一株抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生細(xì)菌的分離及鑒定

殷杰+王蒙+曾小波+馬志勇+程國軍

摘要：從根際土壤分離到一株細(xì)菌CY04，通過電鏡觀察和16S rDNA 序列分析，發(fā)現(xiàn)該菌株同已知菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的相似度最高，為99%， 初步認(rèn)定為枯草芽孢桿菌。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有一定的抑菌活性，對大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌沒有抑菌活性。培養(yǎng)48 h左右是其產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的最佳時(shí)期。

關(guān)鍵詞：根際土壤;枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）;鑒定;抑菌活性

中圖分類號(hào)：Q936 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）02-0346-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.022

Isolation and Identification of One Strain Producing Antimicrobial Active Substance

YIN Jie，WANG MENG，ZENG Xiao-bo，MA Zhi-yong，CHENG Guo-jun

（College of Life Science， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074， China）

Abstract：A bacterium strain， designated as CY04， was isolated from the rhizosphere soil. The strain CY04 had the highest sequence identity with Bacillus subtilis （99%）. Based on morphological characteristics and analysis of the 16S rDNA sequence， ?the strain CY04 was identified as Bacillus subtilis. The antagonistic effects showed that CY04 had antimicrobial activity on Staphylococcus aureus， but had little inhibition on Escherichia coli and Bacillus subtilis. The optimal time for the resistant bacteria to produce antimicrobial active substance was 48h after cultivation.

Key words： rhizosphere soil;Bacillus subtilis;identification;antimicrobial activity

隨著有害生物耐藥性問題的加劇，微生物產(chǎn)生的活性成分物質(zhì)在人類疾病防治、動(dòng)物醫(yī)藥保健、植物抗病害及食品防腐等方面表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）通過產(chǎn)生多種抗菌代謝產(chǎn)物，能有效抑制病原菌并促進(jìn)動(dòng)植物生長，具有較高的工業(yè)、農(nóng)業(yè)以及醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值[1]，同時(shí)，枯草芽孢桿菌也被認(rèn)為是潛在的益生菌[2]。

目前已知枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，包括細(xì)菌素、脂肽類抗生素以及酶類、蛋白類抑菌物質(zhì)等[3]。從枯草芽孢桿菌中分離的Fengycin能夠抑制多種重要植物病原真菌的生長[4]。本研究從根際土壤樣品中分離到一株能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的細(xì)菌CY04，并根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和16S rDNA基因序列對其進(jìn)行了鑒定，初步認(rèn)定其為枯草芽孢桿菌，同時(shí)對它的拮抗情況及產(chǎn)生原因進(jìn)行了探討。

1 ?材料與方法

1.1 ?抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌種的篩選

在帶有玻璃珠的三角瓶中加入根際土樣1 g和99 mL蒸餾水，放置于28 ℃搖床內(nèi)振蕩30 min，取樣做梯度稀釋后，用其涂布牛肉膏蛋白胨平板，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，從中分離出細(xì)菌單株;以金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為檢測菌，采用紙片法進(jìn)行菌株篩選，并對產(chǎn)生活性物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2 ?CY04細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)和電鏡觀察

在LB平板上觀察菌落形態(tài)，利用革蘭氏染色法在油鏡下觀察菌體形態(tài)。將菌株用戊二醛固定，PBS洗滌和梯度乙醇脫水，真空冷凍干燥機(jī)干燥，掃描電鏡觀察、拍照。電鏡放大倍數(shù)15 000。

1.3 ?CY04細(xì)菌16S rDNA基因序列測定和系統(tǒng)進(jìn)化分析

用LB培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)菌體至對數(shù)期，離心后收集菌體，抽提細(xì)菌基因組的總DNA。以CY04菌株基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rDNA基因片段[5]。擴(kuò)增引物選用細(xì)菌通用PCR引物16S-F（5′AAGGAGGTGATCCAGCC3′）、16S-R（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30次循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，克隆到pMD18-T載體[寶生物工程 （大連）有限公司]，經(jīng)酶切和PCR驗(yàn)證后，送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較分析。采用Bioedit和MAGE 4.0軟件以鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[6]。endprint

1.4 ?菌株CY04對不同指示菌拮抗能力的測定

以大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌為指示菌，采用牛津杯（內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm）法測定菌株CY04對不同指示菌拮抗能力[7]。取已活化的指示菌菌液接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37 ℃、20 r/min培養(yǎng)24 h。倒牛肉膏蛋白胨平板，在每個(gè)平板的中央置一個(gè)已滅菌的牛津杯，吸取指示菌菌懸液在平板上均勻涂布，待平板晾干后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。將CY04菌株培養(yǎng)液離心，取上清液加入到牛津杯中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察生長情況并測量抑菌圈直徑。

將活化后的菌株CY04按2%的接種量接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，每隔6 h取菌液離心，將上清液加入到牛津杯中，測定其對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑，確定產(chǎn)生活性物質(zhì)的最佳時(shí)期。

1.5 ?菌株CY04的抗性測定

以抗生素卡那霉素（Km）、氨芐青霉素（Ap）、鏈霉素（Str）、四環(huán)素（Tc）、慶大霉素（Gm）、氯霉素（Cm）、壯觀霉素（Spe）為抗生活性物質(zhì)，測定菌株CY04對抗生活性物質(zhì)的抗性。將菌株CY04接種到LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。按2%的接種量將菌株接種于含不同濃度抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床（200 r/min）振蕩培養(yǎng)48 h，測定含各種不同濃度抗生活性物質(zhì)菌液的吸光度，分析菌株CY04生長情況。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?菌株CY04篩選及形態(tài)觀察

進(jìn)行細(xì)菌單株分離、篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株CY04對金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的拮抗作用。菌株CY04革蘭氏染色為陽性，產(chǎn)芽孢，其形態(tài)特征見圖1。細(xì)菌大小為0.3～0.5 μm×1.5～3.0 μm。

2.2 ?菌株CY04的16S rDNA測序結(jié)果

以菌株CY04的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得1.5 kb左右的特異性片段，將測序結(jié)果和GenBank已登錄的序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)與Bacillus中多個(gè)種的序列具有高度同源性;與Bacillus subtilis同源性最高，達(dá)到99%。

2.3 ?菌株CY04的系統(tǒng)進(jìn)化樹

選取同源性較高的菌株，以菌株CY04的16S rDNA序列用MEGA軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出菌株CY04與Bacillus subtilis細(xì)菌遺傳距離最近，相似度達(dá)到99%，而與Bacillus licheniformis距離相對較遠(yuǎn)。依據(jù)形態(tài)學(xué)和同源性比對結(jié)果，判斷所分離的活性物質(zhì)產(chǎn)生菌株CY04為Bacillus subtilis。在系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于Bacteria界Firmicutes門 Bacilli綱Bacillales目Bacillaceae科 Bacillus屬Bacillus subtilis種。

2.3 ?菌株CY04的抑菌活性

采用牛津杯法對菌株CY04的抑菌譜試驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，對革蘭氏陰性菌大腸桿菌沒有抑制作用，對革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌也沒有抑制作用，對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用，其抑菌圈達(dá)到14.2 mm。說明菌株CY04分泌的活性物質(zhì)主要針對革蘭氏陽性菌的某些類群，具有較強(qiáng)的特異性。菌株CY04對革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌沒有拮抗作用，可能是因?yàn)镃Y04為芽孢桿菌，其產(chǎn)物不會(huì)對同類型菌株產(chǎn)生傷害。

2.4 ?菌株CY04代謝活性物質(zhì)產(chǎn)生時(shí)期的測定

每隔6 h取樣進(jìn)行抑菌圈測定發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)48 h左右培養(yǎng)液產(chǎn)生的抑菌圈最大，進(jìn)而可以推斷菌株CY04在48 h左右產(chǎn)生的活性物質(zhì)最多，其產(chǎn)生活性物質(zhì)的時(shí)間在其生長穩(wěn)定后期，這與已有的報(bào)道一致[1]。

2.5 ?菌株CY04的抗性

菌株CY04的抗性的檢測結(jié)果（表1）表明，除壯觀霉素對菌株CY04的最小抑菌濃度達(dá)到20 μg/mL外，其他抗生素的最小抑菌濃度均較低，說明菌株CY04對其他抗生活性物質(zhì)的抗性均較低。一般具有活性物質(zhì)抗性的細(xì)菌在環(huán)境中與土著微生物競爭具有一定優(yōu)勢，CY04菌株較低的活性物質(zhì)抗性，不利于其在環(huán)境中生存。CY04菌株自身產(chǎn)生具有拮抗作用的抗生活性物質(zhì)，是一種有效防衛(wèi)機(jī)制，使其在種間競爭中戰(zhàn)勝其他微生物保存自己。

3 ?小結(jié)與討論

微生物殺菌劑具有高效、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，因而有廣闊的應(yīng)用前景。枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)已有相關(guān)報(bào)道[8-10]。本研究從根際土壤中分離到的細(xì)菌菌株CY04根據(jù)形態(tài)學(xué)特征以及16S rDNA序列比較鑒定為枯草芽孢桿菌。菌株CY04對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌沒有抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑制作用較明顯，說明CY04產(chǎn)生的抗生活性物質(zhì)具有選擇性毒力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CY04對除壯觀霉素外的其他幾種抗生素的抗性均較低，表明CY04菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，是其能夠在環(huán)境中生存的有效防衛(wèi)機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1] 張 ?歡，叢麗娜，侯英敏，等.海洋枯草芽孢桿菌HS-A38產(chǎn)直鏈脂肽活性物質(zhì)的初步檢測[J].海洋科學(xué)，2011，35（8）：31-42.

[2] STEIN T. Bacillus subtilis antibiotics： Structures， synthesesand specific functions[J]. Mol Microbiol， 2005，56（4）： 845-857.

[3] 趙新林，趙思峰.枯草芽孢桿菌對植物病害生物防治的作用機(jī)理[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（15）：3025-3027.

[4] 陳 ?華，袁成凌，蔡克周，等.枯草芽孢桿菌JA產(chǎn)生的脂肽類抗生素-iturinA的純化及電噴霧質(zhì)譜鑒定[J].微生物學(xué)報(bào)，2008， ?48（1）：116-120.

[5] SAMBROOK J， FRITSCH EF， MANIATIS T. Molecular Cloning： A Laboratory Manual[M]. 2nd editon. New York： Cold Spring Harbor Laboratory，1989.

[6] KUMAR S， TAMURA K， NEI M. MEGA3： Integrated software formolecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J]. Briefings in Bioinformatics， 2004，5（2）：150-163.

[7] 劉冬梅，李 ?理，楊曉泉，等.用牛津杯法測定益生菌的抑菌活力[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（3）：110-111.

[8] 劉 ?靜，王 ?軍，姚建銘，等.枯草芽孢桿菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分離純化[J].微生物學(xué)報(bào)，2004，44（4）：511-513.

[9] 崔堂兵，劉煜平，郭 ?勇，等.枯草芽孢桿菌培養(yǎng)生產(chǎn)農(nóng)用抗真菌素初步研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（1）：51-54.

[10] 李文卓，侯紅漫，張公亮.枯草芽孢桿菌CG的抑菌物質(zhì)的研究[J].食品研究與開發(fā)，2013，34（18）：82-85.endprint