四川玉米小斑病菌交配型組成與育性分析

孫小芳，劉敏，潘婷敏，龔國(guó)淑

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130

0 引言

【研究意義】玉米（Zeamays）是最重要的農(nóng)作物之一，廣泛用于食品、飼料、工業(yè)和能源等方面，然而病害的發(fā)生給玉米優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重威脅。由Cochliobolusheterostrophus（無(wú)性型：Bipolarismaydis）引起的玉米小斑?。╯outhern corn leaf blight）是玉米生產(chǎn)上不容忽視的重要病害，在世界各玉米產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[1-3]。目前小斑病是我國(guó)黃淮海夏玉米區(qū)的主要病害，在東北和西南地區(qū)也普遍發(fā)生，近年來(lái)在福建等南方丘陵區(qū)的鮮食玉米上發(fā)生嚴(yán)重，一般年份減產(chǎn)5%—15%，重發(fā)年份可以引起20%—30%的減產(chǎn)[4-6]。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)該病的防治主要以培育抗病品種為主，輔以化學(xué)藥劑，但由于病菌群體內(nèi)生理分化明顯、變異頻繁，導(dǎo)致品種抗性喪失，防治難度大[6-10]。有性生殖是導(dǎo)致病菌變異的重要途徑之一，影響病原菌的群體結(jié)構(gòu)，在遺傳變異中起著重要作用。明確小斑病菌自然群體的交配型和空間分布情況，以及菌株的有性生殖能力（育性）是進(jìn)行小斑病菌有性生殖研究的前提條件。因此，開(kāi)展小斑病菌交配型與育性分析，探索小斑病菌有性世代在自然界存在的可能性，對(duì)闡明有性生殖在小斑病菌遺傳變異中的作用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】真菌的有性生殖由交配型位點(diǎn)（mating-type locus，MAT）控制，如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）及構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）的互補(bǔ)交配型分別以MATα和MAT a表示，粗糙脈孢霉（Neurosporacrassa）的交配型分別被命名為MAT a和MAT A，其他子囊菌的交配型一般以MAT1-1和MAT1-2表示[11-13]。DRECHSLER將自然發(fā)病的玉米葉片保濕培養(yǎng)，首次獲得了玉米小斑病菌的有性世代[14]，TURGEON等首次克隆得到玉米小斑病菌的交配型基因 MAT1-1和 MAT1-2，分別編碼α-box DNA結(jié)合域和HMG-box DNA結(jié)合域[15]。交配型種類及其分布影響真菌的交配策略，交配型比例的失衡會(huì)造成有性生殖發(fā)生的稀缺。引起馬鈴薯晚疫病的致病疫霉（Phytophythorainfestans）為異宗配合卵菌，在瑞士發(fā)現(xiàn) A2交配型以前，除墨西哥以外的其他國(guó)家只存在 A1交配型，不能進(jìn)行有性生殖[16]；20世紀(jì)80年代以后在原本僅存在A1交配型的地區(qū)，由于 A2交配型菌株的引入，使得致病疫霉群體的有性生殖成為可能，之后有性生殖相繼被報(bào)道，成為該病原生活史的重要部分[17]。稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）群體的交配型分布和育性水平存在顯著差異，一些地區(qū)只有一種交配型，即使環(huán)境有利，也不存在有性重組的機(jī)會(huì)，有性重組可能不是這些地區(qū)稻瘟病菌群體變異的主要來(lái)源，但在印度喜馬拉雅地區(qū)到中國(guó)云南南部山區(qū)發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌群體兩種交配型菌株均有分布，且存在較大比例的雌性可育菌株，可能存在有性生殖[18-21]。玉米小斑病菌同稻瘟病菌一樣，屬于典型的無(wú)性繁殖真菌，有性世代在自然界鮮有發(fā)現(xiàn)，但在人工培養(yǎng)中能夠大量誘導(dǎo)產(chǎn)生，即使是室內(nèi)長(zhǎng)期保存的無(wú)性產(chǎn)孢能力減弱的菌株依然保存有性生殖的能力。玉米小斑病菌是異宗配合子囊菌，只有在MAT1-1和MAT1-2兩種交配型的菌株同時(shí)存在時(shí)才有可能進(jìn)行有性生殖，因此首先要明確菌株群體的交配型組成。通過(guò)設(shè)計(jì)交配型特異性引物，運(yùn)用PCR方法檢測(cè)子囊菌的交配型已在多種重要植物病原菌的有性生殖研究中應(yīng)用，如玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）[22-23]、新月彎孢（Cochlioboluslunatus）[24]、灰霉病菌（Botryotiniafuckeliana）[25-26]、小麥白粉病菌（Blumeriagraminisf.sp.tritici）[27]等。目前玉米小斑病菌自然種群的交配型組成及空間分布情況鮮有報(bào)道，代玉立等建立了小斑病菌交配型的多重PCR檢測(cè)方法，并對(duì)福建省102個(gè)玉米小斑病菌的交配型進(jìn)行檢測(cè)，MAT1-1和 MAT1-2菌株分別占比 36.3%和63.7%，存在交配型分布不均衡的現(xiàn)象[10,23]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】玉米小斑病是四川省玉米常發(fā)病害之一，近年來(lái)，在玉米葉斑類病害中，小斑病的發(fā)生普遍率和嚴(yán)重度均為最高[28]。四川生態(tài)環(huán)境復(fù)雜多樣，特別是在現(xiàn)有的小麥、玉米輪作系統(tǒng)下推行秸稈還田和免耕等模式，田間復(fù)雜的環(huán)境則更可能發(fā)生著有性生殖。目前，四川玉米小斑病菌自然群體的交配型組成及空間分布情況未見(jiàn)報(bào)道，菌株的育性結(jié)構(gòu)尚不明確，育性在時(shí)空間是否存在差異仍有待探究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】于2013—2018年大量收集玉米小斑病菌田間菌株，應(yīng)用多重PCR技術(shù)對(duì)小斑病菌的交配型進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)峙雜交的方法對(duì)小斑病菌群體的育性進(jìn)行分析，以期明確小斑病菌自然群體的交配型和空間分布情況，以及育性水平，為探明小斑病菌有性世代在自然界存在的可能性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：544個(gè)待測(cè)玉米小斑病菌菌株為2013—2018年從四川、云南等18個(gè)市（州）103個(gè)采集地采集，經(jīng)常規(guī)組織分離后單孢純化所得，每個(gè)菌株均來(lái)自不同的單病斑樣本，菌株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室保存。為了減少繼代培養(yǎng)對(duì)菌株育性測(cè)定結(jié)果的影響，本研究使用的所有菌株均是從斜面保存的一代菌株中活化而來(lái)。根據(jù)地理來(lái)源將544個(gè)菌株劃分為6個(gè)類群，四川中部地區(qū)227個(gè)菌株，分別來(lái)自成都、眉山；四川東部地區(qū)58個(gè)菌株，分別來(lái)自內(nèi)江、遂寧、南充、廣安、巴中、達(dá)州；四川西部地區(qū) 13個(gè)菌株，分別來(lái)自雅安、甘孜；四川南部地區(qū)66個(gè)菌株，分別來(lái)自樂(lè)山、自貢、宜賓、瀘州；四川北部地區(qū)163個(gè)菌株，分別來(lái)自德陽(yáng)、綿陽(yáng)、廣元；另有來(lái)自云南南部西雙版納州的17個(gè)菌株。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉10 g，蒸餾水1 L；馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose，PD）培養(yǎng)液：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L；Sach’s培養(yǎng)基：KNO31.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Ca(NO3)2·4H2O 0.5 g，CaCO30.5 g，Ca3(PO4)20.5 g，F(xiàn)eCl30.06 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 L，以玉米葉片為誘導(dǎo)基物，調(diào)節(jié)pH至6。

主要試劑：Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker DL 2000，南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

主要儀器：NanoDropTM2000超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Bio-Rad PowerPac 3000凝膠電泳儀，Bio-Rad Universal Hood II凝膠成像儀，美國(guó)伯樂(lè)公司；Zeiss Axio Imager Z2熒光顯微鏡，德國(guó)卡爾蔡司公司。

1.2 供試菌株DNA的提取

菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)5—7 d后，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打孔，取3—5個(gè)菌餅接種到盛有150 mL PD培養(yǎng)液的錐形瓶中，置于26℃下120 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，用無(wú)菌紗布過(guò)濾菌絲體，再用無(wú)菌濾紙將菌絲體的水分吸干，于液氮中速凍。參照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒的方法從凍干菌絲中提取菌株基因組DNA。

1.3 交配型的分子鑒定

以 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中玉米小斑病菌的交配型基因MAT1-1（Accession number：AF029913）和 MAT1-2（Accession number：AF027687）序列為參照，使用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性多重PCR引物：ChMAT1（5′-GCACCTGAGCGATTTCTT-3′）為上游引物，ChMAT1-1（5′-CATCTTCATCGGCTCCAA-3′）為MAT1-1下游引物，ChMAT1-2（5′-GGCGGATTG ACTCAGTGTTG-3′）為 MAT1-2下游引物。PCR反應(yīng)體系為15 μL，菌株DNA 1 μL，體系內(nèi)3個(gè)引物各0.5 μL，2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL，ddH2O 5 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性40 s，53℃復(fù)性 60 s，72℃延伸 1.5 min，30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸 7 min。同時(shí)設(shè)不加模板 DNA的反應(yīng)體系為陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)電泳條帶大小來(lái)區(qū)分菌株的交配型。

1.4 育性分析

根據(jù)交配型PCR檢測(cè)結(jié)果，從小斑病菌群體中隨機(jī)選取不同地理來(lái)源的MAT1-1和MAT1-2菌株各10株，進(jìn)行相反交配型菌株的兩兩配對(duì)雜交，篩選出一對(duì)高配合力的菌株作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，再以標(biāo)準(zhǔn)菌株與田間待測(cè)菌株雜交，進(jìn)行育性分析。

有性雜交以Sach’s培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以玉米葉片為誘導(dǎo)基物。在 9 cm的培養(yǎng)皿中加入 15 mL Sach’s培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基凝固前將1張4 cm×2 cm的滅菌成熟玉米葉片放置于皿中央培養(yǎng)基上。待培養(yǎng)基凝固后將兩個(gè)相反交配型的菌株分別接種在距葉緣0.5 cm的兩側(cè)，24℃下黑暗培養(yǎng)25—30 d。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)菌株間對(duì)峙雜交產(chǎn)生成熟假囊殼時(shí)，在解剖鏡下檢查待測(cè)菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)峙產(chǎn)生的假囊殼，統(tǒng)計(jì)假囊殼產(chǎn)生量，并隨機(jī)挑選20—30個(gè)假囊殼置于載玻片上，蓋上蓋玻片，輕輕壓碎后在光學(xué)顯微鏡下觀察子囊、子囊孢子的發(fā)育情況。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次每個(gè)配對(duì)雜交培養(yǎng)3皿。育性由待測(cè)菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌對(duì)峙雜交時(shí)產(chǎn)生的假囊殼及子囊數(shù)量來(lái)衡量。將形成假囊殼，且能夠產(chǎn)生子囊孢子的菌株界定為可育菌株；將不能形成假囊殼，或只產(chǎn)生空的假囊殼的菌株界定為不育菌株。育性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 玉米小斑病菌有性雜交的育性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The fertility grading criteria of C.heterostrophus

1.5 育性的遺傳分化

根據(jù)育性分析結(jié)果，在高育性菌株群體中選擇MAT1-1和MAT1-2菌株各10株，進(jìn)行兩兩配對(duì)雜交；在低育性菌株群體中選擇 MAT1-1菌株 8株與MAT1-2菌株11株，進(jìn)行兩兩配對(duì)雜交。以標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)峙雜交為對(duì)照，24℃下黑暗培養(yǎng)25—30 d，統(tǒng)計(jì)假囊殼產(chǎn)生量，檢測(cè)子囊、子囊孢子的發(fā)育情況。方法同1.4。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用 Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)?？ǚ綑z測(cè)χ2是在MAT1-1﹕MAT1-2的理論比率1﹕1，自由度為1的基礎(chǔ)之上計(jì)算得出。

2 結(jié)果

2.1 玉米小斑病菌有性世代的形態(tài)特征

通過(guò)相反交配型菌株的室內(nèi)對(duì)峙雜交成功誘導(dǎo)出玉米小斑病菌的有性世代（圖 1）。成熟的假囊殼約在對(duì)峙雜交的25—30 d內(nèi)形成，呈黑色，近球狀，大小約300—600 μm，頂口處有喙，不同的雜交組合產(chǎn)生的假囊殼大小和形態(tài)稍有差異。假囊殼內(nèi)一般幾個(gè)到幾百個(gè)子囊不等，子囊棍棒狀，基部有短柄，大?。?44—203）μm×（23—31）μm。子囊內(nèi)常產(chǎn)生1—8個(gè)子囊孢子，大多數(shù)子囊內(nèi)含有2—6個(gè)子囊孢子，子囊孢子線狀，隔膜6—9個(gè)，在子囊內(nèi)螺旋形盤繞，大?。?55—350）μm×（5—9）μm。

2.2 玉米小斑病菌的交配型分析

利用多重PCR檢測(cè)供試玉米小斑病菌的交配型，MAT1-1菌株擴(kuò)增得到大小為 1 343 bp的片段，MAT1-2菌株擴(kuò)增得到大小為1 141 bp的片段（圖2）。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，544個(gè)待測(cè)菌株中286個(gè)MAT1-1菌株，出現(xiàn)頻率為52.57%；258個(gè)MAT1-2菌株，出現(xiàn)頻率為47.43%。兩種交配型比例為1.11﹕1，卡方檢驗(yàn)符合1﹕1分布（χ2=1.441，P=0.230）。沒(méi)有檢測(cè)到同時(shí)含有兩種交配型基因或兩種交配型基因全部缺失的菌株。根據(jù)菌株來(lái)源，對(duì)各地玉米小斑病菌交配型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表 2。除甘孜州外，兩種交配型的菌株在各采樣區(qū)域均有分布，且同一田塊甚至同一病葉可分離到兩種交配型的菌株。四川中部、東部、西部、南部和北部地區(qū)小斑病菌MAT1-1和MAT1-2出現(xiàn)頻率分別為54.63%、45.37%；51.72%、48.28%；61.54%、38.46%；56.06%、43.94%；49.08%、50.92%。云南南部地區(qū) MAT1-1和 MAT1-2出現(xiàn)頻率分別為41.18%和 58.82%。各地區(qū)兩種交配型的頻率稍有不同，推測(cè)小斑病菌在當(dāng)?shù)匕l(fā)生有性雜交的機(jī)率是不同的，但均未偏離1﹕1。

表2 四川省17個(gè)市（州）及云南省西雙版納州玉米小斑病菌交配型分布情況Table 2 Mating type of C.heterostrophus isolates collected from 17 cities (prefectures) of Sichuan and Xishuangbanna of Yunnan provinces

2.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株的篩選

根據(jù)菌株交配型的PCR檢測(cè)結(jié)果，分別在兩種交配型的菌株中隨機(jī)挑選不同地理來(lái)源的 10個(gè)菌株進(jìn)行兩兩對(duì)峙雜交，在100個(gè)配對(duì)雜交組合中，假囊殼產(chǎn)生量大于 200/皿的占比 29.00%（表 3）。其中，DY-12-1-2（MAT1-2）與 10個(gè) MAT1-1交配型菌株雜交，假囊殼產(chǎn)生量大于 200/皿的有 9個(gè)組合；MSRS-2-3（MAT1-1）與10個(gè)MAT1-2交配型菌株雜交，假囊殼產(chǎn)生量大于200/皿的有7個(gè)組合。且這些具有高假囊殼形成能力的組合均能產(chǎn)生較多的子囊和子囊孢子，表明MSRS-2-3（MAT1-1）和 DY-12-1-2（MAT1-2）均具有較高的有性世代形成能力，適合作為標(biāo)準(zhǔn)菌株。因此，選擇MSRS-2-3（MAT1-1）和DY-12-1-2（MAT1-2）用作標(biāo)準(zhǔn)菌株。

表3 玉米小斑病菌田間菌株的對(duì)峙雜交假囊殼產(chǎn)生情況Table 3 Reciprocal crossing between different mating type isolates of C.heterostrophus

2.4 育性分析

18個(gè)市（州）的544個(gè)玉米小斑病菌田間菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)峙雜交有性世代形成情況見(jiàn)表 4。有 511個(gè)菌株能夠與標(biāo)準(zhǔn)菌株雜交形成假囊殼，占比93.93%，不能形成假囊殼的菌株僅有 33株，占比6.07%。各菌株間假囊殼形成量有很大的差異，從幾個(gè)到幾百個(gè)不等，其中低假囊殼形成能力的菌株 228株，占比41.91%，為主要類群。其次為中等假囊殼形成能力的菌株178株，占比32.72%；高假囊殼形成能力的菌株僅105株，占比19.30%。能夠雜交產(chǎn)生子囊孢子的可育菌株有483株，占比88.79%；61個(gè)參試菌株不能與標(biāo)準(zhǔn)菌株雜交形成子囊孢子，為不育菌株，占比11.21%?？捎昱c不育菌株的頻率差異極顯著（P＜0.01）。就交配型組成而言，在可育菌株群體中，MAT1-1交配型菌株有251個(gè)，占比51.97%，MAT1-2交配型菌株有232個(gè)，占比48.03%，兩種交配型分布差異不顯著。就育性結(jié)構(gòu)而言，高育性菌株67株，占比12.32%；中等育性菌株149株，占比27.39%；低育性菌株267株，占比49.08%，為主要類群。來(lái)自甘孜州的2個(gè)菌株均表現(xiàn)為不育，其他各地區(qū)菌株的可育率在60%—100%。來(lái)自成都、德陽(yáng)、廣元、綿陽(yáng)、內(nèi)江、自貢和云南西雙版納的菌株可育率均達(dá)到90%以上，其中內(nèi)江、自貢和西雙版納菌株可育率為100%。在菌株量大于20株的成都、德陽(yáng)、廣元、樂(lè)山、眉山和綿陽(yáng)采樣區(qū)，高育性菌株率為8.70%—18.75%，中等育性菌株率為12.50%—34.78%，低育性菌株率為42.24%—65.00%，不育菌株率為4.76%—18.75%。

表4 四川省17個(gè)市（州）及云南省西雙版納州玉米小斑病菌有性世代形成情況Table 4 Fertility of C.heterostrophus isolates collected from 17 cities (prefectures) of Sichuan and Xishuangbanna of Yunnan provinces

按地理來(lái)源分區(qū)，四川中部、東部、西部、南部、北部地區(qū)小斑病菌的可育率和高育性菌株率分別為89.87%、11.89%；79.31%、6.90%；69.23%、15.38%；83.33%、6.06%；93.25%、12.27%。云南南部地區(qū)的菌株可育率和高育性菌株率分別為 100.00%和58.82%。以上結(jié)果表明不同地理來(lái)源的菌株群體育性結(jié)構(gòu)不同。

2.5 交配型和育性水平的年度動(dòng)態(tài)變化

統(tǒng)計(jì) 2013—2018年玉米小斑病菌交配型和育性組成，由表5可知，隨著時(shí)間的變化，小斑病菌兩種交配型的比例和育性水平出現(xiàn)波動(dòng)，但變化不大。就交配型結(jié)構(gòu)而言，各年間兩種交配型菌株的頻率沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明 6個(gè)時(shí)間群體的交配型結(jié)構(gòu)是一致的。就育性結(jié)構(gòu)而言，2013年和2014年菌株可育率均低于80%，可能是由于菌株保存時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致育性降低；2018年菌株可育率為88.76%，2015—2017年菌株可育率在 93.33%—94.87%，保持較高的育性水平。

表5 不同年份玉米小斑病菌交配型及有性世代形成情況Table 5 Mating type and fertility of C.heterostrophus isolates from corn southern leaf blight during 2013-2018

2.6 育性的遺傳分化

在高育性菌株的100個(gè)配對(duì)雜交組合中，假囊殼產(chǎn)生量大于200/皿的組合占比69.00%，假囊殼產(chǎn)生量在100—200/皿之間的組合占比22.00%，假囊殼產(chǎn)生量少于100/皿的組合占比9.00%（表6）。其中，B73-2-2（MAT1-2）與CZ-1-1（MAT1-1）菌株雜交雖產(chǎn)生了大量的假囊殼，但是假囊殼內(nèi)只有極少量的子囊和子囊孢子；ZJ-10-2（MAT1-2）、J-A（MAT1-2）分別與MAT1-1的10個(gè)高育性菌株雜交時(shí)，均有4對(duì)雜交組合產(chǎn)生的假囊殼少于 100個(gè)/皿；DJY-1-2A（MAT1-2）與10個(gè)MAT1-1菌株雜交時(shí)，出現(xiàn)了3種不同等級(jí)的假囊殼產(chǎn)生情況。

表6 高育性菌株間對(duì)峙雜交假囊殼的產(chǎn)生情況Table 6 Reciprocal crossing between high fertile isolates of C.heterostrophus

在低育性菌株的 88個(gè)配對(duì)雜交組合中，出現(xiàn) 3對(duì)假囊殼產(chǎn)生量大于200/皿的組合，占比3.41%；假囊殼產(chǎn)生量在100—200/皿之間的組合占比42.05%；假囊殼產(chǎn)生量少于100/皿的組合占比47.73%；有6個(gè)雜交組合未能產(chǎn)生假囊殼，占比 6.82%（表 7）。18LS-2-5（MAT1-2）與D4-3-1（MAT1-1）的雜交組合沒(méi)有產(chǎn)生子囊孢子，但與 CZ-7-1-1（MAT1-1）的雜交組合產(chǎn)生大量假囊殼且形成豐富的子囊孢子。D4-3-1（MAT1-1）與8個(gè)MAT1-2菌株雜交時(shí)，有5對(duì)組合未能產(chǎn)生假囊殼。GY-6-1-2（MAT1-1）與 8個(gè)MAT1-2菌株雜交時(shí)，雖有假囊殼產(chǎn)生，但無(wú)子囊孢子形成。MS-6-1-1（MAT1-1）與 8個(gè) MAT1-2菌株雜交時(shí)，有7對(duì)組合僅能形成空的假囊殼。

表7 低育性菌株間對(duì)峙雜交假囊殼的產(chǎn)生情況Table 7 Reciprocal crossing between low fertile isolates of C.heterostrophus

比較高育性菌株群體間和低育性菌株群體間雜交有性世代的產(chǎn)生情況，可見(jiàn)，高育性菌株群體整體保持了較高的假囊殼和子囊孢子產(chǎn)生能力，而低育性菌株群體整體有性生殖能力較低，說(shuō)明通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)峙雜交的方法來(lái)判斷菌株群體的育性是可行的。但在低育性群體中也會(huì)出現(xiàn)高配合力的雜交組合，表明有性生殖是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，菌株間可能會(huì)存在互補(bǔ)效應(yīng)。

3 討論

交配型和育性是真菌群體遺傳結(jié)構(gòu)研究的重要組成部分。由交配型基因控制的交配型種類及其分布影響著真菌有性生殖的策略，但交配型偏離現(xiàn)象在異宗配合真菌中普遍存在，如稻瘟病菌[18-21,29]、玉米大斑病菌[30-31]、球孢白僵菌（Beauveriabassianasensu lato）[32]等，意味著有性生殖在這些群體中發(fā)生的概率很低。有研究表明，異宗配合的子囊菌失去有性生殖能力的原因可能在于失去了某種特定的交配型，或因生境發(fā)生重大變化造成的定向選擇對(duì)某一交配型群體的無(wú)性型特別有利，導(dǎo)致這一交配型比例的猛增，從而改變交配型結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致有性生殖策略發(fā)生改變[15,33]。本研究結(jié)果表明，四川、云南玉米小斑病菌自然群體中MAT1-1和MAT1-2兩種交配型的菌株普遍存在，沒(méi)有出現(xiàn)某一種交配型缺失或占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的現(xiàn)象，不同年份間交配型的結(jié)構(gòu)也保持一致。在同一病葉上能夠分離到兩種交配型的菌株，意味著在自然條件下這些地區(qū)玉米小斑病菌極有可能存在有性生殖，有性重組可能是玉米小斑病菌遺傳多樣性形成的一種潛在機(jī)制。但各個(gè)地區(qū)小斑病菌兩種交配型的比例稍有不同，因而小斑病菌在各地通過(guò)有性雜交而出現(xiàn)變異的機(jī)率是不同的。

本試驗(yàn)中交配型測(cè)定的結(jié)果表明自然條件下未見(jiàn)小斑病菌的有性態(tài)并不是由某些地域范圍內(nèi)某一種交配型類型的缺失造成的，因而進(jìn)一步探索菌株群體的育性結(jié)構(gòu)對(duì)小斑病菌有性生殖發(fā)生的影響。胡旭章等開(kāi)展的55對(duì)小斑病菌的種內(nèi)雜交，僅有一對(duì)產(chǎn)生了成熟的子囊孢子，表現(xiàn)出低育性的特征[34]。本研究中544株玉米小斑病菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)峙雜交，88.79%的菌株能夠產(chǎn)生成熟的子囊孢子，保持了較高的可育率，說(shuō)明四川、云南的小斑病菌有較強(qiáng)的有性生殖能力。但菌株群體內(nèi)出現(xiàn)育性的分化，不同地理來(lái)源的菌株育性結(jié)構(gòu)稍有不同，推測(cè)菌株的育性水平可能與地理來(lái)源有關(guān)。育性結(jié)構(gòu)的差異進(jìn)一步說(shuō)明病菌在不同地區(qū)發(fā)生有性生殖的機(jī)率不同。試驗(yàn)中部分采樣點(diǎn)和菌株分布存在不均勻的現(xiàn)象，菌株的育性結(jié)構(gòu)后續(xù)仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

在育性分析中，一個(gè)菌株的育性能力是由標(biāo)準(zhǔn)菌株和測(cè)試菌株互作決定的，測(cè)試菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的配合力強(qiáng)弱是關(guān)鍵，因此需要選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)菌株。在稻瘟病菌群體育性分析中，發(fā)現(xiàn)由于標(biāo)準(zhǔn)菌株的不同造成同一組稻瘟病菌株的育性結(jié)果差異很大[35]。造成這些差異的原因可能有兩種：一是不同標(biāo)準(zhǔn)菌株和待測(cè)菌株之間的親和力不同，二是由所選用的標(biāo)準(zhǔn)菌株的交配能力強(qiáng)弱差異。本研究中表現(xiàn)為低育性或不育的菌株可能只是與標(biāo)準(zhǔn)菌株之間弱的親和性反映。因此，利用多對(duì)不同遺傳背景的高育性的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行育性測(cè)定，更能反映菌株群體的育性水平。在小斑病菌的研究中發(fā)現(xiàn)，高育性的菌株間配對(duì)易形成假囊殼，高育性和低育性的菌株配對(duì)不一定形成假囊殼，低育性的菌株配對(duì)一般不形成假囊殼[36]。本研究中也發(fā)現(xiàn)小斑病菌中普遍存在菌株的親和性差異。高育性菌株在與標(biāo)準(zhǔn)菌株配對(duì)時(shí)均產(chǎn)生了較多的假囊殼和子囊孢子，但高育性菌株之間相互雜交時(shí)不一定都能產(chǎn)生較多的有性世代；相反一些低育性菌株之間雜交，也會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)生較多假囊殼和子囊孢子的情況。高育性菌株間雜交不能形成豐富的有性世代，推斷是某些因素抑制了有性世代的發(fā)生，而低育性菌株之間的雜交大量產(chǎn)生有性世代可能是兩菌株之間的互補(bǔ)效應(yīng)。小斑病菌假囊殼形成、子囊孢子的發(fā)育過(guò)程觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)親本都含有Tox1時(shí)會(huì)導(dǎo)致子囊孢子發(fā)育中斷[37-38]，說(shuō)明小斑病菌有性生殖是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，除受到交配型基因調(diào)控外，菌株間的親和性還受到眾多其他基因的調(diào)控[39-44]。

生殖模式影響植物病原菌種群遺傳動(dòng)態(tài)和進(jìn)化格局，進(jìn)而影響防控策略。交配型和育性是玉米小斑病菌重要的群體特征，明確玉米小斑病菌群體的交配型和育性情況，對(duì)深入探討玉米小斑病菌有性態(tài)在自然界中的發(fā)生機(jī)制及解析異宗配合真菌遺傳變異具有重要意義。四川省目前大力推廣的秸稈還田，為玉米小斑病菌提供了良好的生存和越冬條件，在兩種交配型菌株普遍存在的情況下，田間有性生殖可能正在發(fā)生。后續(xù)應(yīng)開(kāi)展更大范圍的玉米小斑病菌的交配型檢測(cè)和育性分析，一方面分析小斑病菌發(fā)生有性重組的可能性，另一方面可以篩選高育性菌株，組建用于分析特定無(wú)毒基因的有性雜交組合，為開(kāi)展小斑病菌的遺傳研究提供試驗(yàn)材料，為研究小斑病菌的無(wú)毒性遺傳規(guī)律打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

四川玉米小斑病菌自然群體中 MAT1-1和MAT1-2兩種交配型的菌株普遍存在且均衡分布，多數(shù)為可育菌株，室內(nèi)誘導(dǎo)能夠獲得大量的有性世代，有性重組可能是玉米小斑病菌遺傳多樣性形成的一種潛在機(jī)制。盡管未見(jiàn)自然條件下小斑病菌有性世代的報(bào)道，但有性生殖可能正在發(fā)生，并在小斑病菌遺傳變異中起著重要作用。