亞致死劑量吡蟲啉脅迫對意大利蜜蜂工蜂嗅覺學習行為的影響及其腦部轉(zhuǎn)錄組分析

候夢賞, 邱園妹, 趙必安, 蔚添添, 梁立強, 蘇松坤, 李志國

(福建農(nóng)林大學動物科學學院(蜂學學院), 福州 350002)

隨著新煙堿類農(nóng)藥的大范圍使用，蜜蜂的健康與生存受到了巨大的威脅(van der Sluijsetal., 2013)。新煙堿類農(nóng)藥是典型的系統(tǒng)性神經(jīng)毒性農(nóng)藥，主要作用于昆蟲突觸后膜的煙堿型乙酰膽堿受體，刺激神經(jīng)信號傳導，促使神經(jīng)元亢奮，導致昆蟲死亡(Belzuncesetal., 2012)。蜜蜂作為新煙堿類農(nóng)藥的非靶標昆蟲，在出巢采集過程中會經(jīng)常遭受低劑量農(nóng)藥的脅迫，導致蜜蜂處于一種亞致死脅迫狀態(tài)，損害蜜蜂的嗅覺學習記憶行為、歸巢行為和舞蹈行為(Gonalons and Farina, 2015)等，還可以與其他致病因子協(xié)同作用進而影響蜜蜂的健康(Pettisetal., 2015)。

前人研究表明，吡蟲啉對單頭成年意大利蜜蜂Apismelliferaligustica24 h急性致死中量LD50為7.8～118.74 ng(Laurinoetal., 2013; Lietal., 2017)，而從新煙堿類農(nóng)藥的環(huán)境殘留及蜜蜂的采蜜量分析，大部分農(nóng)藥殘留劑量并不會造成蜜蜂急性致死，而會對蜜蜂造成亞致死影響，因此研究農(nóng)藥對蜜蜂的亞致死效應更為重要。蜜蜂的腦部大約有100萬個神經(jīng)細胞，支撐著蜜蜂的學習記憶行為(Srinivasan, 2009)，蜜蜂腦部含有大量易與吡蟲啉結(jié)合的煙堿型乙酰膽堿受體，吡蟲啉脅迫蜜蜂后阻斷膽堿能神經(jīng)元和章魚胺能信號傳遞(Nauenetal., 2001)，產(chǎn)生大量的活性氮與活性氧，與相對應的生物大分子相互作用，影響線粒體呼吸鏈，導致神經(jīng)元供能不足，降低氧化應激反應，損害蜜蜂的學習記憶行為(Farooqui, 2013)。雖然關(guān)于不同劑量、不同類型殺蟲劑脅迫對意大利蜜蜂學習記憶行為的研究已有諸多報道，然而關(guān)于吡蟲啉脅迫影響蜜蜂學習記憶行為的腦部基因表達變化模式等分子機制報道尚少。

Karahan等(2015)通過一次飼喂單頭意大利蜜蜂含7.2 ng吡蟲啉的蔗糖溶液后，發(fā)現(xiàn)該劑量吡蟲啉對蜜蜂采集行為產(chǎn)生亞致死影響。本研究通過一次飼喂單頭意大利蜜蜂含4 ng吡蟲啉的蔗糖溶液，經(jīng)過3次伸吻反應(proboscis extension response, PER)行為實驗后，探究亞致死劑量吡蟲啉脅迫對意大利蜜蜂工蜂學習行為的影響及對蜜蜂腦部轉(zhuǎn)錄組分析，探究吡蟲啉脅迫影響蜜蜂學習行為的分子機制，分析比較對照組與吡蟲啉脅迫組蜜蜂的聯(lián)想性嗅覺學習行為差異，進一步比較這兩組蜜蜂腦部轉(zhuǎn)錄組差異表達情況，分析影響蜜蜂學習行為的相關(guān)基因表達情況及其調(diào)控通路，以期為后續(xù)相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蜜蜂的準備

意大利蜜蜂取自福建農(nóng)林大學動物科學學院(蜂學學院)實驗蜂場。從3個蜂群中取3張老熟意大利蜜蜂子脾，裝入限王產(chǎn)卵框中，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度34.5℃，相對濕度70%)，每天收集3張子脾的剛出房意大利蜜蜂(1日齡成蜂)，使用熒光筆標記后放入蜂群中飼養(yǎng)。從蜂群中抓取標記的18日齡意大利蜜蜂成年工蜂放入玻璃小瓶中并置于冰盒里冷凍麻痹，然后使用特制的固定裝置固定意大利蜜蜂，使頭部留在管外，保證意大利蜜蜂吻部可以自由伸出，將固定好的意大利蜜蜂置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中(溫度30℃，相對濕度70%)用于接受亞致死劑量吡蟲啉處理。

1.2 亞致死劑量吡蟲啉處理意大利蜜蜂成年工蜂

吡蟲啉純品(Sigma)0.01 g溶于50 mL丙酮中，制成200 ng/μL的吡蟲啉母液，使用50%的蔗糖溶液稀釋吡蟲啉母液到2 ng/μL，處理組意大利蜜蜂飼喂含2 ng/μL吡蟲啉的50%蔗糖溶液2 μL，對照組意大利蜜蜂飼喂含對應劑量丙酮的50%蔗糖溶液2 μL。實驗中，使用移液槍飼喂意大利蜜蜂，飼喂后置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中(溫度30℃，相對濕度70%)2 h。

1.3 PER行為實驗

1.2節(jié)處理2 h后的意大利蜜蜂成年工蜂置于實驗臺上，選擇對50%蔗糖溶液觸碰觸角有伸吻反應的意大利蜜蜂工蜂作為實驗對象，參考Bitterman等(1983)和Sandoz等(1995)的氣味聯(lián)想性學習過程。每頭蜜蜂重復學習3次，每次學習行為間隔10 min。記錄在前2 s只給予檸檬氣味時蜜蜂伸吻狀況。對照組與處理組每次各測試50頭意大利蜜蜂成年工蜂，實驗重復3次。在3次學習訓練完成后，液氮凍斃，收取蜜蜂頭部儲存在-80℃冰箱，用于后續(xù)實驗。

1.4 cDNA文庫構(gòu)建和測序

解剖1.3節(jié)處理組和對照組蜜蜂成年工蜂腦部，對照組與處理組各收集3個樣本，每個樣本20頭蜜蜂腦部。使用TRIZOL法提取樣本總RNA，并利用NanoDrop2000核酸濃度測定儀測定RNA的質(zhì)量和濃度。樣本檢測合格后，mRNA為模板，在M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶反應體系中合成cDNA的第1鏈，隨后用RNaseH降解RNA鏈，在DNA polymerase I 反應體系下合成cDNA第2條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復、加A尾及連接測序接頭，用AMPure XP beads篩選純化PCR產(chǎn)物，最終獲得cDNA文庫。使用Qubit2.0進行初步定量，隨后使用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測，以確保文庫質(zhì)量。測序工作由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，使用IlluminaHiSeqTM2500測序平臺。

1.5 測序數(shù)據(jù)分析

得到1.4節(jié)測序原始數(shù)據(jù)后，利用Illumina HiSeq 2000分析數(shù)據(jù)，去除帶接頭的reads；去除無法確定堿基信息的reads；去除低質(zhì)量reads。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾、測序錯誤率檢查、GC含量分布檢查，通過測序數(shù)值Phred(Qphred)對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，獲得后續(xù)分析使用的有效讀段(clean reads)，選用HISAT軟件將過濾后的有效讀段映射到意大利蜜蜂參考基因組上進行基因組定位分析。通過featureCounts(v1.5.0-p3)計算映射到每個基因上的clean reads數(shù)目，根據(jù)FPKM(fragments per kilobase million)計算基因表達量，將數(shù)據(jù)進行歸一化處理。使用DESeq2(R package, version 1.16.1)軟件分析對照組和處理組樣本的差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)，在GO富集數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上，利用clusterProfiler R package軟件對差異表達基因進行注釋、功能富集分析和通路富集分析。

1.6 熒光定量PCR驗證

為了進一步驗證RNA測序所得基因表達變化趨勢的準確性，隨機選擇6個DEGs，包括防御素1基因Def1、葡萄糖脫氫酶基因LOC410734、酯酶A2基因LOC406105、葡萄糖氧化酶基因LOC406081、酸性磷酸酶基因Acph-1和氣味受體基因Or10進行熒光定量PCR驗證，Actin為內(nèi)參基因(Villar and Grozinger, 2017)，引物序列見表1。提取1.3節(jié)收集蜜蜂腦部總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用TaKaRa公司的SYBR? Premix Ex TaqTMII(TliRNaseH Plus)試劑盒進行熒光定量PCR反應。反應體系(10 μL): SYBR Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)(2×)5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 3.2 μL。每個基因做3個樣本重復和3個技術(shù)重復。反應條件: 95℃30 s; 95℃5 s, 60℃30 s, 40個循環(huán); 4℃保存。

表1 引物信息

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS軟件的χ2檢驗分析吡蟲啉脅迫對意大利蜜蜂工蜂嗅覺學習行為的影響；用DESeq2分析差異基因的表達，并使用校正后的P值(padj)分析轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果；采用比較CT值法計算目的基因的相對表達量(目的基因表達量=2-ΔΔCT)，采用獨立樣本T檢驗對處理組和對照組意大利蜜蜂的基因表達進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 吡蟲啉脅迫對意大利蜜蜂學習行為的影響

如圖1所示，對148頭4 ng吡蟲啉處理的(吡蟲啉處理組)意大利蜜蜂和154頭丙酮處理的(對照組)意大利蜜蜂成年工蜂進行PER行為實驗，在第一次嗅覺學習過程中，兩組意大利蜜蜂均未對氣味表現(xiàn)伸吻行為。對照組意大利蜜蜂在第2次和第3次的嗅覺學習過程中，伸吻反應率分別達到60%和62%，處理組意大利蜜蜂伸吻反應率分別達到19%和41%，兩組意大利蜜蜂的學習能力有顯著的差異(P<0.05, χ2檢驗)，4 ng吡蟲啉處理后意大利蜜蜂成年工蜂的嗅覺學習能力顯著下降。

圖1 伸吻反應檢測4 ng吡蟲啉對意大利蜜蜂成年工蜂學習行為影響

2.2 意大利蜜蜂工蜂腦部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控與評估

構(gòu)建處理組與對照組意大利蜜蜂工蜂腦部轉(zhuǎn)錄組文庫，轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析如表2所示，構(gòu)建的6個文庫(處理組與對照組各3個)中獲得的原始數(shù)據(jù)庫范圍為2.42×107～3.21×107reads，數(shù)據(jù)清除后，有效數(shù)據(jù)庫范圍縮小為2.38×107～3.16×107reads，占原始數(shù)據(jù)的98.4%以上，文庫中低質(zhì)量讀段所占比率很低，符合檢測標準。結(jié)果表明6個文庫中Q20比例均在96.81%以上，Q30比例均在91.51%以上，測序數(shù)據(jù)良好，可以用于后續(xù)分析。測序原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫，獲取號為SRR13425963-SRR13425968。

2.3 意大利蜜蜂工蜂腦部轉(zhuǎn)錄組差異表達基因功能注釋

利用HISAT軟件將過濾后的測序序列進行基因組定位分析，將clean reads 映射到意大利蜜蜂參考基因組上，從基因表達分析得出，對照組意大利蜜蜂腦部共有9 478個基因表達，吡蟲啉處理組意大利蜜蜂腦部共有9 469個基因表達，在兩組意蜂中共同表達的基因有9 103個。差異表達基因分析表明，吡蟲啉處理組與對照組相比，共有123個DEGs(padj<0.05)，其中有82個下調(diào)DEGs和41個上調(diào)DEGs。NCBI功能注釋結(jié)果如圖2所示，吡蟲啉脅迫意大利蜜蜂之后主要影響意大利蜜蜂的免疫、解毒、抗氧化、氣味結(jié)合蛋白和神經(jīng)信號傳導蛋白等相關(guān)基因的表達。

GO聚類分析表明，差異表達基因功能主要集中在分子功能、細胞組分和生物學進程(圖3: A, B)。在分子功能大類中下調(diào)的DEGs主要富集在酶活性及離子結(jié)合條目，包含S-腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶活性(S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase activity)、磷酸酶活性(phosphatase activity)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)、DNA結(jié)合(DNA binding)、蛋白質(zhì)異二聚化活性(protein heterodimerization activity)、酸性磷酸酶活性(acid phosphatase activity)、輔酶結(jié)合(coenzyme binding)、輔因子結(jié)合(cofactor binding)、作用于供體的CH-OH功能團的氧化還原酶活性(oxidoreductase activity, acting on CH-OH group of donors)、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合(flavin adenine dinucleotide binding)等功能條目；上調(diào)的DEGs主要富集在受體活性及分子結(jié)合條目，包括跨膜受體活性(transmembrane receptor activity)、分子傳感器活性(molecular transducer activity)、核苷結(jié)合(nucleoside binding)、嘌呤核苷結(jié)合(purine nucleoside binding)、GTP結(jié)合(GTP binding)、核糖核苷結(jié)合(ribonucleoside binding)、嘌呤核糖核苷結(jié)合(purine ribonucleoside binding)、脒基核苷酸結(jié)合(guanyl ribonucleotide binding)、鳥苷酸結(jié)合(guanyl nucleotide binding)等功能條目。在細胞組分大類中下調(diào)的DEGs主要富集在細胞器部分(organelle part)、細胞質(zhì)部分(cytoplasmic part)、大分子復合物(macromolecular complex)、催化絡合物(catalytic complex)、轉(zhuǎn)移酶復合體(transferase complex)、染色體部分(chromosomal part)等功能條目；上調(diào)的DEGs主要富集在大分子復合物(macromolecular complex)、細胞質(zhì)部分(cytoplasmic part)、蛋白質(zhì)復合物(protein complex)等功能條目。在生物學進程大類中下調(diào)的DEGs主要富集在甲基化(methylation)、蛋白質(zhì)定位到細胞器(protein localization to organelle)、蛋白質(zhì)靶向(protein targeting)、染色質(zhì)組織(chromatin organization)、單生物代謝過程(single-organism metabolic process)、DNA構(gòu)象變化(DNA conformation change)、DNA包裝(DNA packaging)、氧化還原過程(oxidation-reduction process)等功能條目；上調(diào)的DEGs主要富集在應激反應(response to stress)、細胞對DNA損傷的反應(cellular response to DNA damage stimulus)、DNA修復(DNA repair)、多細胞生物過程(multicellular organismal process)、神經(jīng)系統(tǒng)過程(neurological system process)、對化學刺激的感知(sensory perception of chemical stimulus)、感官知覺(sensory perception)、嗅覺感知(sensory perception of smell)等功能條目。

KEGG富集分析如圖4所示，下調(diào)的DEGs主要富集在細胞器和代謝通路，包括核糖體(ribosome)，碳代謝(carbon metabolism)，代謝通路(metabolic pathways)，溶酶體(lysosome)，Toll 和Imd信號通路(Toll and Imd signaling pathway)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(glycine, serine and threonine metabolism)，賴氨酸降解(lysine degradation)，光信號傳導-果蠅(phototransduction-fly)，鞘脂代謝(sphingolipid metabolism)，色氨酸代謝(tryptophan metabolism)，磷酸戊糖通路(pentose phosphate pathway)等途徑；上調(diào)的DEGs未富集到相關(guān)KEGG代謝通路。

圖4 4 ng吡蟲啉脅迫后意大利蜜蜂成年工蜂腦部下調(diào)差異表達基因(DEGs)KEGG富集散點圖

2.4 差異表達基因的熒光定量PCR驗證

根據(jù)高通量測序數(shù)據(jù)FPKM值，挑選6個與吡蟲啉脅迫相關(guān)的差異表達基因(圖5: A)，通過熒光定量PCR驗證測序數(shù)據(jù)的準確性，如圖5(B)所示一次性飼喂意大利蜜蜂4 ng吡蟲啉蔗糖溶液后，意大利蜜蜂腦部Def1,LOC410734,LOC406105,LOC406081和Acph-1的表達均顯著下調(diào)(P<0.05)，Or10顯著上調(diào)表達(P<0.05)，與測序數(shù)據(jù)FPKM值變化趨勢(圖5: A)相同，表明熒光定量PCR結(jié)果與測序結(jié)果一致，測序結(jié)果準確。

圖5 4 ng吡蟲啉脅迫后意大利蜜蜂成年工蜂腦部差異表達基因(DEGs)RNA-Seq測序數(shù)據(jù)(A)和熒光定量PCR驗證(B)

3 討論

本研究采用等量一次性飼喂單頭意大利蜜蜂方式，減少因吡蟲啉攝入量不同引起的誤差，采用蜂群飼養(yǎng)蜜蜂方式，避免因籠養(yǎng)造成蜜蜂之間的交哺飼喂及蜜蜂不能排泄引起的應激反應，使實驗結(jié)果更加真實、可靠。實驗結(jié)果顯示一次性飼喂意大利蜜蜂18日齡成年工蜂含4 ng吡蟲啉的蔗糖溶液顯著降低意大利蜜蜂工蜂的嗅覺學習能力(圖1)。Decourtye等(2004)研究表明意大利蜜蜂經(jīng)口飼喂12 ng吡蟲啉顯著影響意大利蜜蜂的條件反射及記憶能力，降低意大利蜜蜂的學習能力；Erica和 Nieh(2015)研究表明連續(xù)飼喂意大利蜜蜂4 d含吡蟲啉0.02 ng/μL的蔗糖溶液顯著降低意大利蜜蜂的厭惡型學習行為及短期記憶能力；蔚添添等(2017)研究表明連續(xù)飼喂意大利蜜蜂9 d含吡蟲啉0.01 ng/μL的蔗糖溶液顯著降低意大利蜜蜂的嗅覺學習能力；Li等(2019)研究表明連續(xù)飼喂意大利蜜蜂11 d含吡蟲啉0.02 ng/μL的蔗糖溶液顯著降低意大利蜜蜂的嗅覺聯(lián)想性學習行為；Tan等(2015)發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂飼喂0.1 ng吡蟲啉后，中華蜜蜂的嗅覺學習行為顯著降低。以上研究結(jié)果均表明蜜蜂經(jīng)口飼喂一定劑量的吡蟲啉蔗糖溶液后，其嗅覺學習行為顯著降低。

本研究高通量測序結(jié)果顯示，一次性飼喂意大利蜜蜂成年工蜂含4 ng吡蟲啉的50%蔗糖溶液后，處理組意大利蜜蜂腦部免疫及解毒基因如Def1，LOC410734，LOC406105，LOC406081和Acph-1等顯著下調(diào)(圖5)。Def1作為蜜蜂血淋巴中重要的抗菌肽，在防御革蘭氏陽性細菌入侵時具有重要功效，是蜜蜂免疫系統(tǒng)中重要的防御性抗菌肽(Richardetal., 2012)。LOC410734是昆蟲體內(nèi)重要的氧化還原酶，參與昆蟲的細胞免疫過程,在殺死病原菌的包膜反應中發(fā)揮著重要的作用(Cox-Foster and Stehr, 1994); LOC406105與昆蟲抗藥性相關(guān)，在抵抗農(nóng)藥脅迫時有重要作用(Wirthetal., 1990)，蜜蜂通過氧化過程對農(nóng)藥等外源性物質(zhì)進行解毒反應(James and Xu, 2012)。LOC406081將昆蟲體內(nèi)的葡萄糖氧化，為機體提供能量，進行氧化反應，促進機體的解毒，氧化產(chǎn)生H2O2，具有抗菌功能(Bucekovaetal., 2014)。Acph-1是一種非專一性的磷酸單酯水解酶，是有機體代謝過程中重要的調(diào)控酶，參與生物體的解毒反應、代謝調(diào)節(jié)、能量轉(zhuǎn)化及信號傳導等生物學功能(Strivastava and Guptam, 1986)。熒光定量PCR驗證結(jié)果表明, 4 ng吡蟲啉脅迫意大利蜜蜂成年工蜂后，腦部Def1,LOC410734,LOC406105,LOC406081和Acph-1表達量均顯著下調(diào)，與測序數(shù)據(jù)結(jié)果一致，揭示了急性亞致死劑量吡蟲啉脅迫意大利蜜蜂成年工蜂后，一方面影響意大利蜜蜂工蜂腦部神經(jīng)信號傳導，進而影響工蜂的嗅覺學習行為，另一方面影響意大利蜜蜂腦部免疫解毒相關(guān)基因的表達。研究報道蜜蜂大腦與免疫系統(tǒng)相互作用是誘導蜜蜂個體免疫應答反應的重要機制(Hart, 1990; Alaux, 2012)。亞致死劑量吡蟲啉脅迫導致意大利蜜蜂學習行為的受損與蜜蜂腦部免疫解毒相關(guān)基因之間的交互關(guān)系仍需進一步探究。

GO分析顯示，意大利蜜蜂成年工蜂被吡蟲啉脅迫后，其腦部的分子功能、細胞組分和生物學進程相關(guān)基因的表達量與對照組間存在較大差異，下調(diào)基因主要富集在酶活性、氧化還原過程(圖3)。研究表明農(nóng)藥等外源性物質(zhì)影響昆蟲的免疫應答機制和解毒反應(James and Xu, 2012)，與對照組相比，吡蟲啉處理組意大利蜜蜂腦部調(diào)控氧化還原反應過程相關(guān)基因表達量顯著下調(diào)，產(chǎn)生氧化型自由基。James和Xu(2012)研究報道在接觸新煙堿類殺蟲劑的蜜蜂體內(nèi)觀察到過量氧化型自由基的產(chǎn)生，并可以增強蜜蜂的氧化應激反應。吡蟲啉還會影響蜜蜂頭部和胸部線粒體的正常呼吸，使ATP大量消耗，導致蜜蜂缺氧死亡(Nicodemoetal., 2014)。對蜜蜂基因組分析發(fā)現(xiàn)蜜蜂基因組中含有大量的氣味受體結(jié)合蛋白(Honey Bee Genome Sequencing Consortium, 2006)，在果蠅的相關(guān)研究中已經(jīng)證實氣味結(jié)合蛋白基因在嗅覺感受器中表達，對維持昆蟲的嗅覺功能具有重要作用(Galindo and Smith, 2001)。Li等(2019)研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)飼喂意大利蜜蜂11 d含0.02 ng/mL的吡蟲啉蔗糖溶液后，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明影響意大利蜜蜂的氧化還原過程、氣味結(jié)合蛋白受體活性、神經(jīng)信號傳導過程。與本研究結(jié)果相似，吡蟲啉脅迫會影響蜜蜂的免疫解毒系統(tǒng)，但是，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)一次性飼喂意大利蜜蜂含4 ng吡蟲啉的蔗糖溶液后，氣味結(jié)合蛋白受體活性顯著上調(diào)，神經(jīng)信號傳導過程增強(圖3: A)。由此可見，意大利蜜蜂接觸吡蟲啉的劑量高低及時間長短會對意大利蜜蜂造成不同的生理影響，短期脅迫會提高受體活性、嗅覺感覺過程及神經(jīng)信號傳導，而長期脅迫會損害蜜蜂的嗅覺反應及神經(jīng)系統(tǒng)過程。

KEGG分析結(jié)果表明下調(diào)差異表達基因主要注釋在代謝途徑、細胞器及Toll和Imd信號通路，上調(diào)差異表達基因未富集在KEGG代謝通路(圖4)。生物代謝過程是調(diào)節(jié)蜜蜂生理和行為表現(xiàn)的重要途徑，本研究結(jié)果表明一次飼喂意大利蜜蜂成年工蜂含4 ng吡蟲啉的蔗糖溶液影響其生理代謝，如糖酵解、賴氨酸降解、鞘脂代謝、色氨酸代謝及磷酸戊糖等途徑。Christen等(2018)研究表明一定劑量吡蟲啉脅迫后影響意大利蜜蜂的糖酵解及脂質(zhì)代謝相關(guān)生理功能。本研究有相似結(jié)果，差異表達基因LOC410734與LOC406081注釋到糖酵解代謝通路并顯著下調(diào)表達。Toll通路和Imd通路是蜜蜂體液免疫的組成部分，是蜜蜂抵御外來致病因子的重要生理途徑，激活Toll通路和Imd通路誘導抗菌肽大量產(chǎn)生，維持蜜蜂正常的生理反應。Gao等(2020)研究表明吡蟲啉脅迫后影響蜜蜂的免疫應答，抑制抗菌肽的產(chǎn)生，影響Toll通路和Imd通路的表達。本研究結(jié)果表明4 ng吡蟲啉脅迫后意大利蜜蜂成年工蜂腦部抗菌肽基因Def1顯著下調(diào)(圖5)，Toll通路和Imd通路基因下調(diào)表達(圖5)。Li等(2019)轉(zhuǎn)錄組測序研究表明連續(xù)飼喂意大利蜜蜂11 d含吡蟲啉0.02 ng/μL的蔗糖溶液，慢性亞致死劑量吡蟲啉脅迫會影響蜜蜂的嗅覺敏感性，降低氣味結(jié)合蛋白活性，抑制蜜蜂的條件反射，影響蜜蜂的嗅覺學習行為。本研究結(jié)果表明急性亞致死劑量吡蟲啉脅迫意大利蜜蜂會提高氣味結(jié)合蛋白受體活性、神經(jīng)信號傳導過程，但是未能造成神經(jīng)傳導通路的變化。吡蟲啉影響意大利蜜蜂學習行為的分子機制是一個復雜的過程，是蜜蜂免疫、解毒、嗅覺、神經(jīng)信號傳導等通路共同作用的結(jié)果，蜜蜂的免疫解毒系統(tǒng)與蜜蜂的學習行為之間的關(guān)系需要進一步探究。

綜上所述，亞致死劑量吡蟲啉脅迫意大利蜜蜂成年工蜂顯著降低意大利蜜蜂的嗅覺學習能力，影響意大利蜜蜂腦部的免疫解毒基因表達，氧化還原過程及生物代謝過程，短時脅迫會刺激意大利蜜蜂的嗅覺感覺過程及神經(jīng)信號傳導過程。