小蓬竹根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

李鵬　劉濟明　文愛華

摘要：以羅甸縣小蓬竹根際土壤為研究對象，采用稀釋平板法調(diào)查土壤微生物數(shù)量，并挑選菌落形態(tài)存在差異的細(xì)菌菌株，對其16S rDNA序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，研究根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性，為小蓬竹的保護以及喀斯特山地土壤微生物多樣性研究提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。結(jié)果表明：小蓬竹根際土壤微生物數(shù)量由多到少為細(xì)菌>放線菌>真菌，干土中所含細(xì)菌、真菌、放線菌的平均數(shù)量分別為8.32×107、9.19×105、2.32×106 CFU/g。分離純化共獲得菌落表型差異的細(xì)菌41株，16S rDNA有效序列進(jìn)行Blast比對，可劃分為26個分類單元，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H為1.067 9，豐富度指數(shù)S為7，均勻度指數(shù)J為0.548 8，優(yōu)勢度指數(shù)D為0.521 7?；诩?xì)菌16S rDNA序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明：30株細(xì)菌屬于厚壁菌門（Firmicutes）（按單元種類數(shù)計算所占比例為73.17%），10株屬于變形菌門（Proteobacteria）（24.39%），1株屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）（2.44%），其中芽孢桿菌屬（Bacillus）占絕對優(yōu)勢。由結(jié)果可知，小蓬竹根際土壤中含有較為豐富的微生物多樣性。

關(guān)鍵詞：小蓬竹；根際土壤；可培養(yǎng)細(xì)菌；微生物多樣性

中圖分類號： S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0223-04

根際微生物是指存在于植物根系微區(qū)域直接影響土壤的結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)活性及土壤養(yǎng)分利用效率[1]的微生物類群，主要包括細(xì)菌、放線菌、真菌、藻類和原生動物等。根際土壤微生物具有數(shù)量龐大、種群結(jié)構(gòu)復(fù)雜、代謝旺盛、繁殖速度快等特點，推動土壤物質(zhì)與能量的流動，將土壤微生物種群、數(shù)量以及分布作為評價土壤生態(tài)環(huán)境質(zhì)量的重要指標(biāo)。根際微生物的研究越來越受到學(xué)者的重視[2-3]，國內(nèi)有關(guān)茶樹[4]（Camellia sinensis）、烤煙[5]（Nicotiana tabacum）、檳榔[6]（Semen arecae）、野生稻[7]（Oryza rufipogon）根際微生物的研究較多。但是對喀斯特地區(qū)土壤微生物種群多樣性的研究相對較少，針對于小蓬竹根際土壤微生物種群多樣性的研究更是一片空白。

小蓬竹[Drepanostachyum luodianense （Yi et R. S. Wang） Keng f.]對于喀斯特環(huán)境具有很好的生境適應(yīng)性以及較強的抗逆性，在裸露的喀斯特石山甚至懸崖上均有廣泛分布[8]。叢生的小蓬竹的枝葉可較好地覆蓋裸露的巖層，提高喀斯特地區(qū)植被的覆蓋率，其地下部分可以減少水土流失、改良土壤理化性質(zhì)，進(jìn)而提高土壤活力。在石漠化治理中關(guān)于石漠化地區(qū)植被恢復(fù)物種的選擇上，小蓬竹完全可以作為一個很好的候選物種。因此，開展小蓬竹根際微生物研究，掌握小蓬竹根際土可培養(yǎng)微生物數(shù)量及種群結(jié)構(gòu)，對于小蓬竹的保護、豐富喀斯特地區(qū)土壤和竹類微生物資源，都具有很好的理論及現(xiàn)實意義。

本研究采用稀釋平板法統(tǒng)計小蓬竹土壤微生物數(shù)量，分離純化其根際土壤中的細(xì)菌，并基于16S rDNA序列特征對分離的菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，初步獲得小蓬竹根際細(xì)菌的物種多樣性信息，以期為進(jìn)一步開展小蓬竹對惡劣的喀斯特生境適應(yīng)性與微生物關(guān)系研究和喀斯特地區(qū)微生物資源的開發(fā)利用提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 土樣的采集與處理

于2014年5月上旬，選擇小蓬竹主產(chǎn)區(qū)羅甸，該區(qū)域為典型的喀斯特丘陵地貌，小蓬竹群落分布較為典型。試驗地位于坡下位，地理位置為106°45′17″E、25°30′39″N，平均海拔757 m，土壤為典型的喀斯特石灰土，土壤肥力較高，pH值為7.68。沿等高線分別設(shè)置5個樣地（5 m×5 m），在各樣方隨機選10株竹，沿著竹基部挖取健康根系，采集土壤的深度為 5～20 cm，連同根系一起裝入無菌袋中并注明采集地點、日期、土樣號（輕輕抖動1 min，取附著根系2 mm左右的土壤為根際土）[9]。試驗所用小蓬竹根際土壤為5個樣地采集的等量混合土壤樣品，土樣冰箱低溫保存（4 ℃），以進(jìn)行微生物的分離和計數(shù)（1周內(nèi)分離）。

1.2 根際微生物的分離計數(shù)

（1）細(xì)菌分離和培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15～25 g，加水補足至1 000 mL，pH值7.4～7.6。（2）真菌分離培養(yǎng)采用馬丁氏-孟加拉紅培養(yǎng)基：KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖10 g，1/3 000孟加拉紅（Rose Bengal）100 mL，瓊脂15～20 g，加水補足至1 000 mL，pH值自然。培養(yǎng)基也可以加入青霉素，加入量為100 U/mL，同時加入慶大霉素 160 U/mL，主要是為了抑制細(xì)菌的生長，減少干擾性。（3）放線菌培養(yǎng)采用改良高氏1號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g，pH值7.4～7.6 （每300 mL培養(yǎng)基中加3%重鉻酸鉀1 mL）。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和改良的高氏1號培養(yǎng)基于121 ℃滅菌20 min，土壤微生物的分離計數(shù)每種培養(yǎng)基倒6皿，純化時每種培養(yǎng)基倒3皿，凝固成平板備用。

采用稀釋平板涂抹法，在無菌培養(yǎng)皿中倒入15～20 mL選擇性培養(yǎng)基，待凝固后，用無菌移液槍吸取0.1 mL各稀釋度的土壤懸液，不同濃度稀釋度的土壤懸液在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基和孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布培養(yǎng)。細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)2～4 d，放線菌于28 ℃培養(yǎng) 7 d，真菌于28 ℃培養(yǎng)5 d，然后進(jìn)行分離、計數(shù)（細(xì)菌和放線菌的最佳計數(shù)的菌落形成單位在30～300個之間，真菌的菌落形成單位在10～100個之間）。

1.3 細(xì)菌16S rDNA的擴增

采取購買的生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離純化的細(xì)菌基因組DNA，提取之后的DNA選用細(xì)菌通用引物（正向引物27 F；反向引物1495 R）對細(xì)菌、放線菌的16S rDNA擴增，然后采用1.2%瓊脂糖凝膠（含0.5 mg/L溴化乙錠）電泳檢測。

選用細(xì)菌通用引物[10]（正向：27 F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向：1 495 R，5′-CTACGGCTACCTTGTTALGA-3′），采用適宜的反應(yīng)條件，對16S rDNA進(jìn)行PCR擴增。正向引物27F、反向引物1 495R分別位于大腸埃希氏菌（Escherichia coli）16S rDNA序列的8～27位和1 495～1 514 位的堿基位置上。

細(xì)菌采用50 μL的PCR反應(yīng)體系：Taq PCR Master Mix 25 μL；基因組DNA模板1 μL；正向引物27F 2 μL；反向引物1495R 2 μL；Nuclease-free ddH2O 20 μL。擴增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 3 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。用1.2%瓊脂糖凝膠（含0.5 mg/L溴化乙錠）電泳進(jìn)行檢測。

1.4 16S rDNA序列分析

PCR擴增產(chǎn)物送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司 （Invitrogen） 測序，測序后登陸GenBank對比，利用GenBank通過BLAST對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，下載最相近菌株的16S rDNA序列，用Clustal X[11]按照最大同源性的原則進(jìn)行排序，采用Kimura 2（Kimura，1980）計算核苷酸差異值[12]，再采用Neighbor-Joining[13]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展數(shù)（bootstrap）為 1 000。

1.5 細(xì)菌種群的多樣性分析

定義16S rDNA、ITS rDNA序列同源性>97%作為同一分類單元[14]，采用Shannom-Wiener指數(shù)（H）、均勻度（Pielou）指數(shù)（J）、豐富度指數(shù)（S）和Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（D），分析小蓬竹根際土壤環(huán)境的微生物多樣性特征。

多樣性Shannom-Wiener指數(shù)：

H=-∑Si=1PilnPi。

式中：Pi為第i種的多度比例，可表示為Pi=Ni/N，Ni為屬i的單菌落數(shù)量，N為根際土樣的所有菌株數(shù)之和。

Pielou指數(shù)：

J=-∑Si=1PilnPi/lnS。

式中：S為分類單元，可表示為屬（種）i所在根際土壤中屬（種）的數(shù)目。

根際土壤中不同物種所起的作用及所占的地位，選用Simpson優(yōu)勢度指數(shù)表示，公式如下：

D=∑P2i。

2 結(jié)果與分析

2.1 小蓬竹根際土壤微生物數(shù)量分析

由表1可知，干土中微生物數(shù)量由多到少為細(xì)菌>放線菌>真菌，細(xì)菌在根際土壤中占絕對優(yōu)勢，占根際土壤微生物總數(shù)的96.25%。小蓬竹根際土壤中，干土中約含有細(xì)菌832×107 CFU/g，與張友杰等對烤煙不同生育期根際土壤微生物含量變化的研究（3.73×107個/g干土）結(jié)果[15]在同一數(shù)量級；約含放線菌2.32×106 CFU/g，比雍太文等對不同種植模式下小麥土壤根際微生物數(shù)量研究結(jié)果（2.3×105～3.8×105個/g 干土）結(jié)果[16]高1個數(shù)量級；約含真菌9.19×105 CFU/g，與殷瑤等對不同年齡麻瘋樹林土壤放線菌、真菌（14.68×104～22.46×104 CFU/g）的研究結(jié)果[17]在同一數(shù)量級。

2.2 小蓬竹根際土壤細(xì)菌種群多樣性分析

利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對小蓬竹根際土壤的41株細(xì)菌分離培養(yǎng)物的16S rDNA進(jìn)行測定，共獲得41條有效序列。登陸GenBank，進(jìn)行相似性對比表明，它們分屬于7屬26種。小蓬竹根際土壤細(xì)菌Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H為1067 9，豐富度指數(shù)S為7，均勻度指數(shù)J為0.548 8，及優(yōu)勢度指數(shù)D為0.521 7。土壤細(xì)菌菌株與數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌的16S rDNA具有較高的相似度，從97%到99%不等（表2）。

細(xì)菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果（圖1）顯示，所得41條有效序列主要分屬3大類群。其中30株細(xì)菌屬于厚壁菌門（Firmicutes）（按單元種類數(shù)計算所占比例為73.17%），10株屬于變形菌門（Proteobacteria）（24.39%），1株屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）（2.44%）。

厚壁菌門在小蓬竹根際細(xì)菌種類中所占比例較高，成為根際可培養(yǎng)細(xì)菌的最優(yōu)勢類群。該類群29株細(xì)菌（68.4%）均與芽孢桿菌屬（Bacillus）關(guān)系密切，細(xì)菌16S rDNA序列除B-107與Bacillus sp. CL1.8（AM934693.1）的相似度為97%外，其余均為99%，相似度極高；僅1株與動物球菌屬（Planococcus）關(guān)系密切，16S rDNA序列相似度為98%。

變形菌門為分離得到的第二大優(yōu)勢類群，其中5株與溶桿菌屬（Lysobacter spp.）關(guān)系密切，細(xì)菌16S rDNA序列相似度為99%；2株與假單胞菌屬（Pseudomonas）關(guān)系密切，16S rDNA序列相似度為99%；2株與貪銅菌屬（Cupriavidus）密切相關(guān)，16S rDNA序列相似度為99%；反1株與鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）關(guān)系密切，16S rDNA序列相似度為98%。

1株擬桿菌門（Bacteroidetes）的細(xì)菌（B-12）與金黃桿菌屬（Chryseobacterium）關(guān)系密切，16S rDNA序列相似度為99%。

3 討論

3.1 小蓬竹根際土壤微生物數(shù)量

小蓬竹根際土壤干土中所含微生物總數(shù)為8.64×107 CFU/g，總體上小蓬竹根際土壤中微生物總數(shù)較多，細(xì)菌數(shù)量占優(yōu)勢，防線菌次之、真菌數(shù)量較少?；ò粑⑸锟倲?shù)及細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量均高于小蓬竹根際土壤微生物數(shù)量[18]?；夷旧徣斯ち值赝寥牢⑸锎骸⑶?、冬季2種林地都是細(xì)菌>放線菌>真菌[19]。華菊玲等對連作芝麻根際土壤微生物群落的研究表明，新生、連作2、5年芝麻地微生物數(shù)量與本研究的微生物細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量都在同一數(shù)量級[20]。

3.2 小蓬竹根際土壤細(xì)菌多樣性

小蓬竹根際土壤細(xì)菌主要分為三大類，分別為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門。李潞濱等研究發(fā)現(xiàn)，毛竹、冷箭竹共有細(xì)菌類群厚壁菌門、變形菌門[21]，其中在毛竹的厚壁菌門方面，本研究結(jié)果與之較為相似。小蓬竹細(xì)菌類群的芽孢桿菌屬占絕對優(yōu)勢，與竹林根際可培養(yǎng)微生物種群多樣性分析結(jié)果[22]一致。雖然小蓬竹與冷箭竹（Bashania fangiana）[23]、毛竹（phyllostahys pubescens）[21]根際土壤微生物種類之間存在一定的相似性，但具有其自身特有的菌群結(jié)構(gòu)。

本研究僅采用牛肉膏蛋白胨單一培養(yǎng)基分別對小蓬竹根際土壤細(xì)菌進(jìn)行分離研究，初步揭示了小蓬竹根際土壤特有生境中微生物種群的組成特征，但仍然存在一定的局限性。應(yīng)采用多種有效的培養(yǎng)基對土壤樣品進(jìn)行更為全面的分離培養(yǎng)，將充分了解小蓬竹根際可培養(yǎng)微生物細(xì)菌種群的完整信息。此外，由于自然環(huán)境中大部分微生物不能通過常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法研究土壤微生物區(qū)系將導(dǎo)致微生物多樣性嚴(yán)重丟失[24]。對于小蓬竹根際土壤未培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的微生物，非常有必要采用不依賴純培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法，以獲取更全面的小蓬竹根際微生物多樣性信息。

參考文獻(xiàn)：

[1]Schippers B. Interaction of deleterious and beneficial rhizosphere microorganisms and the effect of cropping practices[J]. Ann Rev Phytopathel，1987，25（3）：339-358.

[2]Hartmann A，Schmid M，Tuinen D，et al. Plant-driven selection of microbes[J]. Plant and Soil，2009，321（1/2）：235-257.

[3]章家恩，劉文高，胡 剛. 小同土地利用力式下土壤微生物數(shù)量與土壤肥力的關(guān)系[J]. 土壤與環(huán)境，2002，11（2）：140-143.

[4]孫海新，劉訓(xùn)理. 茶樹根際微生物研究[J]. 生態(tài)學(xué)報，2004，24（7）：1353-1357.

[5]湛方棟，陸引罡，關(guān)國經(jīng)，等. 烤煙根際微生物群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化的研究[J]. 土壤學(xué)報，2005，42（3）：488-494.

[6]余鳳玉，朱 輝，王 萍，等. 檳榔根際微生物研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，22（11）：26-27，31.

[7]戴 菲. 東鄉(xiāng)普通野生稻根際微生物群落特征的研究[D]. 南昌：江西師范大學(xué)，2011.

[8]徐雪嬌，劉濟明，徐國瑞，等. 不同小生境中小蓬竹的含水率及生物量分配規(guī)律[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（10）：163-166.

[9]Courchesne F，Gobran G R. Mineralogical variations of bulk and rhizosphere soils from a Norway spruce stand[J]. Soil Science Society of America Journal，1997，61（4）：1245-1249.

[10]Stackbrandt E，Ludwig W，F(xiàn)ox G E，et al. 16S ribosomal RNA oligonucleotide cataloging[J]. Methods in Microbiology，1985，18：75-107.

[11]Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al. The CLUSTAL_X Windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research，1997，25（24）：4876-4882.

[12]Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences[J]. Journal of Molecular Evolution，1980，16（2）：111-120.

[13]Saitou N，Nei M. The neighbor-joining method：a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology and Evolution，1987，4（4）：406-425.

[14]Mccaig A E，Glover L A，Prosser J I. Molecular analysis of bacterial community structure and diversity in unimproved and improved upland grass pastures[J]. Applied and Environmental Microbiology，1999，65（4）：1721-1730.

[15]張友杰，劉國順，葉協(xié)鋒，等. 烤煙不同生育期土壤酶及微生物活性的變化[J]. 土壤，2010，42（1）：39-44.

[16]雍太文，楊文鈺，向達(dá)兵，等. 不同種植模式對作物根系生長、產(chǎn)量及根際土壤微生物數(shù)量的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2012，23（1）：125-132.

[17]殷 瑤，谷 勇，熊 智，等. 不同年齡麻瘋樹林地土壤微生物多樣性研究[J]. 土壤通報，2011，42（6）：1350-1354.

[18]韓艷潔，李全基，袁秀英，等. 花棒根際土壤微生物研究[J]. 干旱區(qū)資源與環(huán)境，2012，26（3）：164-167.

[19]韋善華，呂成群，黃寶靈，等. 灰木蓮人工林地土壤微生物及酶活性分析[J]. 林業(yè)科技開發(fā)，2012，26（5）：59-62.

[20]華菊玲，劉光榮，黃勁松. 連作對芝麻根際土壤微生物群落的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報，2012，32（9）：2936-2942.

[21]李潞濱，劉 敏，楊淑貞，等. 毛竹根際可培養(yǎng)微生物種群多樣性分析[J]. 微生物學(xué)報，2008，48（6）：772-779.

[22]劉 敏. 竹林根際可培養(yǎng)微生物種群多樣性分析[D]. 保定：河北大學(xué)，2008.

[23]劉 敏，李潞濱，楊 凱，等. 冷箭竹根際土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性[J]. 生物多樣性，2008，16（1）：91-95.

[24]王岳坤，洪 葵. 紅樹林土壤細(xì)菌群落16S rDNA V3片段PCR產(chǎn)物的DGGE分析[J]. 微生物學(xué)報，2005，45（2）：201-204.