基于ITS序列的百香果宿根連作根際土壤真菌群落變化研究

陳麗珊 周紅艷 翁佩瑩 范凱 李兆偉 林偉偉

摘 要：以不同宿根年限百香果根際土壤為研究材料，運用ITS序列測序技術(shù)，揭示宿根連作對百香果根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響。結(jié)果表明：宿根連作百香果根際土壤共測得513420條有效序列，其中注釋為5346個操作分類單元（Operational Taxonomic Units， OTUs）。α多樣性指數(shù)表明，百香果根際土壤真菌群落的Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)隨宿根連作年份增加而下降。β多樣性指數(shù)表明，根際土壤正茬與重茬之間真菌群落多樣性差異比較大。在屬水平的優(yōu)勢真菌熱圖分析表明，宿根連作百香果根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)有一定差異，隨著百香果宿根年限增加，柱孢屬Cylindrocarpon和炭疽菌屬Colletotrichum的相對豐度呈上升趨勢;與之相反，被孢霉屬Mortierella、木霉菌屬Trichoderma和小不整球殼屬Plectosphaerella隨宿根年限增加而下降;其中，與有益真菌相關(guān)的被孢霉屬Mortierella相對豐度隨宿根年限增加而減少81.64%，而柱孢屬Cylindrocarpon和炭疽菌屬Colletotrichum的相對豐度隨之增加了78.57%和78.05%。因此，百香果連作障礙可能是由根際土壤生態(tài)系失衡導(dǎo)致。

關(guān)鍵詞：百香果;宿根連作;根際土壤;微生物多樣性;高通量測序技術(shù)

中圖分類號：S 344.2?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：0253-2301（2021）05-0016-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.05.004

Analysis on the Changes of Fungal Community in Rhizosphere Soil of Passiflora Eduliaby Continuous Cropping of Perennial Roots Based on ITS Sequences

CHEN Li-shan1， ZHOU Hong-yan1， WENG Pei-ying2， FAN Kai2， LI Zhao-wei3， LIN Wei-wei3*

（1. Fujian Vocational College of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350119， China; 2. College of Agriculture，

Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 3. College of Life Sciences，

Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract： By taking the rhizosphere soil of Passiflora edulia with different perennial root years as the research material， the effects of continuously ratooning on the structural changes of microbial communities in the rhizosphere soil of Passiflora edulia were revealed by using the ITS sequencing technology. The results showed that a total of 513420 effective sequences were measured in the rhizosphere soil of Passiflora edulia， among which 5346 Operational Taxonomic Units were annotated. The α diversity index showed that the Chao1 index， Observed species index， Simpson index and Shannon index of fungal communities in the rhizosphere soil of Passiflora edulia decreased with the year increase of continuous ratooning. The β-diversity index showed that the diversity of fungal communities in the rhizosphere soil was significantly different between the main crop in crop rotation and the continuous cropping. Through the heatmap analysis of dominant fungi at the genus level， there were some differences in the structures of fungal community in the rhizosphere soil of Passiflora edulia with continuously ratooning. With the year increase of perennial roots of Passiflora edulia， the relative abundance of Cylindrocarpon and Colletotrichum showed an increasing trend， while the relative abundance of Mortierella， Trichoderma and Plectosphaerella decreased with the year increase of perennial roots. Among them， the relative abundance of Mortierella related to beneficial fungi decreased by 81.64% with the year increase of perennial roots， while the relative abundance of Cylindrocarpon and Colletotrichum increased by 78.57% and 78.05%. Therefore， the obstacle for the continuous ratooning of Passiflora edulia might be caused by the ecological unbalance of the rhizosphere soil.

Key words： Passiflora edulia;Continuous cropping of perennial roots;Rhizosphere soil;Microbial diversity;High-throughput sequencing technology

百香果學名西番蓮Passifloraedulia Sims是西番蓮屬草質(zhì)藤本植物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。百香果作為我國重要經(jīng)濟作物，近年來在我國廣東、海南、福建、云南、臺灣等地進行大面積人工栽培，其中福建省百香果面積占據(jù)全國比重較大。百果香富含人體所需的氨基酸及維生素，具有良好的保健功能，且能排毒清熱、養(yǎng)顏抗衰老，深受消費者的喜愛。隨著人們對生活質(zhì)量要求的提高以及對健康認識的增強，對具有保健功能的百香果的需求也在逐年增加。為滿足廣大消費者的需求，農(nóng)民進行了大面積單一化種植栽培，同時長期大量使用化肥，導(dǎo)致土壤酸化，出現(xiàn)了連作障礙現(xiàn)象，進而使百香果的產(chǎn)量和品質(zhì)下降[2-3]。

前人研究表明，有關(guān)植物連作障礙有諸多因素，但其根本原因是土壤理化性質(zhì)惡化、營養(yǎng)狀況衰竭、土壤微生物種群失衡、有益真菌減少、各種致病真菌和土傳病害的富集[4-7]。近年來，國內(nèi)外同行一直關(guān)注土壤根際研究領(lǐng)域，以探討根際對話過程及其對植物-土壤-微生物相互作用的調(diào)控機制，研究的主要內(nèi)容包括植物長期連作后土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)失衡和微生物種群發(fā)生變化，進而導(dǎo)致植物的生長受阻問題。前人研究發(fā)現(xiàn)，連作百香果各項生理指標和光合作用下降，土壤自毒潛力增強，pH值降低，土壤酸化加劇，土壤微生從細菌型轉(zhuǎn)向真菌型，更有利于致病菌生存，最終導(dǎo)致百香果病蟲害增加、產(chǎn)量和質(zhì)量下降[8-9]。然而，從“土壤-微生物-根際”角度研究百香果連作障礙形成的根際生態(tài)機制研究尚未見相關(guān)報道。

因此，本研究運用ITS序列測序技術(shù)對百香果宿根連作障礙根際土壤中的真菌進行分析，旨在發(fā)現(xiàn)宿根連作百香果根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，以期為攻克宿根連作百香果根際土壤連作障礙的消減提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及試驗設(shè)計

試驗地位于福建省莆田市秀嶼區(qū)東莊鎮(zhèn)試驗站（25°11″N，119°16′E），該地塊土壤類型為砂壤土。試驗以廣泛種植的黃金百香果為供試品種，在2018年3月進行挖地后地植，保持苗間距為1.5 m×2 m。前人研究表明百香果第1年產(chǎn)量較高，第2年產(chǎn)量下降，病蟲害也逐年增多[8]。因此，本試驗選取宿根連作百香果根際土壤1年為正茬（HY）、2年為重茬（DY），旁邊未種植田地為對照土壤（CK）。于2020年7月百香果開花期時，在3個隨機設(shè)置試驗地塊小區(qū)里，每個試驗地按照五點取樣法采集根際土壤，每個樣品重復(fù)3次，并用1 mm的孔徑篩子篩出土壤中的雜質(zhì)，土壤保存在-80°C備用。

1.2 根際土壤DNA提取

使用杭州博日科技有限公司生產(chǎn)試劑盒，并按說明書步驟提取土壤DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。

1.3 真菌ITS1區(qū)PCR擴增及測序

真菌引物采用ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2（5′-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對真菌的ITS1區(qū)進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系和條件參考文獻[10]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

首先對原始數(shù)據(jù)進行篩選，如果序列短于200 bp，質(zhì)量分數(shù)低于20，堿基不明確或引物序列不完全匹配則不考慮該序列。然后使用QIIME對數(shù)據(jù)集進行分析[7]。利用Mothur軟件（version 1.31.2）進行α 多樣分析，用OTU信息進行聚類分析和主成分分析[8-9]，并利用tayc系數(shù)計算每個樣品中微生物群落之間的進化距離和聚類分析，描述多個樣品之間的差異性和相似性[10]。為了比較不同樣本中群落組成和結(jié)構(gòu)，使用Mothur生成了前20個OTU的熱圖。

2 結(jié)果分析

2.1 宿根連作百香果根際土壤真菌OUT的組成和結(jié)構(gòu)分析

通過測序平臺IonS5TMXL在同一區(qū)域選取3個不同百香果宿根年限的根際土壤進行測序，本研究總共獲得有效序列513420，97%相似序列的有效序OUT為5346，其中CK平均值為720個OTU，HY 平均值為588個OTU，DY平均值為473個OTU，由圖1可知，OUT的序列條數(shù)逐漸達到3000左右，曲線達高點后開始慢慢趨向平穩(wěn)，說明測序數(shù)據(jù)量合理。由圖2可以看出宿根連作百香果根際土壤真菌群落OTU組成的差異性，結(jié)果表明，在OTU水平上，CK中真菌OTU占總OTU序列數(shù)的分別21.75%（305），HY中真菌OTU占9.97%（141），DY 中真菌OTU占7.14%（101）。此外，CK與HY共有的OTU數(shù)量為671（47.45%），CK與DY共有的OTU數(shù)量為541（38.26%），HY與DY共有的OTU數(shù)量為92（6.51%），CK、HY和DY的根際土壤中共有的真菌OTU數(shù)量為547（38.68%）。

2.2 宿根連作百香果根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

對宿根連作百香果根際土壤真菌群落多樣性指數(shù)和物種豐富度進行分析，由表1可知，Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Observed species指數(shù)在CK、HY以及DY中呈現(xiàn)了逐漸下降的趨勢，且都有顯著性差異。其中CK最高，HY次之，DY最低。但是Simpson指數(shù)在HY、DY和CK之間并沒有顯著性差異。

2.3 宿根連作百香果根際土壤真菌未加權(quán)unifrac熱圖和主成分分析

由圖3可知，CK和HY真菌群落結(jié)構(gòu)聚集為一群體，然后再與DY聚集在一起，說明DY與CK和HY的根際土壤真菌存在較大差異（圖3）。進一步分析宿根連作百香果根際土壤真菌群落相關(guān)主成分1（PC1）與主成分2（PC2）兩者分別解釋方差變量的63.37%和23.79%，其中CK、HY和DY的根際微生物雖然分布在不同區(qū)間中，但是CK和HY樣品根際土壤的真菌群落組更接近（圖4）。

2.5 宿根連作百香果根際土壤真菌群落組成及結(jié)構(gòu)變化分析

由表2可知，在屬水平上，被孢霉屬Mortierella、小不整球殼屬Plectosphaerella、彎孢霉屬Curvularia、支頂孢屬Acremonium、木霉菌屬Trichoderma、曲霉菌屬Aspergillus、Saitozyma屬和Apiotrichum的根際土壤中HY比DY差異顯著提高，而除青霉菌屬Penicillium和珊瑚菌屬Corallomycetella之間差異不顯著。其中柱孢屬Cylindrocarpon、炭疽菌屬Colletotrichum、念珠菌屬Colletotrichum、毛雙孢屬Lasiodiplodia、脆柄菇屬Psathyrella和假霉樣真菌屬Pseudallescheria的根際土壤中，相比HY和CK而言DY的差異顯著提高。由圖5可知，宿根連作百香果根際土壤中前20個屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著性變化。

3 討論

靠近植物根部周圍的土壤區(qū)域叫做根際土。根際土壤生態(tài)系統(tǒng)是由植物-土壤-微生物三者有機結(jié)合，其在植物與環(huán)境相互作用過程中發(fā)揮著重要功能，并與連作障礙的產(chǎn)生有密切聯(lián)系，目前國內(nèi)外研究學者普遍認為連作障礙產(chǎn)生的主要原因為土壤根際分泌物引起微生態(tài)系統(tǒng)失衡，進而導(dǎo)致土壤營養(yǎng)成分發(fā)生變化。

因此，本研究采用ITS 序列測序技術(shù)進行分析，結(jié)果表明隨百香果宿根年限增加，根際土壤真菌群落多樣性指數(shù)逐漸降低，但Simpson指數(shù)在HY、DY和CK均沒有顯著差異（表1）。本研究獲得的結(jié)果與徐紅梅等[15]的研究結(jié)果相似，即隨著杭白芍連作年限的增加，根際土壤真菌群落多樣性相對豐度降低，同時也與劉偉等[16]通過高通量分析方法獲得的結(jié)果相一致。在本研究中，隨宿根連作年限增加，根際土壤中柱孢屬Cylindrocarpon、炭疽菌屬Colletotrichum、念珠菌屬Colletotrichum、毛雙孢屬Lasiodiplodia、脆柄菇屬Psathyrella和假霉樣真菌屬Pseudallescheria相對豐度呈增加趨勢，其中炭疽菌屬Colletotrichum和柱孢屬Cylindrocarpon的相對豐度增加了78.57%和78.05%，且HY與DY差異顯著。由此看出，百香果宿根連作后土壤中病原真菌種群數(shù)量增加，這種問題可能與根系分泌間接促進原菌的生長加劇百香果宿根連作障礙有關(guān)。這與前人研究結(jié)果一致，隨著連作年限的增加，三七和丹參連作會導(dǎo)致土壤中的致病真菌柱孢屬和炭疽菌屬相對豐度增加[16-18]。在本研究中，隨著百香果宿根連作年限增加，根際土壤中被孢霉屬Mortierella、小不整球殼屬Plectosphaerella、彎孢霉屬Curvularia、支頂孢屬Acremonium、木霉菌屬Trichoderma、曲霉菌屬Aspergillus、Saitozyma屬、Apiotrichum、青霉菌屬Penicillium和珊瑚菌屬Corallomycetella相對豐度呈減少趨勢，其中被孢霉屬相對豐度減少了81.64%，且HY與DY二者達到差異顯著。被孢霉屬對植物的生長發(fā)育起促進作用[17，19]，這個結(jié)果與三七連作相似[20]。

綜上所述，隨著百香果宿根年限增加，根際土壤中群落微生物多樣性降低和真菌微生態(tài)失衡，引起營養(yǎng)循環(huán)受阻，進而使有益拮抗真菌減少以及病原真菌增多，導(dǎo)致抗疫病能力下降，本研究認為百香果連作障礙的產(chǎn)生是根際微生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)各種因素相互作用、相互影響的綜合結(jié)果。

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（責任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-04-11

作者簡介：陳麗珊，女，1987年生，研究實習員，主要從事農(nóng)業(yè)生態(tài)學與生態(tài)補償研究。

通信作者：林偉偉，男，1984年生，博士研究生在讀，主要從事植物連作障礙及其減災(zāi)措施（E-mail：linweiwei884477@163.com）。

基金項目：國家自然科學基金項目（31500443）;莆田市秀嶼區(qū)東莊鎮(zhèn)生態(tài)農(nóng)場建設(shè)項目（KH190132A）。