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    蠟樣芽孢桿菌致吐毒素的毒性作用與生物合成研究進(jìn)展

    2021-08-12 06:17:32崔一芳鄭敏丁雙陽朱奎
    關(guān)鍵詞:蠟樣基因簇芽孢

    崔一芳,鄭敏,丁雙陽,朱奎?

    1北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100097;2中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià)中心,北京 100193

    蠟樣芽孢桿菌是一種在自然環(huán)境中廣泛分布,可產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽性桿菌。致病性蠟樣芽孢桿菌可產(chǎn)生多種毒素,是引起食物中毒的常見食源性條件致病菌之一[1]。致吐毒素cereulide是蠟樣芽孢桿菌分泌的主要毒素之一,能夠引發(fā)以惡心和嘔吐為主要臨床癥狀的食物中毒,嚴(yán)重的可導(dǎo)致急性肝臟衰竭、肝性腦病,并致死[2-4]。由cereulide引起的食物中毒癥狀因與金黃色葡萄球菌腸毒素導(dǎo)致的臨床癥狀相似,且癥狀輕微、病程較短,因而被低估和忽視[5]。實(shí)際上,美國(guó)報(bào)告了 1998—2008年,由蠟樣芽孢桿菌引發(fā)了235起食源性疾病[6]。法國(guó)統(tǒng)計(jì)了2007—2014年發(fā)生的140起食源性疾病,其中74起與蠟樣芽孢桿菌相關(guān),是僅次于金黃色葡萄球菌的第二大常見食源性病原菌,并且產(chǎn)生 cereulide的蠟樣芽孢桿菌檢出率為16%[7]。同樣德國(guó)2007—2013年食源性疾病的調(diào)查結(jié)果顯示,產(chǎn)cereulide的蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒風(fēng)險(xiǎn)被低估[8]。目前對(duì)于cereulide的毒性作用機(jī)制研究局限于其刺激傳入迷走神經(jīng)引起嘔吐癥狀,以及作為鉀離子載體,誘導(dǎo)線粒體膜電位喪失,并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9],而對(duì)于其導(dǎo)致的嚴(yán)重肝臟和腦部病變的毒性作用機(jī)制研究仍十分不足。

    另一方面,cereulide是由非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide-synthetase, NRPS)系統(tǒng)控制合成的一種親脂性小分子十二環(huán)肽,結(jié)構(gòu)性質(zhì)十分穩(wěn)定,并受基因及多種調(diào)節(jié)因子控制[1]。當(dāng)前對(duì)于cereulide導(dǎo)致的食物中毒癥狀并沒有良好的預(yù)防和治療方法[10-11],一般采用添加防腐劑抑制蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)的方法保障食品安全,但cereulide可在菌株被抑制前合成,并且一旦產(chǎn)生就難以被消除[12],因此缺乏針對(duì)cereulide的有效防控策略。此外,目前對(duì)于cereulide的生物合成過程,如合成基因簇各結(jié)構(gòu)域功能和調(diào)節(jié)因子的具體作用均不夠明確。

    值得注意的是,部分蠟樣芽孢桿菌作為益生菌被廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)療保健、畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域[13]。例如,美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)和飼料工業(yè)協(xié)會(huì)(American Feed Industry Association, AFIA)在1989年就批準(zhǔn)了蠟樣芽孢桿菌可作為直接應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)的菌種之一[14]。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 1996年也正式批準(zhǔn)蠟樣芽孢桿菌可作為飼料級(jí)微生物添加劑的菌種之一[15]。盡管目前益生菌的總體使用記錄顯示出較令人滿意的安全性結(jié)果,但相對(duì)于其應(yīng)用的廣泛度來說,益生菌的安全性并未受到充分鑒定[16]。例如,本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)益生芽孢桿菌的毒性和耐藥性進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估,發(fā)現(xiàn)菌株可產(chǎn)生多種毒素,其中便包括 cereulide[17-18]。此外,詳細(xì)綜述了蠟樣芽孢桿菌可能產(chǎn)生的多種毒素,包括毒素特征、毒性作用、合成機(jī)制及檢測(cè)方法,評(píng)估其對(duì)蠟樣芽孢桿菌作為益生菌使用的潛在危害[19]。

    本綜述旨在針對(duì)蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的主要毒素cereulide,整理其毒性作用機(jī)制研究進(jìn)展,為進(jìn)一步研發(fā)cereulide防控措施提供科學(xué)依據(jù);總結(jié)并提出其生物合成機(jī)理,對(duì)其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域在合成過程中的功能進(jìn)行了補(bǔ)充,為闡明類似結(jié)構(gòu)的非核糖體肽合成提供新的思路。

    1 Cereulide的毒性特征

    Cereulide是一種由兩個(gè)羥基酸和兩個(gè)氨基酸殘基[-D-HIC-D-Ala-L-HIV-L-Val-]經(jīng) 3次重復(fù)組成的三聚體環(huán)狀縮酚酞,分子量約為1 152 Da[20-21]。cereulide的環(huán)狀結(jié)構(gòu)外部為脂溶性,能夠與細(xì)胞膜結(jié)合;內(nèi)部為親水性,中間存在容納鉀離子的腔隙,可進(jìn)行鉀離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。cereulide是目前已知最強(qiáng)的鉀離子螯合劑,對(duì)動(dòng)物和人體細(xì)胞具有普遍的毒性作用[22]。此外,cereulide性質(zhì)十分穩(wěn)定,能夠耐高溫、耐酸堿,對(duì)各種蛋白酶水解作用都有一定的抵抗力,經(jīng)過食品加工或者胃腸道消化仍可保持活性[23-24]。例如,cereulide在121℃處理2 h后仍可保持生物活性,并對(duì)pH 2.0至 pH 11.0的環(huán)境耐受[25]。研究表明,滅活cereulide不僅需要高溫處理,還依賴于pH條件,如在pH 9.5的條件下,滅活6 μg·mL-1cereulide需在121℃暴露80min或在150℃暴露60 min[26]。

    目前統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),環(huán)境中僅有1%—2%的蠟樣芽孢桿菌菌株會(huì)產(chǎn)生cereulide[27],但在食品和臨床樣本中產(chǎn)cereulide菌株的流行率卻高達(dá)32.8%[8]。產(chǎn)cereulide的菌株通常存在于淀粉類食物如米飯和面食中,在蔬菜、水果、奶酪和肉類產(chǎn)品中也可分離到。此外,在植物根部、種子和昆蟲的腸道也發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)cereulide菌株[28]。因此,產(chǎn) cereulide菌株的廣泛流行,加之cereulide的穩(wěn)定性質(zhì)都對(duì)食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

    Cereulide通常引起惡心和嘔吐的臨床癥狀,癥狀一般在攝入cereulide污染的食物后0.5—6 h內(nèi)出現(xiàn),持續(xù)24 h后可自愈[19,29]。目前研究認(rèn)為,cereulide通過與胃腸道內(nèi)分布的5-HT3受體結(jié)合,刺激迷走神經(jīng)進(jìn)而引發(fā)嘔吐癥狀(圖 1-A)[30]。10 μg·kg-1的 cereulide即可誘導(dǎo)恒河猴出現(xiàn)嘔吐癥狀[31],而人的誘導(dǎo)劑量目前尚不清楚。一般來說,cereulide常以中低濃度水平暴露于食物中,有研究發(fā)現(xiàn)在餐館隨機(jī)收集的米飯樣本中,cereulide的檢出率為7.4%,平均濃度為4 ng·g-1[32]。但也有食物中低劑量cereulide(0.01—1.28 ng·g-1)導(dǎo)致食物中毒事件的報(bào)道,即體重70 kg的成年人攝入100 g此類食物便會(huì)出現(xiàn)嘔吐癥狀[33]。因此,低劑量的cereulide雖然不會(huì)立即引起嘔吐反應(yīng),但由于容易被忽視導(dǎo)致消費(fèi)者或反復(fù)暴露于亞致吐劑量,長(zhǎng)期可能會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生影響。

    Cereulide還可導(dǎo)致人的急性肝功能衰竭、心臟衰竭和腦部水腫等癥狀,嚴(yán)重的可致人死亡[4],但目前這些毒性作用機(jī)制都尚未研究清楚。當(dāng)前對(duì)于cereulide的毒性作用機(jī)制研究多集中于細(xì)胞毒性作用,如研究表明cereulide對(duì)多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有損傷作用[34]。cereulide可以使人喉癌細(xì)胞HEp2和人肝癌細(xì)胞 HepG2細(xì)胞空泡化和線粒體損傷[35-36];cereulide可導(dǎo)致人結(jié)腸腺癌細(xì)胞CaCo2、人肺腺癌細(xì)胞 Calu3、宮頸癌細(xì)胞 HeLa以及成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞Paju的損傷[37];還能抑制NK細(xì)胞,降低免疫力[35];低濃度的cereulide會(huì)誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡,這與糖尿病的發(fā)生密不可分[34,38]。最近,研究報(bào)道了cereulide對(duì) Caco2和HepG2細(xì)胞中線粒體的影響,特別是在HepG2細(xì)胞系中,低劑量的cereulide可以完全抑制線粒體的呼吸作用(圖1-B)[36,39]。

    此外,本團(tuán)隊(duì)前期研究分析了cereulide在兔體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)規(guī)律,cereulide在體內(nèi)的消除半衰期為(10.8±9.1)h[40],消除半衰期短解釋了cereulide引起短暫的嘔吐癥狀并一般為自限性的臨床特征,但其毒性的分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

    2 Cereulide的生物合成特征

    NRPS合成系統(tǒng)是一種大型的模塊化多酶復(fù)合物,參與多種天然產(chǎn)物的生物合成,如抗生素、表面活性劑和毒素[41]。其生物合成途徑可分為3類:線性(圖2-A),迭代型(圖2-B)和非線性(圖2-C)[42],其中模塊數(shù)量和順序與產(chǎn)物肽中氨基酸的數(shù)量和順序相匹配,并且各個(gè)模塊通過催化反應(yīng)與保守結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用,以定向方式將單體結(jié)合到天然產(chǎn)物肽中,從而確定最終產(chǎn)物的化學(xué)特性。其中腺苷酸化(adenylation, A)結(jié)構(gòu)域,肽基載體蛋白(peptide carrier protein, PCP)或硫醇化(thiolation, T)結(jié)構(gòu)域、縮合(Ccondensation, C)結(jié)構(gòu)域以及硫酯酶(thioesterase, TE)結(jié)構(gòu)域是NRPS合成的基本功能單元。合成過程一般為:首先,A域通過腺苷酸化作用特異性識(shí)別底物并激活合成前體;其次,PCP域負(fù)責(zé)攜帶不斷增長(zhǎng)的天然產(chǎn)物鏈在每個(gè)模塊間穿梭,以此不斷催化肽鏈延伸;C域一般位于模塊末端,通過形成酰胺鍵或酯鍵催化鏈增長(zhǎng);最后,一旦非核糖體肽的合成完成,成熟的肽鏈將被轉(zhuǎn)移到NRPS末端的TE域,通過水解釋放線性肽,或通過分子內(nèi)親核攻擊形成環(huán)狀肽[43]。

    Cereulide是NRPS迭代型合成途徑的典型產(chǎn)物,由ces基因簇(cereulide synthetase gene cluster)控制合成[44]。ces基因簇位于大小約270 kb的質(zhì)粒上,該質(zhì)粒與炭疽芽孢桿菌的毒力質(zhì)粒 pXO1具有高度相似性[45]。ces基因簇包括cesH、cesP、cesT、cesA、cesB、cesC和cesD等7個(gè)主要編碼區(qū)。cesA和cesB是典型的NRPS系列基因,負(fù)責(zé)cereulide肽鏈結(jié)構(gòu)的組裝;cesP是4'-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶基因,對(duì)于激活cereulide合成系統(tǒng)至關(guān)重要;cesT推測(cè)為II型硫酯酶基因,可以去除引發(fā)錯(cuò)誤的單體;此外,cesH位于5'末端,推定為編碼水解酶的基因;cesC/D位于3'端,推測(cè)為編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因(圖3-B)[46-47]。

    ces基因簇的轉(zhuǎn)錄是在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期開始,并在轉(zhuǎn)變至穩(wěn)定期后迅速關(guān)閉[48]。這種嚴(yán)格的時(shí)間調(diào)控是依賴于如AbrB、Spo0A和CodY等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子實(shí)現(xiàn)的。在蠟樣芽孢桿菌中,AbrB和Spo0A調(diào)節(jié)子與芽孢的形成相關(guān),而 CodY的功能是調(diào)節(jié)細(xì)菌染色體與ces基因簇所在質(zhì)粒間的信號(hào)傳導(dǎo),進(jìn)一步將細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和能量狀態(tài)與致病性聯(lián)系起來[49]。cereulide的合成除受細(xì)菌內(nèi)部基因調(diào)控之外,還受所在環(huán)境因素的影響。例如,蠟樣芽孢桿菌合成cereulide的最適溫度為20—30 ℃,并且依賴氧氣的存在,有研究表明在氧濃度低于1%—2%的條件下,菌株將不會(huì)產(chǎn)生cereulide[28]。此外,營(yíng)養(yǎng)條件、pH、濕度和NaCl等因素都會(huì)影響cereulide的產(chǎn)生[50-51],但這些外部信號(hào)如何被細(xì)菌感知,轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)節(jié)cereulide的合成過程這些問題均未闡明。

    3 Cereulide的生物合成過程

    隨著近年來對(duì)NRPS合成天然產(chǎn)物的研究增多,cereulide的生物合成過程也得到了進(jìn)一步探索。MAGARVEY等提出ces-NRPS識(shí)別的底物并不全是氨基酸,酮酸也是識(shí)別底物之一,例如CesA1的A結(jié)構(gòu)域識(shí)別的是 α-酮基羧酸(D-α-ketocarboxylic acids,KIC),CesB1識(shí)別的底物為 α-酮異戊酸(L-αketoisovaleric acid, KIV),并提出了酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域的作用[20]。此外,有研究提出了關(guān)于cereulide生物合成的新概念,即二肽是形成cereulide肽鏈的基礎(chǔ)單元,而不是單個(gè)氨基酸或羥基酸作為組裝的基本模塊[52]。并將CesA末端的縮合結(jié)構(gòu)域描述為C*域,該結(jié)構(gòu)域的功能是酯合酶而不是酰胺合酶,推測(cè)其在cereulide肽鏈的最終環(huán)化過程中與TE結(jié)構(gòu)域協(xié)同酯化作用[21]。

    在現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道和研究數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,我們總結(jié)并提出了cereulide的生物合成機(jī)理,并著重探討TE結(jié)構(gòu)域和KR結(jié)構(gòu)域在cereulide合成中的迭代和環(huán)化作用,如圖3-A所示:

    (1)二肽的合成:cereulide的主要合成單元,CesA由A-PCP-C-A-E-C*結(jié)構(gòu)域組成,CesB包含A-PCP-APCP-TE結(jié)構(gòu)域。首先,CesA1,CesA2,CesB1和CesB2 分別識(shí)別D-α-酮羧酸(KIC),L-丙氨酸(Ala),L-α-酮異戊酸(KIV)和L-纈氨酸(Val)。然后,通過KR域?qū)ⅵ?KIC(CesA1)和α-KIV(CesB1)分別還原為D-α-羥基異己酸(HIC)和L-α-羥基異戊酸(HIV)。PCP結(jié)構(gòu)域通過4'-磷酸泛酰巰基乙胺的巰基捕獲活化的前體物質(zhì),C結(jié)構(gòu)域催化下游PCP結(jié)合的單體,并對(duì)上游PCP結(jié)合的單體進(jìn)行親核攻擊,最終共價(jià)結(jié)合形成二肽。

    (2)四肽的合成:依照上述過程,CesA和CesB分別合成D-HIC-D-Ala和L-HIV-L-Val,C*結(jié)構(gòu)域催化酯鍵的形成,釋放 PCP上結(jié)合的四肽D-HIC-DAla-L-HIV-L-Val,該四肽隨后轉(zhuǎn)移至 CesB末端 TE結(jié)構(gòu)域的絲氨酸羥基(Ser-OH)上。

    (3)十二肽的環(huán)化:通過重復(fù)反應(yīng)合成第二個(gè)四肽,兩個(gè)四肽通過酯化形成八肽;再次重復(fù)上述反應(yīng),形成三元絡(luò)合的產(chǎn)物肽。由于ces-NRPS的TE結(jié)構(gòu)域活性中心表面結(jié)構(gòu)阻止外部水分子進(jìn)入,并誘導(dǎo)內(nèi)部親核攻擊反應(yīng),最后 TE結(jié)構(gòu)域催化中間反應(yīng)并釋放環(huán)狀的cereulide。

    3.1 KR結(jié)構(gòu)域的迭代作用-酯鍵的形成

    Cereulide是十二環(huán)肽,由交替的6個(gè)酰胺鍵和6個(gè)酯鍵連接而成。ces-NRPS具有兩個(gè)A結(jié)構(gòu)域,其中在a8和a9之間插入了一個(gè)KR結(jié)構(gòu)域(圖3-B)[20,53]。KR的功能是利用NADPH作為輔助因子,催化α-酮酸還原為α-羥基酸,是酯鍵形成的基礎(chǔ)[52]。其他研究也證明了 KR結(jié)構(gòu)域的還原作用,例如在放線菌kutzerides合成中的KR結(jié)構(gòu)域蛋白KtzG,以及鏈霉菌antimycins合成過程中的KR結(jié)構(gòu)域蛋白AntC,均參與催化 α-酮酸的還原[54-55]。不同的是,kutzerides和antimycins合成基因簇中的KR結(jié)構(gòu)域未插入A結(jié)構(gòu)域中,而是位于A和PCP結(jié)構(gòu)域之間并形成獨(dú)立部分。此外,真菌的環(huán)二肽合成酶系統(tǒng)(cyclodepsipeptide synthetase systems)合成的如enniation和bassianolide,這些肽類同 cereulide類似,也由酯鍵鏈接,但與細(xì)菌NRPS系統(tǒng)不同的是,真菌環(huán)二肽合成酶簇的A結(jié)構(gòu)域可直接利用α-羥酸,無需KR結(jié)構(gòu)域進(jìn)行催化還原[56]。總之,細(xì)菌NRPS系統(tǒng)的組成是靈活的,通過了解多肽類天然產(chǎn)物的迭代形成過程,可為后期通過基因工程、合成生物學(xué)和其他手段獲得理想產(chǎn)物提供新的思路。

    3.2 TE結(jié)構(gòu)域的環(huán)化作用

    許多NRPS合成的天然產(chǎn)物TE結(jié)構(gòu)域的功能已得到良好闡述,其功能主要為:活性絲氨酸殘基攻擊PCP結(jié)構(gòu)域結(jié)合的中間肽,并使之與TE結(jié)構(gòu)域結(jié)合,成熟肽最終通過水解或環(huán)化作用從TE結(jié)構(gòu)域釋放,形成線性肽或環(huán)肽(圖3-B)[57-58]。例如,有研究分析了枯草芽孢桿菌surfactin的TE結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu),SrfTE是一個(gè)含有碗狀活性位點(diǎn)的球狀結(jié)構(gòu)域[59]。并且與典型的α/β水解酶家族一樣,SrfTE域也具有保守的Ser-His-Asp催化三聯(lián)體[43,60]。因此,推測(cè)cereulide的TE結(jié)構(gòu)域“肽結(jié)合袋”表面分布有大量疏水殘基形成疏水環(huán)境,外部水分子被阻攔,分子內(nèi)羥基或氨基對(duì)羰基碳發(fā)起親核攻擊,最終通過形成內(nèi)酯或內(nèi)酰胺釋放環(huán)肽。

    此外,也有研究表明若 TE結(jié)構(gòu)域活性中心位點(diǎn)上氨基酸為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、剛性的脯氨酸時(shí),則會(huì)形成環(huán)狀產(chǎn)物;當(dāng)脯氨酸被骨架柔軟的氨基酸替代時(shí),外部水分子進(jìn)入 TE結(jié)合口袋充當(dāng)親核試劑,則會(huì)形成線性肽[58]。總之,阻止外部水分子進(jìn)入TE的“肽結(jié)合袋”,是形成環(huán)狀產(chǎn)物的關(guān)鍵。另一方面,我們認(rèn)為TE結(jié)構(gòu)域也具有調(diào)節(jié)迭代次數(shù)的功能。例如,enniation也含有3個(gè)重復(fù)單元,其C末端的TE結(jié)構(gòu)域被PCP-C結(jié)構(gòu)域取代,這表明TE結(jié)構(gòu)域和PCP-C結(jié)構(gòu)域可能具有相似的功能或核心位點(diǎn),而PCP域的功能便是控制天然產(chǎn)物鏈的延伸長(zhǎng)度[43]。

    4 結(jié)語

    綜述了蠟樣芽孢桿菌主要毒素cereulide的毒性作用和生物合成過程,其毒性作用機(jī)制主要包括:與5-HT3受體結(jié)合,刺激傳入迷走神經(jīng)引起嘔吐;誘導(dǎo)線粒體膜電位耗竭,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。然而,cereulide導(dǎo)致的急性肝衰竭、心力衰竭、橫紋肌溶解和腦部病變等毒性作用的機(jī)制尚不清楚。此外,在綜述cereulide的生物合成過程中,筆者強(qiáng)調(diào)了催化酮酸形成酯的酮還原酶(KR)域,及形成重復(fù)單元和環(huán)肽的硫酯酶(TE)域在cereulide合成過程中的迭代和環(huán)化作用。并且這種作用并不僅限于 cereulide,而是可以作為NRPS系統(tǒng)生物合成環(huán)狀迭代天然產(chǎn)物的推廣分析,為后期通過基因工程、合成生物學(xué)和其他手段獲得理想產(chǎn)物等研究提供科學(xué)依據(jù)。

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