縫隙連接阻斷劑對(duì)大鼠癲癇后海馬漣波振蕩能量變化的影響

易妍君 冉曉 向敬 李昕陽 蔣莉 陳恒勝 胡越

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400136；2.美國辛辛那提兒童醫(yī)院腦磁圖中心，俄亥俄州辛辛那提 45229；3.北京師范大學(xué)-香港浸會(huì)大學(xué)聯(lián)合國際學(xué)院理工科技學(xué)部，廣東珠海 519087）

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中存在廣泛的高頻振蕩（high‐frequency oscillations，HFOs）。HFOs是指頻率在40~500 Hz的腦電活動(dòng)，包括γ振蕩（40~80 Hz）、漣波（ripple）振蕩（80~200 Hz）、快速漣波（fast ripples，F(xiàn)Rs）振蕩（250~500 Hz）。生理狀態(tài)下，HFOs與感官信息處理、海馬記憶功能有關(guān)［1］；而病理性HFOs與癲癇密切相關(guān)［2］。

目前HFOs的產(chǎn)生機(jī)制還不完全清楚。ripple可能是由γ‐氨基丁酸受體介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)元產(chǎn)生的抑制性突觸后電位同步化形成［3］。FRs可能是由于具有病理性連接的興奮性神經(jīng)元短暫、高度同步化、突發(fā)式放電形成的場(chǎng)電位［3］。我們之前的研究已經(jīng)證實(shí)發(fā)作期FRs的平均能量和最大能量可以作為癲癇發(fā)作早期預(yù)警的定量指標(biāo)［4-5］。但FRs對(duì)腦電圖儀器要求高，數(shù)據(jù)采集困難，臨床應(yīng)用受限。那么ripple是否具有與FRs相似的敏感性和特異性，從而應(yīng)用于癲癇的臨床研究？這為降低HFOs分析難度，使其未來作為癲癇診療的常規(guī)手段提供依據(jù)。

本研究選擇癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）成年大鼠模型為研究對(duì)象，通過對(duì)比不同縫隙連接（gap junction，GJ）阻斷劑奎寧（quinine，QUIN）、甘珀酸（carbenoxolone，CBX）與一線抗癲癇藥物丙戊酸（valproate sodium，VPA）對(duì)癲癇活動(dòng)及海馬ripple能量的動(dòng)態(tài)影響，闡明ripple能量分析是否具有與FRs類似的對(duì)癲癇發(fā)作的預(yù)測(cè)價(jià)值，明確GJ是否對(duì)癲癇的發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用，從而為針對(duì)性選擇抗癲癇治療的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 癲癇模型的建立與腦電記錄

選用24只清潔級(jí)Sprague‐Dawley成年大鼠（購自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心），體重（200±20）g。術(shù)前腹腔注射青霉素1 mL（16萬單位/mL）預(yù)防感染，10%水合氯醛（3 mL/kg）鎮(zhèn)靜后，采用大鼠腦立體定位儀（深圳瑞沃德生命科技公司）定位插入顱內(nèi)電極［6］，記錄位置包括雙側(cè)海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回，以雙側(cè)頂葉硬膜下作為參考電極，左側(cè)前額硬膜下作為地線。

術(shù)后第3天開始描記正常深部腦電信號(hào)，連續(xù)5 d（5~8 h/d），術(shù)后第9天建立氯化鋰-匹羅卡品（pilocarpine，PILO）SE模型［7］。建模成功后，每天記錄大鼠腦電信號(hào)5~8 h至SE后3 d。采樣頻率1 kHz，高通0.16 Hz，低通500 Hz。

24只大鼠隨機(jī)分為4組（n=6）。每只大鼠腹腔注射氯化鋰127 mg/kg，18~20 h后腹腔注射PILO。在癲癇發(fā)作1 h時(shí)腹腔注射水合氯醛。除模型組外，VPA組、QUIN組和CBX組需在注射PILO前3 d行預(yù)處理。VPA組：VPA 200 mg/kg，每天2次，連續(xù)灌胃3 d；QUIN組：QUIN 50 mg/kg，每天2次，連續(xù)腹腔注射3 d；CBX組：CBX 50 mg/kg，每天2次，連續(xù)腹腔注射3 d。實(shí)驗(yàn)過程中如出現(xiàn)動(dòng)物死亡則替補(bǔ)新的實(shí)驗(yàn)大鼠入組。

1.2 腦電圖分析

采集建模前1 d，PILO注射后10、20、30、40、50、60、70、80 min，推注水合氯醛（止癇）前后及止癇后1、2、3 h，SE后1 d、SE后3 d，共16個(gè)時(shí)間點(diǎn)各10 min的原始腦電圖。

對(duì)以上各時(shí)間點(diǎn)采集的10 min腦電信號(hào)分別進(jìn)行HFOs信號(hào)定量分析。本研究采用Morlet小波算法［8］，提取ripple（80~200 Hz）腦電信號(hào)，包括平均能量分析和最大能量分析。

ripple振蕩平均能量是指整個(gè)觀察時(shí)間窗口的所有能量平均；ripple振蕩最大能量是指整個(gè)觀察時(shí)間窗口內(nèi)某一時(shí)間點(diǎn)的能量，為該觀察時(shí)間窗口的最高能量［9］。

定義ripple振蕩能量波動(dòng)最大的導(dǎo)聯(lián)為責(zé)任導(dǎo)聯(lián)［5］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組或多時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD‐t法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ripple振蕩能量定量分析

24只大鼠成功建立模型。造模前，正常大鼠海馬CA1、CA3區(qū)及齒狀回均可見ripple振蕩表達(dá)。VPA組、QUIN組和CBX組，均以CA1和CA3區(qū)ripple振蕩能量波動(dòng)最大（n=6），模型組中，4只以CA1和CA3區(qū)ripple振蕩能量波動(dòng)最大，2只以齒狀回區(qū)ripple振蕩能量波動(dòng)最大。進(jìn)一步對(duì)ripple振蕩平均能量及最大能量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表1~2和圖1~2。

表1 癲癇發(fā)作前后各組ripple振蕩平均能量的動(dòng)態(tài)變化 （n=6）

表2 癲癇發(fā)作前后各組ripple振蕩最大能量的動(dòng)態(tài)變化 （n=6）

圖1 各組癲癇前后CA1區(qū)ripple振蕩能量和時(shí)間特性 左側(cè)波形圖采用80~200 Hz的帶通濾波器進(jìn)行濾波。右側(cè)頻譜圖反映了相應(yīng)波形的累積時(shí)頻。以上數(shù)據(jù)證明癲癇發(fā)作伴隨ripple振蕩能量的增加，而VPA、QUIN和CBX進(jìn)行預(yù)處理可以降低ripple振蕩能量并減輕癲癇發(fā)作的程度。ripple振蕩的特征是節(jié)律性爆發(fā)，與系統(tǒng)偽跡（如電源噪聲及其諧波）不同。

圖2 各組止癇前后CA1區(qū)ripple振蕩能量和時(shí)間特性 左側(cè)波形圖采用80~200 Hz的帶通濾波器進(jìn)行濾波；右側(cè)頻譜圖反映了相應(yīng)波形的累積時(shí)頻。結(jié)果表明，癲癇終止伴隨ripple振蕩能量的下降，而VPA、QUIN和CBX進(jìn)行預(yù)處理可以降低ripple振蕩能量，并減輕癲癇發(fā)作的程度。ripple振蕩的特征是節(jié)律性爆發(fā)，與系統(tǒng)偽跡（如電源噪聲及其諧波）不同。

注射PILO后，各實(shí)驗(yàn)組ripple振蕩平均能量逐漸增強(qiáng)，模型組、VPA組和CBX組在止癇前達(dá)到最高峰，QUIN組在PILO注射后60 min達(dá)到最高峰，與建模前1 d相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。止癇后，VPA組、QUIN組、CBX組ripple振蕩平均能量恢復(fù)至建模前1 d水平（P>0.05）；模型組在止癇后1 h ripple振蕩平均能量降至建模前1 d水平（P>0.05）；且各組均持續(xù)正常水平至SE后3 d。CBX組與VPA組在注射PILO后40 min，QUIN組在注射PILO后80 min開始，ripple振蕩平均能量明顯低于模型組（P<0.05），并持續(xù)至止癇后1 h。

ripple振蕩最大能量的變化趨勢(shì)與ripple振蕩平均能量的變化趨勢(shì)類似。

3 討論

相對(duì)常頻腦電信號(hào)，HFOs信號(hào)更為微弱，波幅低且持續(xù)時(shí)間短［10］，傳統(tǒng)時(shí)域分析或頻域分析均不能準(zhǔn)確表達(dá)HFOs的特征。隨著對(duì)HFOs研究的深入，HFOs的采集技術(shù)、自動(dòng)檢測(cè)技術(shù)及新的分析與量化算法正得到快速的發(fā)展［11］。時(shí)頻分析法中的小波變換是近20年來新發(fā)展起來的信號(hào)分析理論［12］，其在信號(hào)奇異性檢測(cè)、時(shí)變?yōu)V波、模式識(shí)別等信號(hào)分析和處理方面具有廣泛的應(yīng)用。小波變換中的Morlet小波具有良好的時(shí)間分辨率，可實(shí)現(xiàn)HFOs在癲癇腦組織中的定量分析［8］。

既往有報(bào)道顯示［13］，海馬區(qū)生理性HFOs多為ripple。本研究顯示，ripple和FRs可以同時(shí)出現(xiàn)在正?；虬d癇海馬組織中，兩種狀態(tài)下的主要區(qū)別在于ripple表達(dá)能量不同。因此，我們認(rèn)為HFOs的頻率并非區(qū)分生理和病理狀態(tài)的必要條件。PILO注射后10 min，即使此時(shí)各組均未誘導(dǎo)出Ⅳ級(jí)癇性發(fā)作，ripple振蕩平均能量仍較發(fā)作前相比明顯增加，止癇后，ripple振蕩平均能量迅速下降。對(duì)ripple最大能量進(jìn)行分析，得出類似的結(jié)果。這說明ripple能量變化與癲癇發(fā)作的狀態(tài)吻合［14］。顳葉癲癇患者中，HFOs產(chǎn)生區(qū)與器質(zhì)性腦損害區(qū)一致［15］，多發(fā)生在CA1、CA3、齒狀回區(qū)［16］。本研究顯示：ripple平均/最大能量變化在雙側(cè)海馬呈非對(duì)稱性，同側(cè)海馬不同區(qū)域其平均/最大能量變化也并非完全一致。癲癇大鼠責(zé)任導(dǎo)聯(lián)集中在CA1、CA3、齒狀回區(qū)。因此，責(zé)任導(dǎo)聯(lián)所在區(qū)域可能與致癇灶密切相關(guān)。ripple平均/最大能量變化可較好地反映腦功能狀態(tài)的變化，二者適用于癲癇預(yù)測(cè)或腦功能狀態(tài)的檢測(cè)。

增強(qiáng)的細(xì)胞間GJ通訊可能參與癲癇產(chǎn)生［17］。CBX是廣譜GJ阻斷劑，通過改變GJ通道蛋白構(gòu)象，從而關(guān)閉GJ通道［18］。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了CBX具有抗癲癇作用［19］，但由于類鹽皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)而使其應(yīng)用受限。QUIN選擇性阻斷CX36和CX50介導(dǎo)的細(xì)胞間GJ，具有劑量依賴性，低劑量有抗癲癇作用，而高劑量具有神經(jīng)毒性［20］。VPA可誘導(dǎo)CX43及CX26的表達(dá)［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，GJ阻斷劑包括CBX和QUIN，均可阻斷ripple振蕩，減輕癲癇發(fā)作程度，與一線抗癲癇藥物VPA具有類似的抗癲癇作用。止癇后10 min，3個(gè)干預(yù)組ripple振蕩平均及最大能量均恢復(fù)至正常水平，并持續(xù)至SE后3 d，提示GJ阻斷劑及VPA，對(duì)發(fā)作間期HFOs無明顯影響。盡管近20年有多種新型抗癲癇藥物應(yīng)用于臨床，卻并未改變癲癇治療原則，降低難治性癲癇發(fā)生率。因此，進(jìn)一步探索抗癲癇藥物的不同類型作用靶點(diǎn)，針對(duì)性阻斷GJ的作用靶點(diǎn)，減少病理性HFOs形成，具有重要的臨床意義。