幾種牧草根際土壤微生物功能多樣性分析

楊煒迪++高婷++朱建寧+++王錦++王川

摘要：以寧夏中部干旱帶引進(jìn)的適生牧草品種（710、708、376、859）和蒙古冰草根際微生物為研究對(duì)象，采用 Biolog-Eco方法研究了5種牧草的根際微生物群落功能的多樣性。結(jié)果表明：5種不同牧草根際土壤微生物活性存在差異；利用羧酸類、碳水化合物最多的是牧草376，利用聚合物類、酚類化合物、氨基酸類最多的是708，利用胺類最多的是蒙古冰草；5個(gè)品種主要利用碳源類型為碳水化合物、羧酸類和氨基酸類。豐富度指數(shù)與優(yōu)勢(shì)度指數(shù)結(jié)果相似，為859≥蒙古冰草≥710>708>376；多樣性和均勻度指數(shù)結(jié)果一致，為蒙古冰草>859>708>376>710；主成分分析將5種品種分為3個(gè)功能類群，376和708為一類，859和蒙古冰草為同一類，710為一類；載荷矩陣表明5中牧草品種在羧酸和氨基酸利用上差異最大。

關(guān)鍵詞：Biolog-Eco；根際土壤；功能多樣性；牧草

中圖分類號(hào)： S154.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0360-04

收稿日期：2015-08-13

項(xiàng)目基金：寧夏農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新先導(dǎo)資金（編號(hào)：NKYJ-2014-11）；寧夏自然科學(xué)基金（編號(hào)：NZ1073）。

作者簡(jiǎn)介：楊煒迪（1983—），女，河南偃師人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)槟敛萦N。E-mail：12345ywol@163.com。

通信作者：高婷，碩士，研究員，研究方向?yàn)槟敛菪缕贩N選育。E-mail：ecogt9@163.com。根際是指植物根周圍數(shù)毫米的區(qū)域[1]，此區(qū)域中根分泌物為微生物提供重要的營(yíng)養(yǎng)和能量物質(zhì)并影響著根際微生物的種類和繁殖，而根際微生物的代謝作用又直接促進(jìn)或抑制根的營(yíng)養(yǎng)吸收和生長(zhǎng)，從而影響根際土壤中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化[2]。Biolog-Eco 法是在微生物利用31種碳底物時(shí)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，通過(guò)顏色變化情況來(lái)反映微生物碳源利活性的方法[3-4]。該技術(shù)廣泛應(yīng)用在評(píng)價(jià)和比較不同土壤類型[5]、相同土壤不同植物物種[6]、不同植被的根際土壤微生物群落功能多樣性[7]。本研究以4種美國(guó)引進(jìn)牧草和蒙古冰草的根際微生物為研究對(duì)象，應(yīng)用 Biolog-Eco方法，對(duì)不同牧草品種根際土壤微生物代謝功能多樣性進(jìn)行比較研究，旨在探討不同牧草品種根際微生物代謝功能多樣性之間的差異，研究結(jié)果可為深入探討植物多樣性和土壤微生物多樣性之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地設(shè)在寧夏吳忠市鹽池縣高沙窩的天然草場(chǎng)。草地類型為荒漠草原，植被稀疏且草層低矮，主要植被類型為蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng.）、糙隱子草（Cleistagenes squarrosa）、胡枝子（Lespedeza bicolor Turcz.）、老瓜頭（Cynanchum komarovii Al.）、甘草（Glycyrrhiza）、細(xì)葉駱駝篷（Peganum nigellastrum）、銀灰旋花（Convolvulus ammannii Desr.）。蓋度為17%～30%，種類組成貧乏。該區(qū)屬于典型的大陸性氣候，春季干旱多風(fēng)，夏季炎熱，年均降水量260.75 mm，主要集中在7—9月，月平均溫度最高月為6月（23.5 ℃）、7月（24 ℃）和8月（20.5 ℃），土壤為風(fēng)沙土，土壤有機(jī)質(zhì) 1.4%～7.5%，pH值9.08～9.22。

1.2牧草品種

本試驗(yàn)選取4個(gè)引進(jìn)美國(guó)品種（710、708、376、859）和本地優(yōu)勢(shì)品種蒙古冰草開(kāi)展研究。710品種耐寒性、耐旱、耐高溫能力強(qiáng)；708粗蛋白質(zhì)含量高、干草產(chǎn)量高；376青綠期長(zhǎng)、適口性好；859株高大、鮮草產(chǎn)量高；蒙古冰草植株高大，生長(zhǎng)速度快。

1.3播種

將美國(guó)引進(jìn)的牧草品種，隨機(jī)排列，小區(qū)面積為25 m2，行距25 cm，對(duì)試驗(yàn)地隔帶深翻后，于2011年4月28日至5月1日播種，深翻比例介于30%～80%，每品種重復(fù)3 次。取樣時(shí)引進(jìn)牧草品種生長(zhǎng)年限為4年。

1.4土壤采集

6月下旬在鹽池縣高沙窩天然草場(chǎng)對(duì)5種牧草品種按五點(diǎn)取樣法選取牧草植株，每點(diǎn)每品種取3～5株，重復(fù)3次。將根系區(qū)域土樣用鐵鏟挖出，抖落根系外圍土，取緊貼于根表周圍的土樣。將土樣裝入無(wú)菌紙袋，標(biāo)記，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，研磨過(guò)1 mm篩后于4 ℃冰箱保存。

1.5牧草根際土壤微生物群落功能多樣性研究

Biolog-Eco分析：本研究采用有31 種碳源的生態(tài)板（規(guī)格為EcoPlate，由Biolog 公司生產(chǎn)，華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司提供）分析微生物群落的代謝特征。每品種土樣均勻混合后按照四分法稱取10 g，加入90 mL無(wú)菌生理鹽水稀釋，在搖床里振搖30 min，靜止沉淀3～5 min，然后進(jìn)行100倍稀釋，以每孔150 μL稀釋液加入微孔板中，將制備好的菌懸液倒入無(wú)菌移液槽中，使用八孔移液器將其接種于微平板的96孔中。接種好的微平板放到鋪有6層紗布的塑料飯盒中，為防止微平板鑒定孔中的菌懸液揮發(fā)，紗布保持一定的濕度。塑料飯盒用保鮮膜包裹，保鮮膜上用注射針頭扎若干個(gè)小眼，以保證微生物的培養(yǎng)所需要的氧氣，將微平板避光培養(yǎng)。ECO生態(tài)板放到30 ℃恒溫培養(yǎng)。分別于24、48、72、96、120、168 h時(shí)讀數(shù)，測(cè)定波長(zhǎng)為590 nm。

2結(jié)果與分析

2.1不同牧草品種AWCD變化及利用碳源分析

從圖 1 可知，5種牧草品種根際微生物群落利用碳源量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。每種牧草根際土壤的 AWCD 值在 24 h 內(nèi)變化不明顯，表明該時(shí)期根際微生物活性較低，碳源利用很少；在 24 h 之后顯著增加，碳源利用明顯。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，各品種根際微生物 AWCD 值存在差異，培養(yǎng)168 h 時(shí)，總碳源AWCD值為708>710>376>蒙古冰草>859。羧酸類AWCD值為376>710>708>859>蒙古冰草，聚合物類AWCD值為708>710>376>859>蒙古冰草，碳水化合物AWCD值為376>708>710>蒙古冰草>859，酚類AWCD值為708>376>710>859>蒙古冰草，胺類AWCD值為蒙古冰草>376>708>710>859，氨基酸類AWCD值為708>710>376>蒙古冰草>859，5種牧草主要利用碳源為碳水化合物、氨基酸和羧酸類。

2.2牧草品種根際微生物群落功能多樣性分析

本研究采用豐富度、優(yōu)勢(shì)度、多樣性指數(shù)和均勻度來(lái)比較5個(gè)牧草品種的土壤根際微生物群落利用31種碳源的多樣性。豐富度指數(shù)表示被利用的碳源種類多少，優(yōu)勢(shì)度指數(shù)可反映出土壤群落中最常見(jiàn)的物種，多樣性指數(shù)反映微生物群落物種的變化度和差異度，均勻度為群落物種豐富度與均一性的度量。由表1可知，豐富度與優(yōu)勢(shì)度指數(shù)為859≥蒙古冰草≥710>708>376；多樣性指數(shù)與均勻度分析結(jié)果一致，蒙古冰草>859>708>376>710，說(shuō)明859、蒙古冰草根際微生物群落中某些優(yōu)勢(shì)菌生長(zhǎng)旺盛。以上研究結(jié)果表明蒙古冰草根際微生物群落種類最多且較均勻。

2.3不同牧草品種根際微生物群落功能多樣性主成分分析

采用主成分分析比較5個(gè)品種根際微生物群落功能多樣性（表2）。總變異的100%為前4個(gè)主成分，即包含全部變異信息。總變異的48.36%、21.73%分別來(lái)自第1、第2主成分，故第1、第2主成分為變異主要來(lái)源。利用這2個(gè)主成分將微生物群落代謝功能劃分成3個(gè)功能類群（圖2），376和708土壤根際微生物群落為同一類，710品種土壤根際微生物群落為同一類，859和蒙古冰草土壤根際微生物群落為同一類，空間差異較大。

因子載荷矩陣表明（表3），因子1主要由x（30）、x（15）、x（25）起分異作用，對(duì)應(yīng)的碳源為D-蘋果酸、L-絲氨酸、L-磷酸葡萄糖；因子2主要由x（19）、x（18）、x（27）起分異作用，對(duì)應(yīng)的碳源為L(zhǎng)-蘇氨酸、γ-羥丁酸、苯乙胺。5種牧草根際微生物群落在以上6種碳源利用上差異最大，主要為羧酸類和氨基酸類。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)Biolog-Eco微平板方法證實(shí)了5種不同牧草的根際土壤微生物在代謝活性、不同碳源利用、微生物多樣性指數(shù)等方面均有自身特征并存在差異，說(shuō)明不同牧草品種在退化土壤生態(tài)環(huán)境的修復(fù)中提供不同作用，導(dǎo)致這種差異的主要因素是牧草品種、植物殘?bào)w、根系分泌物等方面[11]。畢江濤等研究表明，荒漠草原 5 種植被類型土壤微生物群落代謝活性和利用碳源種類都存在差異[12]；安韶山等對(duì)寧南山區(qū)9種典型植物根際微生物研究表明微生物活性（AWCD）、微生物多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)均存在明顯差異[8]。利用Biolog-Eco[9-10]、16S rRNA 分析[13]、PCR-DGGE[14]等方法開(kāi)展的研究均顯示不同植被類型、同一植物不同品種或不同基因型間以及同一基因型不同發(fā)育時(shí)期的根際土壤微生物多樣性都有所不同。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同牧草根際土壤的AWCD在24 h內(nèi)變化不大，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，其利用碳源量也不斷增加，與諸多文獻(xiàn)結(jié)果[8，15-16]一致，708、376、710的根際土壤微生物代謝活性較強(qiáng)，蒙古冰草和859根際土壤微生物代謝活性較弱。各品種在各類碳源利用上存在差異，利用羧酸類、碳水化合物最多的是376，利用聚合物類、酚類化合物、氨基酸類最多的是708，利用胺類最多的是蒙古冰草，5個(gè)牧草品種主要利用碳源類型為碳水化合物、羧酸類和氨基酸類，與吳則焰等研究的武夷山各植被類型土壤微生物利用主要碳源類型[7]一致。另外，鄭華等研究表明4種森林類型土壤微生物群落比較偏好、利用率較高的3類碳源是糖類、羧酸類和氨基酸類[5]。根際微生物群落功能多樣性分析表明，5種牧草的豐富度和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)結(jié)果相似，多樣性和均勻度指數(shù)結(jié)果一致，向澤宇等研究表明，土壤微生物群落多樣性與均勻度指數(shù)也表現(xiàn)出相似規(guī)律[17]。蒙古冰草根際微生物群落種類最多且較均勻，原因可能是蒙古冰草與其他牧草品種生長(zhǎng)年限不同[18-19]，且蒙古冰草為原生植被，而其他4個(gè)品種為人工種植的牧草品

種[20]；859和蒙古冰草根際微生物群落中某些優(yōu)勢(shì)菌生長(zhǎng)旺盛，利用碳源類型較其他3個(gè)品種多。

5個(gè)品種根際微生物主成分分析將5個(gè)品種土壤根際微生物群落碳代謝功能分為3類，376和708為同一類，710品種為一類，859和蒙古冰草為同一類，與各品種碳源代謝活性

和根際微生物群落功能多樣性分析結(jié)果一致。林青等研究發(fā)現(xiàn)新疆富蘊(yùn)地震斷裂帶6種次生植物根際土壤微生物碳源利用差異主要體現(xiàn)在糖類、氨基酸類、羧酸類[16]。因子載荷矩陣表明，5種牧草根際微生物群落主要在羧酸和氨基酸的利用上差異最大。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉芷宇，施衛(wèi)明. 根際研究方法[M]. 南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1996：308-327.

[2]王茹華，張啟發(fā)，周寶利，等. 淺析植物根分泌物與根際微生物的相互作用關(guān)系[J]. 土壤通報(bào)，2007，38（1）：167-172.

[3]Garland J L，Mills A L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization[J]. Applied and Environmental Microbiology，1991，57（8）：2351-2359.

[4]田雅楠，王紅旗. Biolog法在環(huán)境微生物功能多樣性研究中的應(yīng)用[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2011，34（3）：50-57.表3因子載荷矩陣

類別碳源類型因子1因子2因子3因子4x（1）β-甲基-D-葡萄糖苷0.892 5-0.115 70.236 80.365 9x（2）D-半乳糖酸γ-內(nèi)酯0.004 5-0.704 1-0.172 30.688 9x（3）L-精氨酸0.167 8-0.829 30.376 70.377 1x（4）丙酮酸甲酯0.582 2-0.026 60.760 9-0.285 1x（5）D-木糖/戊醛糖0.831 3-0.550 80.014 20.072 8x（6）D-半乳糖醛酸0.393 4-0.905 9-0.121 4-0.098 9x（7）L-天門冬酰胺0.273 3-0.604 20.429 00.613 3x（8）吐溫 400.015 2-0.910 20.074 10.407 3x（9）赤蘚糖醇0.274 4-0.350 90.895 3-0.002 2x（10）2-羥基苯甲酸-0.510 50.853 3-0.102 20.028 8x（11）L-苯丙氨酸-0.090 10.688 50.258 60.671 5x（12）吐溫 80-0.099 6-0.966 40.236 9-0.004 0x（13）D-甘露醇0.515 0-0.813 20.271 1-0.000 6x（14）4-羥基苯甲酸0.931 7-0.338 60.127 70.030 4x（15）L-絲氨酸0.976 7-0.136 5-0.164 80.011 2x（16）α-環(huán)式糊精-0.131 00.232 80.896 60.353 1x（17）N-乙酰-D葡萄糖氨0.911 8-0.271 20.247 70.183 4x（18）γ-羥丁酸-0.183 40.919 4-0.290 7-0.191 4x（19）L-蘇氨酸-0.144 70.926 10.347 80.019 0x（20）肝糖0.543 90.148 30.822 40.075 9x（21）D-葡糖胺酸0.509 6-0.160 60.619 00.575 6x（22）衣康酸0.551 7-0.016 9-0.821 00.146 1x（23）甘氨酰-L-谷氨酸0.598 70.401 3-0.037 20.692 2x（24）D-纖維二糖0.826 4-0.486 40.154 80.237 5x（25）1-磷酸葡萄糖0.939 5-0.276 3-0.202 10.005 0x（26）α-丁酮酸0.257 00.477 9-0.832 6-0.110 7x（27）苯乙胺-0.284 60.912 10.137 30.261 2x（28）α-D-乳糖-0.040 4-0.123 00.040 90.990 7x（29）D，L-α-磷酸甘油0.641 5-0.139 40.009 90.754 3x（30）D-蘋果酸0.978 1-0.137 8-0.090 3-0.126 7x（31）腐胺0.828 20.252 50.487 90.110 8

[5]鄭華，陳法霖，歐陽(yáng)志云，等. 不同森林土壤微生物群落對(duì)Biolog-GN板碳源的利用[J]. 環(huán)境科學(xué)，2007，28（5）：1126-1130.

[6]李世朋，蔡祖聰，楊浩. 不同植被下紅壤性質(zhì)對(duì)細(xì)菌碳源利用的影響[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2008，14（6）：793-797.

[7]吳則焰，林文雄，陳志芳，等. 武夷山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)不同植被類型土壤微生物群落特征[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，24（8）：2301-2309.

[8]安韶山，李國(guó)輝，陳利頂. 寧南山區(qū)典型植物根際與非根際土壤微生物功能多樣性[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，31（18）：5225-5234.

[9]Grayston S J，Wang S Q，Campbell C D，et al. Selective influence of plant species on microbial diversity in the rhizosphere[J]. Soil Biology & Biochemistry，1998，30（3）：369-378.

[10]張萌萌，敖紅，張景云，等. 建植年限對(duì)紫花苜蓿根際土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 草業(yè)科學(xué)，2014，31（5）：787-796.

[11]Kowalchuk G A，Buma D S，De Boer W，et al. Effects of above-ground plant species composition and diversity on the diversity of soil-borne microorganisms[J]. Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology，2002，81（1/2/3/4）：509-520.[12]畢江濤，賀達(dá)漢，沙月霞，等. 荒漠草原不同植被類型土壤微生物群落功能多樣性[J]. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2009，27（5）：149-155.

[13]Kaiser O，Puhler A，Selbitschka W. Phylogenetic analysis of microbial diversity in the rhizoplane of oilseed rape （Brassica napus cv. Westar） employing cultivation-dependent and cultivation-independent approaches[J]. Microbial Ecology，2001，42（2）：136-149.

[14]Smalla K，Wieland G，Buchner A，et al. Bulk and rhizosphere soil bacterial communities studied by denaturing gradient gel electrophoresis：Plant-dependent enrichment and seasonal shifts revealed[J]. Applied and Environmental Microbiology，2001，67（10）：4742-4751.

[15]張海涵，唐明，陳輝，等. 黃土高原5種造林樹(shù)種菌根根際土壤微生物群落多樣性研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（3）：85-90.

[16]林青，曾軍，馬晶，等. 新疆地震斷裂帶次生植物根際土壤微生物碳源利用[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，22（9）：2297-2302.

[17]向澤宇，張莉，張全發(fā)，等. 青海不同林分類型土壤養(yǎng)分與微生物功能多樣性[J]. 林業(yè)科學(xué)，2014，50（4）：22-31.

[18]曹成有，姚金冬，韓曉姝，等. 科爾沁沙地小葉錦雞兒固沙群落土壤微生物功能多樣性[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，22（9）：2309-2315.

[19]王陽(yáng)，王奇贊. 種植年限對(duì)大棚蔬菜地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，25（3）：567-576.

[20]熊毅，郭彥萃，張志. 原始紅松林與人工林土壤微生物多樣性分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，26（1）：159-164.單愛(ài)琴，肖潔，楊秀婧. 四氯化碳與四氯乙烯復(fù)合污染對(duì)土壤呼吸率的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：364-367.