廣藿香根際土壤微生物總DNA提取方法的優(yōu)化

徐巖　吳友根　張軍鋒　楊東梅　胡新文

摘要：提取高質(zhì)量的土壤微生物DNA是進行后續(xù)分子生物學試驗的前提。在3種常用土壤微生物DNA提取方法的基礎上，提出了1種新的優(yōu)化方案，包括使用添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的磷酸緩沖液對土壤進行預洗、聯(lián)合使用SDS-CTAB和蛋白酶K來破碎細胞、用酚-氯仿-異戊醇（25 ∶24 ∶1）除蛋白質(zhì)和淀粉等雜質(zhì)、使用PEG8000沉淀DNA、用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化DNA等。比較分析了優(yōu)化的方法與其他3種常用方法所獲得的總DNA產(chǎn)率和純度的差別，結(jié)果表明，優(yōu)化的方法所提取DNA的D260 nm/D230 nm、D260 nm/D280 nm值均高于其他3種方法，且PCR擴增條帶清晰、DNA產(chǎn)率高，土壤中DNA得率達88.76 μg/g，表明該方法適宜提取土壤中的微生物DNA，從而為研究廣藿香根際土壤微生物種類及其多樣性奠定了基礎。

關鍵詞：廣藿香；總DNA；根際土壤；微生物；提取方法

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0045-03

收稿日期：2014-04-08

基金項目：國家自然科學基金（編號：31360210）；海南省中藥現(xiàn)代化專項資金（編號：2012ZY015）。

作者簡介：徐巖（1988—），女，吉林白山人，碩士研究生，研究方向為南藥種質(zhì)資源與活性成分。E-mail：490329151@qq.com。

通信作者：張軍鋒，碩士，副教授，研究方向為南藥種質(zhì)資源與活性成分。E-mail：zhangjunfengvip@qq.com。廣藿香[Pogostemon cablin （Blanco） Benth.]為唇形科刺蕊草屬植物，原產(chǎn)于東南亞地區(qū)，如馬來西亞、菲律賓、印度尼西亞等國，在我國引種可追溯到梁代或以前[1]，我國的主要栽培地為海南、廣東兩省。廣藿香以其干燥地上部分入藥，是我國常用的芳香化濕類中藥之一，常用于治療濕濁中阻、脘痞嘔吐、暑濕倦怠、胸悶不舒、寒濕閉暑、腹痛吐瀉、鼻淵頭痛等[2]。廣藿香不僅是30多種中成藥的主要原料，而且從其中提取的廣藿香油還是醫(yī)藥和輕化工業(yè)的重要原料[3]。然而，廣藿香在種植過程中連作障礙十分明顯，通常認為根系分泌物會破壞土壤微環(huán)境、改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，從而影響植物自身生長[4-5]。因此，研究廣藿香土壤微生物的區(qū)系狀況和變化是解決廣藿香連作障礙的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的分離鑒定法可培養(yǎng)土壤微生物的數(shù)量僅占總微生物數(shù)量的0.1%～1.0%[6]，不能全面地反映根際土壤微生物的區(qū)系狀況，局限性十分明顯。目前，通過基于土壤微生物群落總DNA的現(xiàn)代微生物分子生態(tài)學方法研究土壤中微生物，能較全面獲得土壤微生物種類與多樣性的信息。此方法作為微生物群落分子分析方法的基礎，最重要的一步就是從土壤樣品中盡量毫無偏差地提取出高質(zhì)量的微生物總基因組DNA。迄今尚未見關于廣藿香根際土壤微生物總DNA提取的報道，本研究采用4種方法對廣藿香根際土壤微生物總DNA進行提取和優(yōu)化，旨在為克服廣藿香種植中連作障礙及其根際土壤微生物區(qū)系的研究提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試土壤樣品于2013年9月取于海南省萬寧市廣藿香種植園內(nèi)，取樣面積為100 m2（10 m×10 m），采用5點混合采樣法，根際土壤采集按慕東艷等的方法[7]進行。將取好的土壤混勻，除去明顯雜質(zhì)后裝入無菌袋中，過80目篩后于-80 ℃冰箱保存待用，供試土壤的部分理化性質(zhì)：土壤為沙壤土，pH值593%，全氮含量（0.998±0.001）g/kg，全鉀含量（2.172±0.025）g/kg，全磷含量（0.623±0.009）g/kg，含水量30.2%。1.2廣藿香根際土壤微生物總DNA的提取方法

1.2.1方法1改良CTAB法：在Ellingse等方法[8]的基礎上，將CTAB濃度提高到3%，并增加“SDS裂解前，37 ℃水浴及渦旋振蕩”的步驟。

1.2.2方法2聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVP）法：參照Jia等的方法[9]進行。

1.2.3方法3超聲細胞破碎法：稱取0.5 g根際土壤，加入1.5 mL DNA提取緩沖液[100 mmol/L Tris-HCl（pH值80），100 mmol/L EDTA （pH值8.0），100 mmol/L磷酸鈉（pH值8.0），1.5 mol/L NaCl，1% CTAB]，置于超聲細胞破碎儀內(nèi)，超聲振蕩30 min后，于室溫、8 000 r/min離心 10 min，收集上清并轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，用0.6倍體積的異丙醇沉淀DNA；于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集核酸沉淀，用4 ℃ 70%乙醇洗滌沉淀后重懸于滅菌的去離子水中，最終體積為100 μL。

1.2.4方法4采用筆者優(yōu)化的方法：在張瑞福等方法[10]的基礎上優(yōu)化，即（1）土壤預洗：取0.5 g土壤樣品，加入 10 mL 2%磷酸緩沖液[pH值8.0，含2% 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）]，磁力攪拌15 min，于10 000 r/min離心5 min，取沉淀，重復上述步驟洗滌2次，將沉淀轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；?）DNA提取：稱取0.5 g根際土壤，加入1.5 mL DNA提取緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L磷酸鈉，1.5 mol/L NaCl，2% CTAB），再加入10 μL蛋白酶K，37 ℃水浴30 min，其間每 10 min 用渦旋儀振蕩1次，接著加入150 μL 20% SDS，65 ℃水浴3 h，每隔15～20 min搖晃1次，于室溫、8 000 r/min離心10 min，收集上清并轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中。用等體積的酚-氯仿-異戊醇（25 ∶24 ∶1）抽提。離心后將水相轉(zhuǎn)移至已滅菌的2 mL離心管中，用1/3體積的PEG8000于-20 ℃沉淀2 h，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，收集核酸沉淀，用4 ℃ 70%乙醇洗滌沉淀，重懸于滅菌的去離子水中，最終體積為100 μL。

1.3廣藿香根際土壤微生物總DNA的純化方法

參照UNIQ-10柱式DNA凝膠回收純化試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]的步驟進行回收純化。

1.4廣藿香根際土壤微生物總DNA粗提物及純化物的產(chǎn)率及純度檢測

用分光光度法分別測定D260 nm、D280 nm、D230 nm值，計算其比值D260 nm/D230 nm、D260 nm/D280 nm。

1.5廣藿香根際土壤細菌16S rDNA的PCR擴增條件

采用細菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，907R：5′-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3′擴增16S rDNA片段。其中正向引物的5′端用帶羥基熒光素（FAM）的熒光標記。擴增采用4管平行，20 μL反應體系為：10 μL 2×PCR Mix，各 2 μL 引物（1 μmol/L），1.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U），2 μL牛血清蛋白（BSA）（2 μg/μL），1 μL模板，3.5 μL 無菌水。反應條件為：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2結(jié)果與分析

2.1土壤微生物DNA提取方法的分析

2.1.1DNA純度D260 nm/D280 nm主要用來檢測蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的污染情況，而D260 nm/D230 nm主要用來檢測糖類、鹽類或有機物等雜質(zhì)的污染情況。從表1可見，方法3所得DNA樣品的D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm均低于其他3種方法，而方法4所得的DNA純度最高，D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm分別為1.75、1.83。

2.1.2DNA產(chǎn)率由表1可見，方法4提取的DNA產(chǎn)率最高，達 88.76 μg/g，可能是因為增加了土壤預洗過程，使得雜質(zhì)減少，且使用了1/3體積的PEG8000沉淀DNA，沉淀效果好，從而增加了DNA的產(chǎn)率。方法3所得的DNA產(chǎn)率最少，僅為1.67 μg/g。結(jié)果表明，在不添加化學裂解液的情況下，物理方法可能使細胞破壁不完全，導致DNA產(chǎn)率降低。

表14種方法提取廣藿香根際土壤樣品的DNA純度與產(chǎn)率分析

方法編號D260 nm/D230 nmD260 nm/D280 nmDNA產(chǎn)率

（μg/g）11.01±0.06A1.35±0.02A3.36±0.14A21.54±0.01B1.54±0.09B58.13±0.85B30.86±0.06C1.16±0.02C1.67±0.09C41.83±0.01D1.75±0.04D88.76±1.32D注：D260 nm/D280 nm比值在1.8～2.0之間表明較純；D260 nm/D230 nm>2.0較好。

2.2廣藿香根際土壤微生物總DNA的提取和檢測

將4種方法所提取的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，從圖1可以看出，4種方法均可提取廣藿香根際土壤微生物總DNA，其中方法2、方法4所得的DNA濃度遠高于方法1、方法3。試驗中還發(fā)現(xiàn)，除方法4外，其他方法提取出的DNA均呈現(xiàn)不同程度的棕褐色，說明土壤預洗可有效地去除土壤中的雜質(zhì)。

2.3廣藿香根際土壤微生物的PCR擴增結(jié)果

以所提土壤DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物進行擴增。由圖2可見，方法3提取的DNA樣品擴增條帶均不清晰；方法1、方法2提取的DNA有50%的擴增條帶不清晰；方法4所得的DNA均能擴增出目標條帶且效果最好，可

直接用于后續(xù)分析。

3結(jié)論與討論

一般認為，藥用植物在栽培中產(chǎn)生的連作障礙，與根際土壤中的微生物群落變化密切相關，根際土壤中的微生物可以促進植物的生長發(fā)育，同時對植物體其他生命活動進行調(diào)控[11-13]?；谕寥牢⑸锶郝淇侱NA的現(xiàn)代微生物分子生態(tài)學方法研究土壤中微生物，能較全面獲得土壤微生物種類與多樣性的信息。然而，此方法最重要的一步就是提取高質(zhì)量的微生物總基因組DNA。由于廣藿香根際土壤成分復雜，如腐殖酸、重金屬離子、大分子雜質(zhì)等，因此需要篩選和優(yōu)化土壤微生物總DNA的提取方法。本研究篩選和優(yōu)化了4種

廣藿香根際土壤微生物總DNA的提取方法。方法1僅用CTAB作為裂解液，微生物細胞裂解不完全，DNA產(chǎn)率及純度低，雜質(zhì)多，后續(xù)的PCR擴增效果不理想；方法2盡管有SDS和PVP 2種裂解液，其提取的DNA濃度、純度和產(chǎn)率均略高于方法1，但也不是最佳的方法；方法3采用超聲細胞破碎法，未添加化學裂解液，不能完全破碎細胞壁，DNA不能全部從細胞中釋放出來，導致產(chǎn)率低，且不能去除土壤樣品中的雜質(zhì)；方法4采用CTAB和SDS2種裂解液，提取效果較好，加上與蛋白酶K及PVP的共同作用，可更好地結(jié)合土壤中的腐殖酸，防止大片段的DNA降解，從而得到更純的土壤微生物DNA。試驗中還發(fā)現(xiàn)，方法4中的聚乙二醇（PEG）沉淀DNA的效果較好，使所得DNA純度較高，且不影響其產(chǎn)率。當前，土壤微生物DNA有時采用專一試劑盒來提取，雖然操作簡便，但是價格昂貴[14]。方法4所提取的DNA純度和產(chǎn)率高，PCR擴增的條帶清晰，提取的DNA可用于根際土壤微生物群落和多樣性分析，表明方法4適宜提取土壤中微生物總DNA，此方法為廣藿香種植中克服連作障礙及其根際土壤微生物區(qū)系的研究提供了科學依據(jù)。

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