殼聚糖氧化石墨烯負(fù)載冬凌草甲素對(duì)A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響

謝譚芳 朱小勇 黃天衍

中圖分類號(hào) R285.5;R943 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）13-1589-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.13.09

摘 要 目的：研究殼聚糖氧化石墨烯載體（CS-GO）負(fù)載冬凌草甲素（CS-GO-oridonin）對(duì)人肺癌細(xì)胞A549增殖及凋亡的影響。方法：以A549細(xì)胞為對(duì)象，采用CCK-8法檢測(cè)經(jīng)不同質(zhì)量濃度的CS-GO（3、6、12、24、48 μg/mL）和負(fù)載了等質(zhì)量冬凌草甲素的CS-GO-oridonin（3、6、12、24、48 μg/mL，以冬凌草甲素質(zhì)量計(jì)，下同）作用后的細(xì)胞存活率，并計(jì)算CS-GO-oridonin的半數(shù)抑制濃度（IC50）;采用顯微鏡觀察CS-GO和CS-GO-oridonin（均為32 μg/mL）作用2、4、10、24 h后的細(xì)胞形態(tài)，并采用熒光標(biāo)記法觀察細(xì)胞對(duì)CS-GO、冬凌草甲素、CS-GO-oridonin（均為32 μg/mL）的攝取情況;采用流式細(xì)胞術(shù)觀察不同質(zhì)量濃度CS-GO（16、32、64 μg/mL）和CS-GO-oridonin（16、32、64 μg/mL）作用后細(xì)胞的凋亡情況及細(xì)胞中活性氧（ROS）的含量，采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中抗凋亡相關(guān)蛋白[髓樣細(xì)胞白血病1（Mcl-1）、Bax、Bak]蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：經(jīng)不同質(zhì)量濃度CS-GO作用后，細(xì)胞的存活率仍不低于90%;經(jīng)不同質(zhì)量濃度CS-GO-oridonin作用后，細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)，且顯著低于相同質(zhì)量濃度的CS-GO組（P<0.01）;CS-GO-oridonin的IC50為32.61 μg/mL。經(jīng)CS-GO作用后，細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯改變;經(jīng)CS-GO-oridonin作用后，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、成團(tuán)脫落、懸浮物增多等現(xiàn)象;當(dāng)細(xì)胞攝取冬凌草甲素和CS-GO-oridonin后，其熒光均較攝取CS-GO的細(xì)胞有所增強(qiáng)。與空白組比較，CS-GO 16、32、64 μg/mL組細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞中ROS含量、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平均無(wú)顯著變化（P>0.05）;而CS-GO-oridonin 16、32、64 μg/mL組細(xì)胞的凋亡率、細(xì)胞中ROS含量和Bax、Bak蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，Mcl-1蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，且上述指標(biāo)水平均顯著高于或低于同質(zhì)量濃度CS-GO組（P<0.05）。結(jié)論：CS-GO不會(huì)影響A549細(xì)胞的增殖及凋亡;CS-GO- oridonin對(duì)細(xì)胞有明顯的抑制和促凋亡作用，這種作用可能與增加細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生、調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 殼聚糖氧化石墨烯載體;冬凌草甲素;A549細(xì)胞;增殖;凋亡

Effects of Oridonin-loaded Chitosan Graphene Oxide on the Proliferation and Apoptosis of A549 Cells

XIE Tanfang，ZHU Xiaoyong，HUANG Tianyan（School of Pharmacy， Guangxi University of TCM/Key Laboratory of Common Technology of Traditional Chinese Medicine Preparation in Universities of Guangxi/Modern Chinese Medicine Preparation Engineering Technology Research Center， Nanning 530022， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effects of chitosan graphene oxide carrier （CS-GO） loaded with oridonin （CS-GO- oridonin） on the proliferation and apoptosis of human lung cancer A549 cells. METHODS： Taking A549 cells as objects， the survival rate of cells were detected by CCK-8 method after treated with different concentrations of CS-GO（3， 6， 12， 24， 48? ? ? ? ?μg/mL） and CS-GO-oridonin loaded with same mass of oridonin （3， 6， 12， 24， 48 μg/mL， by the weight of oridonin， the same below）. IC50 of CS-GO-oridonin was calculated. The cell morphology were observed by microscope after treated with CS-GO and CS-GO-oridonin （both 32 μg/mL） for 2， 4， 10， 24 h. The uptake of CS-GO， oridonin， CS-GO-orionin （all 32 μg/mL） by cells was observed with fluorescence labeling method. The apoptosis of cells and the content of ROS were observed by flow cytometry after treated with different concentrations of CS-GO （16， 32， 64 μg/mL） and CS-GO-oridonin（16， 32， 64 μg/mL）. The expression of anti-apoptosis related proteins （Mcl-1， Bax and Bak） were detected by Western blot. RESULTS： After treated with different concentrations of CS-GO， the survival rate of cells was still above 90%; after treated with different concentrations of CS-GO-oridonin， the survival rate of cells showed a downward trend， and was significantly lower than that of CS-GO group （P<0.01）; IC50 of CS-GO-oridonin was 32.61 μg/mL. After CS-GO treatment， the cell morphology did not change significantly; after CS-GO-oridonin treatment， the cells shrunk and fell off in clusters， and the suspended matter increased; the fluorescence of oridonin and CS-GO-orionin taken up by cells was enhanced than CS-GO. Compared with blank group， there was no significant change in the apoptosis rate， the content of ROS and the expression of apoptosis-related protein in 16， 32， 64 μg/mL CS-GO groups （P>0.05）; apoptosis rate， the content of ROS， the protein expression of Bax and Bak in 16， 32， 64 μg/mL CS- GO-oridonin groups were increased significantly， while the protein expression of Mcl-1 were decreased significantly. Above indexes were significantly higher or lower than the same concentration CS-GO group （P<0.05）. CONCLUSIONS： CS-GO dose not affect the proliferation and apoptosis of A549 cells; CS-GO-oridonin has obvious inhibition and apoptosis promoting effect on cells， which may be related to increasing ROS production and regulating the expression of apoptosis related proteins.

KEYWORDS? ?Chitosan graphene oxide carrier; Oridonin; A549 cells; Proliferation; Apoptosis

肺癌是全世界最常見(jiàn)的腫瘤之一，是多因素、多基因共同作用所導(dǎo)致的惡性腫瘤[1-2]。目前，對(duì)于肺癌患者的臨床治療，西醫(yī)一般采用手術(shù)切除、放療、化療等方法。而對(duì)于大部分不適合手術(shù)切除的實(shí)體腫瘤患者，化療常被作為其首選治療方法，但化療的毒副作用較大，導(dǎo)致患者常會(huì)出現(xiàn)惡心嘔吐等毒副反應(yīng)、生存質(zhì)量明顯下降[3-4]。中醫(yī)藥在治療慢性疾病和疑難雜癥方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，且毒副作用較少;同時(shí)，中藥聯(lián)合化療可有效改善患者的生存質(zhì)量，降低其惡心嘔吐的發(fā)生率，療效好且安全可靠[5-6]。由此可見(jiàn)，中西醫(yī)結(jié)合可在肺癌治療領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，已成為目前學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)之一[5]。

冬凌草甲素（oridonin）是從唇形科植物碎米椏Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara中分離得到的一種貝殼杉烷類二萜化合物，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有顯著的抑制或殺傷作用[7-8]。但由于該化合物水溶性差、生物利用度低等原因，使得其臨床應(yīng)用受到一定的限制[9]。因此，若能克服上述不足，則將有助于該化合物在抗腫瘤領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。有研究表明，適宜的藥物載體可明顯提高冬凌草甲素的生物利用度[10]。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是石墨烯經(jīng)氧化超聲處理后所得的產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)表面和邊緣都存在含氧官能團(tuán)，其中的氧原子易與水形成氫鍵，能很好地分散于水中，從而增加藥物的親水性;同時(shí)，GO表面積大、載藥量高、表面含氧官能團(tuán)豐富且結(jié)構(gòu)易于修飾，是一種很好的藥物載體[11]。殼聚糖（chitosan，CS）的結(jié)構(gòu)中有許多氨基和羥基，具有生物相容性和生物降解性好、無(wú)毒性等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[12]。CS修飾GO得到的CS-GO載體具有良好的水溶性和生物相容性，可用于負(fù)載抗腫瘤藥物[13]?；诖?，本研究利用CS-GO作為載體負(fù)載冬凌草甲素（即CS-GO-oridonin），初步考察其對(duì)人肺癌細(xì)胞A549增殖、凋亡的影響以及可能機(jī)制，為該化合物新型抗腫瘤制劑的研發(fā)提供理論和技術(shù)支持，為肺癌的臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括SQP JP-04型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、HWCL-3型磁力攪拌器（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）、TGL-16M型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）、Epsilon 2-4型冷凍干燥機(jī)（德國(guó)LSC Christ公司）、KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái)（蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司）、BSC-1300ⅡB2型生物安全柜[西班泰克凈化設(shè)備（蘇州）有限公司]、311型CO2恒溫培養(yǎng)箱和F3型移液器（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、DMIL LED型倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）、AMR-100型酶標(biāo)儀（杭州奧盛儀器有限公司）、NovoCyte型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Agilent公司）、Tanon-5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

冬凌草甲素對(duì)照品（批號(hào)MUST-19011510，純度99.64%）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司;GO（厚度0.8～1.2 nm，單層）購(gòu)自南京先豐納米材料科技有限公司;CS（乙酰度87.2%，分子量161.1 Da）購(gòu)自南通興成生物制品廠;透析袋（截留分子量14 000 Da）購(gòu)自北京白鯊易科技有限公司;F12K培養(yǎng)基、胎牛血清（批號(hào)分別為21127-022、10270-106）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4）、0.25%胰蛋白酶、CCK-8試劑、流式細(xì)胞儀專用binding buffer、兔髓樣細(xì)胞白血病1（Mcl-1）多克隆抗體、兔Bax多克隆抗體、兔Bak多克隆抗體、兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)分別為C1741、C1812、C1706、CY1698、202009、202008、202009、202009、202008）均購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司;膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)556547）購(gòu)自美國(guó)BD公司;FITC試劑（貨號(hào)46950）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）、活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)均為S0033）均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;蛋白質(zhì)Marker（批號(hào)P12103）購(gòu)自美國(guó)Helix公司;抗熒光萃滅封片劑[含4′，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）]、十二烷基硫酸鈉（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)分別為S2110、S8010、T8090、PC0020）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑（批號(hào)分別為IPVH00010、1930802）均購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人肺癌細(xì)胞A549來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)/干細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 CS-GO、CS-GO-oridonin的制備

稱取GO適量，加水超聲使分散均勻并定容，制得GO質(zhì)量濃度為2 mg/mL的分散液。取CS適量，加入2%醋酸溶液，于室溫下攪拌6 h至完全溶解并定容，制得CS質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液。將上述GO分散液和CS溶液等體積混合，于室溫下攪拌72 h后，以13 700×g離心30 min;取沉淀，用大量2%醋酸溶液洗滌（以除去未反應(yīng)完全的CS）后，于4 ℃下以水透析72 h（白天每3 h換水1次，晚上每9 h換水1次），冷凍干燥后即得CS-GO[14]。稱取冬凌草甲素對(duì)照品適量，用乙醇溶解后，與用水分散的CS-GO按質(zhì)量比1 ∶ 1混合并在室溫下攪拌24 h，即得CS-GO-oridonin（每克產(chǎn)物含冬凌草甲素0.428 g）。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將A549細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱“完全培養(yǎng)基”），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 CS-GO-oridonin對(duì)A549細(xì)胞抑制作用的考察

采用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)。收集“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液，按5×103 mL-1接種于96孔板中，每孔180 ?L，培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后，將其隨機(jī)分為空白組、CS-GO不同質(zhì)量濃度組（3、6、12、24、48 μg/mL，以CS-GO的整體質(zhì)量計(jì)，下同）、CS-GO-oridonin不同質(zhì)量濃度組（3、6、12、24、48 μg/mL，以冬凌草甲素計(jì)[10]，下同），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。空白組加入含2%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基180 μL，其余各組加入含相應(yīng)質(zhì)量濃度CS-GO空白載體或CS-GO-oridonin，再加入2%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基180 μL;同時(shí)，設(shè)置僅含完全培養(yǎng)基的凋零孔。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率=（檢測(cè)組細(xì)胞OD值-調(diào)零孔細(xì)胞OD值）/（空白組細(xì)胞OD值-調(diào)零孔細(xì)胞OD值）×100%]，并通過(guò)SPSS 22.0軟件計(jì)算CS-GO-oridonin的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.4 CS-GO-oridonin對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響觀察

收集“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液，按5×103 mL-1接種于96孔板中，每孔180 ?L，培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后，分別加入含相應(yīng)質(zhì)量濃度CS-GO空白載體或CS-GO-oridonin（32 ?g/mL，質(zhì)量濃度按“2.3”項(xiàng)下所得IC50設(shè)置），再加入2%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基180 μL，分別培養(yǎng)2、4、10、24 h。于上述時(shí)間點(diǎn)取細(xì)胞適量，用PBS洗滌3次，置于倒置熒光顯微鏡下觀察其形態(tài)并拍照。

2.5 CS-GO-oridonin被A549細(xì)胞攝取情況觀察

取適量CS-GO、冬凌草甲素、CS-GO-oridonin分散在PBS中，加入適量FITC試劑，在避光條件下磁力攪拌12 h。將上述溶液以13 700×g離心30 min，收集離心管中的下層沉淀，并用PBS多次洗滌，直至上清液中不含游離FITC，即得FITC熒光標(biāo)記的CS-GO、冬凌草甲素、CS-GO-oridonin。取“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液，按5×103 mL-1接種于96孔板中，每孔180 ?L，培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后，分別加入含相應(yīng)質(zhì)量濃度且經(jīng)FITC標(biāo)記的CS-GO空白載體或冬凌草甲素或CS-GO-oridonin（質(zhì)量濃度同“2.4”項(xiàng)），再加入2%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基180 μL，于37 ℃孵育4 h;用PBS沖洗3次，置于4%多聚甲醛溶液中室溫固定30 min;用PBS沖洗3次，棄去PBS后，加入抗熒光淬滅封片液（含DAPI）50 μL，反應(yīng)15 min后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察其攝取情況并拍照。

2.6 CS-GO-oridonin對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響考察

采用Annexin V-FITC/PI雙染法以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液，按5×103 mL-1接種于96孔板中，每孔180 μL，培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后，將其隨機(jī)分為空白組、CS-GO不同質(zhì)量濃度組（16、32、64 μg/mL）、CS-GO-oridonin不同質(zhì)量濃度組（16、32、64 μg/mL，以冬凌草甲素計(jì)，質(zhì)量濃度按“2.3”項(xiàng)下所得IC50的1/2、1、2倍設(shè)置）。空白組加入含2%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基2 mL，其余各組加入含相應(yīng)質(zhì)量濃度CS-GO空白載體或CS-GO- oridonin，再加入2%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h;棄去培養(yǎng)基，以PBS清洗后，用0.25%胰蛋白酶消化，吸除多余的胰蛋白酶消化液;加入完全培養(yǎng)基輕輕吹打并收集細(xì)胞，以1 000×g離心5 min，棄去上清液，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取5萬(wàn)～10萬(wàn)個(gè)重懸的細(xì)胞，于4 ℃下以1 000×g離心5 min，棄去上清液;加入預(yù)冷PBS 1 mL，輕輕振蕩使細(xì)胞懸浮，于4 ℃下以1 000×g離心5 min，棄去上清液，再次重復(fù)此過(guò)程2次。將上述處理后的細(xì)胞重懸于binding buffer 200 μL中，依次加入Annexin V-FITC試劑和PI試劑各10 μL，輕輕混勻，于4 ℃下避光孵育30 min;再加入binding buffer 300 μL，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞總凋亡率（細(xì)胞總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率）。

2.7 CS-GO-oridonin對(duì)A549細(xì)胞中ROS含量的影響考察

收集“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)期細(xì)胞，按“2.6”項(xiàng)下方法分組（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔）、給藥。細(xì)胞培養(yǎng)5 h后，將其重懸于DCFH-DA溶液（用無(wú)血清的F12K培養(yǎng)基稀釋至DCFH-DA終濃度為10 μmol/L）1 mL中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106 mL-1，于37 ℃下孵育20 min（每隔3 min顛倒混勻1次），使DCFH-DA探針和細(xì)胞充分接觸。孵育結(jié)束后，用無(wú)血清F12K培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的游離DCFH-DA。收集各組細(xì)胞，用PBS 500 μL重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106 mL-1，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中ROS的含量。

2.8 CS-GO-oridonin對(duì)A549細(xì)胞中的Mcl-1、Bax、Bak蛋白表達(dá)水平的影響檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。收集“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)期細(xì)胞，按“2.6”項(xiàng)下方法分組（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔）、給藥。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，提取其蛋白并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白置于沸水浴中10 min使變性，取變性蛋白20 μg，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳后，蛋白以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;加入Mcl-1、Bax、Bak、GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過(guò)夜;用PBST溶液洗滌5 min×3次，加入HRP標(biāo)記的IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 10 000），室溫孵育1 h;用PBST溶液洗滌5 min×3次，以ECL顯色，于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀上成像。使用Tanon GIS 4.2軟件分析各蛋白條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Graphpad Prism 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s或x表示，組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CS-GO-oridonin對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用

當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí)，不同質(zhì)量濃度CS-GO組細(xì)胞的存活率均在90%以上;而不同質(zhì)量濃度CS-GO-oridonin組細(xì)胞的存活率均較空白組顯著降低，且顯著低于同質(zhì)量濃度CS-GO組（P<0.01），且CS-GO-oridonin 48 μg/mL組細(xì)胞的存活率僅為（27.12±0.01）%，詳見(jiàn)表1。CS-GO-oridonin的IC50值為32.61 μg/mL。

3.2 CS-GO-oridonin對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

以CS-GO培養(yǎng)至24 h時(shí)，細(xì)胞形態(tài)仍保持正常，且形態(tài)飽滿、均一性好，詳見(jiàn)圖1。以CS-GO-oridonin培養(yǎng)至24 h時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)了皺縮、不規(guī)則現(xiàn)象，且可見(jiàn)其成團(tuán)脫落、懸浮狀的現(xiàn)象增多，詳見(jiàn)圖2。

3.3 CS-GO-oridonin被A549細(xì)胞攝取的情況

CS-GO、冬凌草甲素和CS-GO-oridonin被A549細(xì)胞攝取情況的顯微圖見(jiàn)圖3（圖中，DAPI表示染色后呈藍(lán)色熒光的細(xì)胞核，F(xiàn)ITC表示被細(xì)胞攝取后呈綠色熒光的CS-GO空白載體或冬凌草甲素或CS-GO-oridonin，Merge表示兩者疊加）。由圖3可見(jiàn)，當(dāng)細(xì)胞攝取CS-GO后，其熒光較弱;而當(dāng)細(xì)胞攝取冬凌草甲素、CS-GO-oridonin后，其熒光均有所增強(qiáng)。

3.4 CS-GO-oridonin對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

CS-GO-oridonin 16、32、64 μg/mL組細(xì)胞的凋亡率均顯著高于空白組（P<0.01），且顯著高于同質(zhì)量濃度CS-GO組（P<0.01），詳見(jiàn)圖4、表2。

3.5 CS-GO-oridonin對(duì)A549細(xì)胞中ROS含量的影響

CS-GO-oridonin 16、32、64 μg/mL組細(xì)胞中ROS含量均顯著高于空白組（P<0.01），且顯著高于同質(zhì)量濃度CS-GO組（P<0.01），詳見(jiàn)表2。

3.6 CS-GO-oridonin對(duì)A549細(xì)胞中Mcl-1、Bax、Bak蛋白表達(dá)水平的影響

CS-GO-oridonin 16、32、64 μg/mL組細(xì)胞中Mcl-1蛋白的表達(dá)水平均顯著低于空白組，且顯著低于同濃度CS-GO組（P<0.01）;Bax、Bak蛋白的表達(dá)水平均顯著高于空白組，且顯著高于同質(zhì)量濃度CS-GO組（P<0.05或P<0.01），詳見(jiàn)圖5、表3。

4 討論

本研究通過(guò)CCK-8法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度CS-GO- oridonin對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響，發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞均有抑制作用，且隨著其質(zhì)量濃度的提高，細(xì)胞存活率有逐漸降低的趨勢(shì);同時(shí)，各CS-GO-oridonin組細(xì)胞的存活率均顯著低于同質(zhì)量濃度CS-GO組，表明CS-GO負(fù)載等質(zhì)量冬凌草甲素后可以有效抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，本研究通過(guò)CCK-8法得出CS-GO-oridonin的IC50為32.61 μg/mL，故參考該值，以32 μg/mL作為細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究、攝取實(shí)驗(yàn)的CS-GO-oridonin的實(shí)驗(yàn)濃度;同時(shí)，以該質(zhì)量濃度作為細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞中ROS含量及相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)的中間濃度，再將其1/2、2倍作為低、高濃度（16、64 μg/mL）。

本研究結(jié)果顯示，以32 μg/mL的CS-GO空白載體培養(yǎng)A549細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率仍在90%以上，且細(xì)胞形態(tài)仍保持正常;而載藥后的CS-GO-oridonin（32? ? ? μg/mL）對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響較大，提示CS-GO負(fù)載的oridonin對(duì)A549細(xì)胞有殺傷作用，使其形態(tài)發(fā)生了變化。細(xì)胞攝取情況觀察結(jié)果顯示，CS-GO（32 μg/mL）、冬凌草甲素（32 μg/mL）、CS-GO-oridonin（32 μg/mL）均能進(jìn)入A549細(xì)胞的細(xì)胞核中，且后兩者的熒光較CS-GO有所增強(qiáng)，提示冬凌草甲素被CS-GO載體負(fù)載后，能被細(xì)胞攝取并集中于細(xì)胞核內(nèi);但CS-GO-oridonin被攝取后的熒光強(qiáng)度弱于冬凌草甲素，提示其靶向性有待進(jìn)一步確認(rèn)。

細(xì)胞死亡的主要機(jī)制是通過(guò)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，凋亡是指由基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡[15]。細(xì)胞凋亡失調(diào)發(fā)生在各種腫瘤細(xì)胞中，這使得腫瘤細(xì)胞難以被殺傷，因此激活凋亡途徑或抑制抗凋亡途徑的藥物均具有治療腫瘤的潛力[16]。在本研究中，不同質(zhì)量濃度CS-GO-oridonin組細(xì)胞的凋亡率均顯著高于空白組，且亦顯著高于相同質(zhì)量濃度CS-GO組，說(shuō)明CS-GO-oridonin可誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡。

有研究表明，提高腫瘤細(xì)胞中ROS水平可有助于藥物抗腫瘤作用的發(fā)揮，ROS水平的增加又可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控凋亡蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、提高腫瘤細(xì)胞對(duì)其他化療藥物的敏感性，最終發(fā)揮抗腫瘤作用[17]。在A549細(xì)胞凋亡過(guò)程中，相關(guān)凋亡蛋白發(fā)揮著重要作用：Bax具有促進(jìn)凋亡作用，是細(xì)胞凋亡通路的重要組成部分[18];Bak可以誘導(dǎo)線粒體碎裂和細(xì)胞色素C釋放，刺激Bax的表達(dá)[19]。Mcl-1蛋白主要定位于線粒體外膜，其在細(xì)胞的分化、誘導(dǎo)凋亡中起著重要的作用，可將Mcl-1作為腫瘤治療的新靶點(diǎn);其主要作用機(jī)制如下：在細(xì)胞毒制劑等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的條件下，其可通過(guò)螯合促凋亡蛋白Bax/Bak而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，還可與增殖細(xì)胞核抗原相互作用來(lái)調(diào)控細(xì)胞的分化過(guò)程[20-23]。本研究經(jīng)CS修飾GO得到CS-GO載體，再經(jīng)CCK-8法證實(shí)此載體安全性高;負(fù)載冬凌草甲素后，CS-GO-oridonin對(duì)A549細(xì)胞的增殖有抑制作用，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中ROS含量以及Mcl-1、Bax、Bak蛋白表達(dá)水平的變化情況推測(cè)，CS-GO-oridonin誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，同時(shí)通過(guò)下調(diào)Mcl-1蛋白并上調(diào)Bax、Bak蛋白的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用。

綜上所述，CS-GO不會(huì)影響A549細(xì)胞的增殖及凋亡;CS-GO-oridonin對(duì)A549細(xì)胞有一定的抑制和促凋亡作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生以及調(diào)控相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)。本研究為冬凌草甲素抗腫瘤制劑的開(kāi)發(fā)提供了參考，為進(jìn)一步探討CS-GO-oridonin的抗腫瘤作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)本課題組將借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，重點(diǎn)挖掘該制劑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的潛在作用機(jī)制。

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（收稿日期：2020-12-11 修回日期：2021-05-11）

（編輯：張?jiān)拢?/p>