pH7.4, 5%脫脂奶粉, 0.01%吐溫20)于37℃封閉2 h。爾后分別用鼠源抗V5標簽和FLAG標簽單克隆抗體(Sigma，美國)在室溫條件下孵育2 h，并用攜帶AP標記的羊抗兔抗體(Sigma，美國)室溫孵育1.5 h。清洗后的PVDF膜用AP顯色試劑盒(Bio-Rad, 美國)顯色觀察，鑒定NLAPN1及NLAPN4蛋白在各組分中的分布。

將轉(zhuǎn)染60 h后的S2細胞接種于蓋玻片上，28℃孵育過夜。貼壁于蓋玻片上的細胞用0.1 mol/L PBS(pH 7.4)清洗后于4%多聚甲醛溶液室溫反應30 min。再次清洗后室溫條件下在0.1% Triton X-100中反應15 min后在包含鼠源抗FLAG標簽或抗V5標簽單克隆抗體(Sigma，美國)的緩沖液(3% BSA, 0.01 mol/L PBS, pH 7.4)中孵育2 h，再次清洗后在含有異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)的兔抗鼠二抗(TransGen Biotech，北京)中室溫孵育2 h，用共聚焦顯微鏡(LSM5 Pascal, Zeiss)在激發(fā)光下進行檢測。同時，以轉(zhuǎn)染pMT/BiP/V5-His的S2細胞作為陰性對照，分析NLAPN1和NLAPN4在果蠅S2細胞中的定位。

1.7 NLAPN1和NLAPN4活性檢測

收集1.6節(jié)轉(zhuǎn)染后孵育72 h的S2細胞，用PBS清洗3次后在NP-40裂解緩沖液(1∶10, w/v)(Invitrogen，美國)中冰上孵育1 h。經(jīng)16 000 g 4℃條件下離心10 min，收集細胞裂解液，以未轉(zhuǎn)染的S2細胞裂解液作為陰性對照，分別添加底物L-亮氨酸對硝基苯胺(leucine-p-NA)、L-丙氨酸4-硝基苯胺鹽酸鹽(Ala-p-NA)、L-甲硫氨酸對硝基苯胺鹽酸鹽(Met-p-NA)和L-賴氨酸對硝基苯胺二氫溴酸鹽(Lys-p-NA)進行酶促反應，3次重復，利用酶標儀(Spark 10 mol/L, Tecan)在405 nm，26℃條件下檢測10 min(每10 s測定一次)。每分鐘水解1 μmol底物所需的樣品量定義為各樣品中單位酶活性(U)。

2 結(jié)果

2.1 NLAPN1和NLAPN4的系統(tǒng)進化

基于褐飛虱、灰飛虱、豌豆蚜及褐翅椿象中腸及唾液腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定出多個APN蛋白，并通過FPKM值的計算對這些APN蛋白在其來源昆蟲腸道與唾液腺中的轉(zhuǎn)錄水平進行了預測分析。結(jié)合系統(tǒng)進化分析與轉(zhuǎn)錄水平分析可以發(fā)現(xiàn)，上述半翅目昆蟲消化系統(tǒng)中的APNs蛋白在系統(tǒng)進化樹中被分成兩個分支。分支A中的APN在腸道中的轉(zhuǎn)錄水平均高于其在唾液腺中的轉(zhuǎn)錄水平。分支B中的多數(shù)APN在兩個組織中的轉(zhuǎn)錄水平分布則與分支A截然相反，即唾液腺中的轉(zhuǎn)錄水平高于腸道中的轉(zhuǎn)錄水平。NLAPN1及NLAPN4在該系統(tǒng)進化樹中與其他在腸道高表達的APN同屬于分支A(圖1)。

圖1 最大似然法構(gòu)建的基于氨基酸序列的4種半翅目昆蟲APN蛋白系統(tǒng)進化樹(10 000次重復)

2.2 褐飛虱中腸BBMV中NLAPN1和NLAPN4的定位

Western blot分析結(jié)果表明，分別以兔源NLAPN1及NLAPN4多克隆抗體作為一抗，均能夠與褐飛虱中腸BBMV在160, 90及50 kD位置鑒定出免疫顯色信號(圖2)。LC-ESI-MS/MS鑒定到160 kD的能夠與NLAPN1及NLAPN4氨基酸序列相匹配的肽段(結(jié)果未顯示)。結(jié)果證明NLAPN1及NLAPN4存在于褐飛虱中腸BBMV中。

圖2 褐飛虱4齡若蟲中腸刷狀緣膜囊泡中NLAPN1(A)與NLAPN4(B)的Western blot鑒定

2.3 重組NLAPN1和NLAPN4在果蠅S2細胞中的表達

Western blot檢測結(jié)果顯示，以FLAG標簽抗體作為一抗時在表達NLAPN1或NLAPN4蛋白S2細胞裂解物的細胞可溶組分及不可溶組分中均能夠觀察到130 kD(NLAPN1)或160 kD(NLAPN4)的條帶，在胞外培養(yǎng)基中上述條帶均未顯示(圖3: A)，但能夠檢測到極強的160 kD的不帶有C端GPI錨定信號肽的NLAPN4lackG條帶。以V5標簽抗體作為一抗時，在細胞可溶組分、不可溶組分和胞外培養(yǎng)基中均未檢測到NLAPN1和NLAPN4，但能夠在胞外培養(yǎng)基中檢測到NLAPN4lackG(圖3: B)。上述結(jié)果說明NLAPN1及NLAPN4均能夠表達并存在于S2細胞裂解物的胞內(nèi)或細胞不可溶組分中。免疫熒光定位結(jié)果也表明，以FLAG標簽抗體作為一抗，表達了NLAPN1或NLAPN4的S2細胞在細胞膜結(jié)構(gòu)位置均有明顯的綠色熒光(圖4)，表明NLAPN1和NLAPN4均位于S2細胞膜上；而以V5標簽抗體作為一抗時，未能在S2細胞中觀察到免疫熒光(圖4)。表達了NLAPN4lackG蛋白的S2細胞無論以FLAG標簽抗體還是V5標簽抗體作為一抗，均能夠在細胞質(zhì)中檢測到免疫熒光(圖4)。

圖3 褐飛虱NLAPN1和NLAPN4在果蠅S2細胞中的表達鑒定

圖4 褐飛虱NLAPN1和NLAPN4在果蠅S2細胞中的免疫熒光定位

2.4 NLAPN1和NLAPN4的氨肽酶活性

結(jié)果顯示,以L-丙氨酸4-硝基苯胺鹽酸鹽及L-賴氨酸對硝基苯胺二氫溴酸鹽作為底物時，表達了NLAPN1或NLAPN4的S2細胞裂解液中均能夠檢測到一定的酶活性，其中NLAPN4的酶活性高于NLAPN1(圖5)。以L-亮氨酸對硝基苯胺作為底物時，表達了NLAPN1的S2細胞裂解液顯示出極高的酶活性(>60 U/mg)，高于表達了NLAPN4的S2細胞裂解液(圖5)。以L-甲硫氨酸對硝基苯胺鹽酸鹽作為底物時，表達了NLAPN1與NLAPN4的S2細胞裂解液中均未能夠檢測出酶活性(圖5)。上述結(jié)果說明NLAPN1及NLAPN4對部分氨基酸位點能夠體現(xiàn)出氨肽酶活性。

圖5 以不同化合物作為底物時褐飛虱NLAPN1和NLAPN4的酶活性

3 討論

APN在昆蟲腸道、唾液腺等組織中均有表達，是昆蟲消化系統(tǒng)中重要的一類蛋白酶(Cravaetal., 2010; Ningshenetal., 2013)。在前期工作中我們已通過RNA測序的手段對褐飛虱的中腸轉(zhuǎn)錄組進行分析。結(jié)合已公布的褐飛虱基因組信息驗證了nlapn1與nlapn4基因在中腸中的轉(zhuǎn)錄。作為前期工作的延續(xù)，本研究繼續(xù)對NLAPN1及NLAPN4的功能進行分析與驗證。有研究表明昆蟲體內(nèi)的APN蛋白多存在于腸道內(nèi)(Terra and Ferreira, 1994; Terraetal., 1996)或唾液腺中表達(Huangetal., 2018)。本研究引入已公布的褐飛虱中腸及唾液腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合同為半翅目刺吸式口器的灰飛虱、褐翅椿象及豌豆蚜的唾液腺與腸道轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行消化系統(tǒng)APN遺傳進化分析，分析結(jié)果進一步從遺傳進化角度證明NLAPN1及NLAPN4屬于腸道APN(圖1)。對褐飛虱中腸BBMV的Western blot及LC-ESI-MS/MS分析結(jié)果亦從蛋白質(zhì)層面證明NLAPN1和NLAPN4在褐飛虱中腸中的表達(圖2)。昆蟲中腸BBMV中的APNs分子量多在60～200 kD之間(Sangadalaetal., 2001; Wangetal., 2005)。NLAPN1及NLAPN4在S2細胞內(nèi)表達后的片段分別約為130和160 kD(圖3)，符合昆蟲中腸BBMV中APN的分子量范圍。以上結(jié)果進一步驗證了兩個APN蛋白在褐飛虱中腸中的表達。

昆蟲中腸APN多屬于膜結(jié)合蛋白，依靠GPI錨定在上皮細胞膜上(Knightetal., 1995)。GPI錨定信號肽的預測結(jié)果顯示NLAPN1及NLAPN4的C端均存在一個GPI錨定信號序列(Shaoetal., 2018)。本研究對NLAPN1及NLAPN4的膜結(jié)合特征進行了生物學驗證。以融合蛋白N端的FLAG標簽抗體作為一抗對表達了NLAPN1或NLAPN4的果蠅S2細胞進行鑒定的結(jié)果顯示，NLAPN1和NLAPN4在S2細胞的不可溶組分及可溶組分中均能夠被鑒定到，但在胞外組分中卻不存在(圖3: A)。由于瞬時表達的NLAPN1及NLAPN4均以pMT/V5-His載體的BiP作為信號肽，不帶有兩個APN蛋白自身的信號肽序列。上述結(jié)果證明兩個APN能夠順利在S2細胞內(nèi)的核糖體表達并轉(zhuǎn)運至細胞膜表面。以融合蛋白C端的V5標簽抗體作為一抗時，NLAPN1及NLAPN4均無法在細胞可溶組分、不可溶組分及胞外組分中被檢測到(圖3: B)。由于GPI錨定蛋白在錨定到細胞膜上時會切割蛋白C端的GPI錨定信號肽。因此，切割C端GPI錨定信號肽的NLAPN1及NLAPN4丟失了C端的V5標簽，無法被V5標簽抗體所檢測到，間接證明了兩個褐飛虱中腸APN蛋白的GPI錨定特性。以FLAG標簽或V5標簽抗體對表達了NLAPN4lackG的S2細胞進行檢測的結(jié)果顯示，不帶有GPI錨定信號肽的NLAPN4lackG主要存在于胞外組分中，少量存在于胞內(nèi)組分(圖3)。由于NLAPN4lackG不帶有C端的GPI錨定信號肽，因此NLAPN4lackG無法定位在細胞膜上，且C端的V5標簽不會因為GPI錨定作用而丟失，進一步確認了NLAPN4是通過GPI錨定在細胞膜上的。共聚焦顯微鏡對NLAPN1及NLAPN4在S2細胞中的定位結(jié)果顯示NLAPN1及NLAPN4均主要分布于轉(zhuǎn)染后的細胞膜上，而NLAPN4lackG則僅能夠在細胞質(zhì)中被鑒定到(圖4)。該結(jié)果再次驗證了兩個APN蛋白的膜結(jié)合特性。由于細胞外組分體積較大，因此NLAPN4lackG的熒光信號未能在胞外組分中鑒定到(圖4)?；趯D(zhuǎn)染后的S2細胞組分的Western blot分析及共聚焦免疫熒光定位結(jié)果均證明NLAPN1及NLAPN4是通過GPI錨定在細胞膜上的膜結(jié)合蛋白。

APN是一類蛋白外肽酶，能從蛋白質(zhì)和多肽N端選擇性切除氨基酸殘基產(chǎn)生游離氨基酸，昆蟲中腸不同APN單體對蛋白及短肽N端殘基有著不同的酶活偏好性(Luetal., 2020)。丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、精氨酸等12種氨基酸殘基都屬于APN的偏好水解的殘基位點(Barrett and McDonald, 1982; Xu and Li, 2005)。酶活鑒定結(jié)果顯示，NLAPN1在leucine-p-NA作為底物時有較強的酶催化活性，NLAPN4在Ala-p-NA及Lys-p-NA做底物時均能檢測出酶催化活性，但在leucine-p-NA作為底物時幾乎沒有活性(圖5)。上述結(jié)果說明兩個褐飛虱中腸APN均具備氨肽酶活性，且NLAPN1偏好水解亮氨酸殘基位點。對兩個褐飛虱中腸APN酶活的鑒定與分析進一步驗證了兩個蛋白在褐飛虱中腸中的氨肽酶功能。鱗翅目昆蟲主要以植物葉片為食，而褐飛虱主要以水稻莖桿韌皮部汁液為食。一般認為，飛虱、葉蟬、蚜蟲等半翅目刺吸式口氣昆蟲取食植物韌皮部汁液中以糖為主，缺少蛋白質(zhì)與淀粉(Akman Gündüz and Douglas, 2009)。本研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱中腸中高表達的NLAPN1具有與鱗翅目昆蟲腸道中重要APN近似的酶活性，說明雖然取食主要成分不同，但不同昆蟲的消化系統(tǒng)中氨肽酶都是十分重要的一類消化蛋白酶。

在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目部分昆蟲中腸中APN被鑒定為Bt Cry殺蟲毒素的受體蛋白(Gómezetal., 2018; Guoetal., 2020)。本研究對兩個NLAPN的蛋白特性鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NLAPN1具有與鱗翅目昆蟲腸道Cry毒素受體APN近似的分子量大小，且同樣具備亮氨酸位點外肽酶催化活性。同時NLAPN1也具備GPI錨定膜結(jié)合蛋白的特性。因此，NLAPN1具有成為Bt Cry毒素結(jié)合位點誘發(fā)Cry毒素毒性作用的可能性。兩個中腸上皮細胞膜上的GPI錨定APN的鑒定能夠為深入研究褐飛虱消化系統(tǒng)生理生化特性，褐飛虱與水稻之間的關(guān)系提供依據(jù)，為后續(xù)開發(fā)對褐飛虱高效的新型毒素蛋白提供幫助。