核桃凋落葉分解對(duì)豌豆生長(zhǎng)及抗性生理的影響

高 洪

(涼山州林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院，四川 西昌 615000)

自20世紀(jì)70年代以來，全球人口劇增，資源過度消耗，人類面臨著生態(tài)環(huán)境惡化、土地資源減少的緊迫形勢(shì)，環(huán)境和發(fā)展成為當(dāng)今國(guó)際上的兩大重要論題。作為具有可持續(xù)發(fā)展特點(diǎn)的土地利用和經(jīng)營(yíng)方式，農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)日益受到人們的重視[1]。果樹具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，深受農(nóng)民喜愛，果農(nóng)間作成為了農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)的主要模式之一[2]。但是農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)中植物之間普遍存在著相互影響的現(xiàn)象，其主要現(xiàn)象之一就是化感作用，其影響著復(fù)合系統(tǒng)的生態(tài)功能和經(jīng)濟(jì)效益，近年來已成為世界各國(guó)科學(xué)家重視的一個(gè)新研究領(lǐng)域[3]。

核桃(Juglan regia)又名胡桃，屬胡桃科(Juglandaceae)核桃屬(Juglans)植物。核桃具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、木材珍貴等優(yōu)點(diǎn)，已成為廣大農(nóng)民造林的首選樹種之一[4]。但是多項(xiàng)研究表明[5-11]，核桃的葉、果皮及根皮分泌釋放的次生代謝物質(zhì)及衍生物對(duì)林下作物可能具有毒害作用。核桃分泌釋放的化感物質(zhì)主要由黃酮和酚類組成[12,13]。人們對(duì)化感的研究起步雖早，但是前期的研究方法基本停留在采用浸提液進(jìn)行室內(nèi)發(fā)芽試驗(yàn)和幼苗期生長(zhǎng)的測(cè)定上。近年來，出現(xiàn)了盆栽試驗(yàn)的生物測(cè)試方法[14,15]，即通過盆栽試驗(yàn)，讓凋落葉在種植有作物的土壤中自然分解，觀察其在分解過程中對(duì)受體作物生長(zhǎng)、生理的影響，從而了解其產(chǎn)生的效果并探討其作用機(jī)理，具有一定的實(shí)踐意義，是迄今為止更接近生產(chǎn)實(shí)踐的一種實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)研究方法。本試驗(yàn)擬采用常見作物豌豆(Pisum sativum)作為受體，通過盆栽試驗(yàn)探討核桃凋落葉在自然分解過程中對(duì)豌豆生長(zhǎng)的影響，初步了解核桃對(duì)豌豆的化感作用，分析核桃與豌豆的種間關(guān)系，以期為核桃與豌豆以及類似作物林農(nóng)復(fù)合種植模式的發(fā)展與合理經(jīng)營(yíng)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供體材料

供試核桃凋落葉取自四川省涼山州西昌市郊區(qū)十年生核桃當(dāng)年凋落葉。

1.1.2 受體材料

供試豌豆為適宜當(dāng)?shù)氐耐?株長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的豌豆。

1.1.3 栽植土壤與容器

選擇當(dāng)?shù)剞r(nóng)田砂壤土，每盆用土10kg，播種前將土壤與凋落葉碎末均勻混合，再裝入口徑30cm、高度30cm的塑料盆缽。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用盆栽的方法進(jìn)行，具體方法是按設(shè)計(jì)的凋落葉量，將凋落葉碎末與土壤均勻混合裝盆，在其中播種豌豆。

采用野外隨機(jī)4m×4m樣方調(diào)查的方法，推算得到本試驗(yàn)所用盆缽盆口面積的核桃林地面積上每年約凋落80g核桃凋落葉，故以80g每盆作為基本施入量。并采用0.5倍、1倍和2倍處理，即凋落葉用量分別為40g、80g和160g，對(duì)照T0不施凋落葉，各凋落葉處理和T0均設(shè)5盆重復(fù)。

播種時(shí)，將處理好的豌豆種子點(diǎn)播于盆中，保證每盆種子數(shù)量基本相同并且在盆中分布均勻，覆土2cm，澆透水。待豌豆發(fā)芽后進(jìn)行常規(guī)的田間管理。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定及方法

本試驗(yàn)的播種時(shí)間為10月25日，播種30d后對(duì)全部豌豆進(jìn)行破壞性取樣，測(cè)定每盆平均株高、主根長(zhǎng)及其生物量，并每盆隨機(jī)取新鮮葉片1g測(cè)定其抗性生理指標(biāo)。其中，超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法[16]；過氧化物酶(POD)活性測(cè)定參照愈創(chuàng)木酚法[17]；過氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定參照紫外分光光度法[18]；丙二醛(MDA)與可溶性糖(SS)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸加熱顯色法[17]；脯氨酸(Pro)含量測(cè)定采用電位滴定法[17]；可溶性蛋白(SP)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250法[17]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理分析

用Willamson和Richardson[19]提出的敏感指數(shù)RI為衡量指標(biāo)對(duì)核桃凋落葉對(duì)豌豆的化感效應(yīng)進(jìn)行度量，即：

RI=1-C/T(當(dāng)T≥C時(shí))或RI=T/C-1(當(dāng)T

式中，T為處理值；C為對(duì)照值；RI>0表示促進(jìn)作用，RI<0表示抑制作用，RI的絕對(duì)值代表化感作用強(qiáng)度的大小。

利用SPSS 17.0(SPSS Inc.,USA)分別對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way ANOVA分析，如果差異顯著(P<0.05)，再用LSD進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃凋落葉在土壤中分解對(duì)豌豆形態(tài)指標(biāo)的影響

由表1可知，各核桃凋落葉處理豌豆的株高、地上部分鮮重、地下部分鮮重均顯著低于對(duì)照(T0)，不同凋落葉處理之間形態(tài)指標(biāo)的差異不明顯。

表1 不同量核桃凋落葉處理對(duì)豌豆形態(tài)指標(biāo)的影響

2.2 核桃凋落葉在土壤中分解初期對(duì)豌豆3種抗性指標(biāo)及MDA含量的影響

表2 不同量核桃凋落葉量處理對(duì)豌豆的抗氧化酶系統(tǒng)的影響

根據(jù)表2可知，凋落葉在土壤中分解降低了豌豆葉片SOD、CAT活性，各凋落葉處理SOD、CAT活性均顯著(P<0.05)低于T0，出現(xiàn)了T0>T1>T2>T3的現(xiàn)象；各凋落葉處理POD活性顯著(P<0.05)低于T0，各處理之間差異不明顯且無明顯變化趨勢(shì)。綜合化感指數(shù)來看，SOD活性化感指數(shù)為-0.135～-0.340，POD活性化感指數(shù)為-0.350～-0.452，CAT活性化感指數(shù)為-0.312～-0.430，由此可推斷SOD活性下降程度低于POD、CAT活性。受到核桃凋落葉分解的作用后，豌豆葉片MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，見表3，表明豌豆已經(jīng)受到傷害。

表3 不同量核桃凋落葉量處理對(duì)豌豆的MDA含量的影響

2.3 核桃凋落葉在土壤中分解對(duì)豌豆3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由表4可知，各凋落葉處理的脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)2種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量均高于對(duì)照(T0)，且各凋落葉處理與T0之間差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，同時(shí)出現(xiàn)了各處理之間差異不顯著(P>0.05)的現(xiàn)象。各凋落葉處理SP含量與Pro、SS表現(xiàn)相反，各凋落葉處理SP含量均呈現(xiàn)低于T0的現(xiàn)象，且差異顯著(P<0.05)?？傮w來看，各凋落葉處理呈現(xiàn)出Pro和SS下降，SP上升的趨勢(shì)。

表4 不同量核桃凋落葉處理對(duì)豌豆的3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

3 討論

早在1937年，Molish就提出了植物在生長(zhǎng)或腐爛過程中釋放出對(duì)鄰近植物生長(zhǎng)有干擾作用的次生代謝物為化感物質(zhì)的觀點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)了核桃樹葉可釋放出后被命名為胡桃醌的5-羥基萘醌，其對(duì)草本和禾本科(Poaceae)植物有劇毒作用。本研究結(jié)果表明，核桃凋落葉在土壤中分解對(duì)豌豆的化感作用非常明顯。孫墨龍[20]等利用GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀鑒別出核桃楸樹葉中有醌類、酚類、脂類、酮類等物質(zhì)，其中醌類、酚類等大多數(shù)物質(zhì)均被證實(shí)對(duì)植物、微生物和昆蟲具有不同程度的作用?！案癄€釋放”是化感物質(zhì)進(jìn)入環(huán)境的主要途徑之一[21]，在生產(chǎn)過程中是常見的，同時(shí)也是可以避免的。許多化感物質(zhì)被釋放到土壤后并未溶解，受到土壤中的微生物、土壤酶等物質(zhì)影響后形成新的化感物質(zhì)[15,22]。如，核桃葉中含有的羥基胡桃苷在土壤中會(huì)轉(zhuǎn)化為胡桃醌。由此推斷，本試驗(yàn)中豌豆的形態(tài)和生理所受到的影響是核桃凋落葉自身所含的化感物質(zhì)以及在土壤中衍生的化感物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

在本試驗(yàn)中，核桃凋落葉的分解造成了豌豆葉片3種保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)活性的降低，同時(shí)膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量上升。這是因?yàn)楫?dāng)植物受到脅迫時(shí)，其體內(nèi)的O2-、H2O2等ROS(活性氧)含量將會(huì)增加，而積累的具有強(qiáng)氧化性的ROS首先攻擊膜系統(tǒng)，膜脂脂肪酸中的不飽和鍵被過氧化，即使細(xì)胞發(fā)生膜脂過氧化，損傷細(xì)胞產(chǎn)生MDA[23]。植物通過長(zhǎng)期進(jìn)化，建立起來一套針對(duì)ROS的防御系統(tǒng)。ROS作為一種有害物質(zhì)的同時(shí)也作為一種脅迫信號(hào)，刺激植物體內(nèi)抗逆基因的表達(dá)，使3種保護(hù)酶活性被誘導(dǎo)升高，其中SOD可歧化O2-成H2O2，POD和CAT則均能使H2O2分解成無毒的H2O和O2，從而阻止或降低ROS對(duì)膜的傷害。但是當(dāng)脅迫強(qiáng)度過高時(shí)，ROS積累過于迅速，酶活性自身受到抑制甚至鈍化將導(dǎo)致無法有效清除ROS和保護(hù)細(xì)胞[15,24]。綜合來看，核桃凋落葉分解產(chǎn)生的化感物質(zhì)對(duì)豌豆產(chǎn)生的影響已經(jīng)超出了豌豆保護(hù)酶系統(tǒng)可以調(diào)控的范圍，豌豆已經(jīng)受到比較明顯的傷害。本試驗(yàn)結(jié)果與Lu Z G等對(duì)小麥[25]的研究結(jié)果一致。但并未出現(xiàn)Zhang F J等對(duì)水稻[26]，ZUO S P等對(duì)土豆(Solanum tuberosum)[27]，張維昊對(duì)藻類[28]的研究發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象。也并未出現(xiàn)李鋒民等[29]、金瑞等[30]研究所發(fā)現(xiàn)的低促高抑現(xiàn)象。這可能是因處理方式和時(shí)間不同所致。

當(dāng)植物受到水分脅迫，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)將被大量誘導(dǎo)合成。這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)具有維持細(xì)胞正常膨壓的功能，除此之外，Pro還可以螯合單線態(tài)氧高效清除羥自由基從而清除活性氧以及保護(hù)蛋白質(zhì)、生物膜、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而保護(hù)植物細(xì)胞免受逆境脅迫傷害[31,32]。作為細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)的主要貢獻(xiàn)者，SS對(duì)脅迫下的細(xì)胞結(jié)構(gòu)還具有保護(hù)作用[33]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各處理Pro、SS含量明顯高出T0，SP含量低于T0。這可能是因?yàn)榭寡趸锩赶到y(tǒng)代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)H2O2大量積累，先激活Pro合成的谷氨酸途徑再激活鳥氨酸途徑，同時(shí)抑制Pro降解途徑，促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Pro積累量增大[34]。Pro的積累誘導(dǎo)了SS加速合成[35]。逆境條件下，植物體內(nèi)由于蛋白質(zhì)等大分子化合物降解成為了SS等物質(zhì)[36]，SS含量上升，水分脅迫使蛋白質(zhì)的合成受到抑制[37]，蛋白酶活性的提高加快了蛋白質(zhì)的水解，同時(shí)RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯受到抑制，造成SP含量減少[39]。這與朱慧等對(duì)幾種牧草[38]、楊梅對(duì)杉木[39]、陳紹莉?qū)η炎?solanum melongena)[40]的研究結(jié)果基本一致，與薛金輝[41]發(fā)現(xiàn)的Pro含量下降的研究結(jié)果不一致。這可能是因?yàn)椴煌锓N對(duì)化感物質(zhì)的響應(yīng)、承受程度的不同所導(dǎo)致。此次試驗(yàn)并未體現(xiàn)出明顯的濃度依賴，且各項(xiàng)指標(biāo)隨凋落葉施入的變化趨勢(shì)，在各次測(cè)定中的差異較以往差異大[15]。這可能是因?yàn)閷⒌蚵淙~粉碎后加入土壤，加速了化感物質(zhì)的釋放且凋落葉釋放的化感物質(zhì)大多不溶于水，從而導(dǎo)致各處理土壤溶液中的主要有毒物質(zhì)均處于飽和狀態(tài)，差異不大。又因粉碎加速了化感物質(zhì)的釋放和分解，所以3次測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)隨凋落葉的施入的變化趨勢(shì)差異較其它研究大。

本研究結(jié)果表明，核桃凋落葉在土壤中分解過程中顯著抑制了豌豆株高、根長(zhǎng)、地上部分鮮重、地下部分鮮重。這與安玉艷等[42]的研究結(jié)果基本一致。這可能是因?yàn)榛凶饔迷斐赏愣刮蘸瓦\(yùn)輸水分的能力降低。為了滿足水分的需求，將生長(zhǎng)中心向根系轉(zhuǎn)移，以便從土壤中吸收更多的水分用以維持生存。

4 結(jié)論

綜合各項(xiàng)研究結(jié)果表明，核桃凋落葉在土壤中分解，初期對(duì)豌豆造成的脅迫其能夠通過自身保護(hù)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，但是當(dāng)核桃凋落葉分解到中后期，化感物質(zhì)對(duì)豌豆細(xì)胞膜脂造成了較嚴(yán)重的損害，可能進(jìn)一步影響豌豆對(duì)水分等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和運(yùn)輸，生長(zhǎng)受到抑制。所以核桃對(duì)豌豆具有明顯的化感抑制效應(yīng)，從而推斷豌豆不適于與核桃進(jìn)行間作。