蜂膠提取物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性乳腺炎及乳腺屏障功能的保護(hù)作用

宋美潔，歐愛(ài)群,2，薛曉鋒，吳黎明，壽旗揚(yáng)，王凱?

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福州 350000；3浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)院，杭州 310027

0 引言

【研究意義】奶牛乳腺炎是由多種因素引起并嚴(yán)重影響奶牛業(yè)發(fā)展的重要疾病，造成了世界范圍內(nèi)乳業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失，如產(chǎn)奶量下降，牛奶品質(zhì)降低，疾病治療費(fèi)用的增加等，至今尚未有徹底解決的辦法[1-2]。乳腺炎的發(fā)生取決于宿主、病原和環(huán)境因素的相互作用，而病原微生物侵染是導(dǎo)致奶牛乳腺炎的主要原因，其中環(huán)境性致病菌的危害尤以大腸桿菌感染突出，可導(dǎo)致奶牛食欲不振、死亡率升高等，嚴(yán)重?fù)p害奶牛群體健康[3-5]。而大腸桿菌中的脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）可引起乳腺的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)[6]，是大腸桿菌的關(guān)鍵毒力因子[7]。當(dāng)前，采用抗生素治療奶牛乳腺炎而導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)及抗生素殘留，給人類(lèi)健康帶來(lái)巨大威脅[8]。因此，有必要探索一種綠色、安全、高效的防治乳腺炎的方法?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蜂膠是由西方蜜蜂（ApismelliferaL.）工蜂采集植物樹(shù)脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠黏性物質(zhì)，其富含酚酸和黃酮類(lèi)化合物，具有多種生物學(xué)活性與藥理作用[9-10]。多種研究表明蜂膠可有效殺滅乳腺炎致病菌，可作為佐劑以增強(qiáng)疫苗的免疫力，且一些研究將蜂膠用于制作乳腺擦劑和乳頭保護(hù)膜來(lái)抵御乳腺炎，已被應(yīng)用于獸醫(yī)臨床[11-14]。另一方面，乳腺上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)形成的屏障結(jié)構(gòu)是乳腺炎在發(fā)生過(guò)程中防止有害物質(zhì)進(jìn)入血液和選擇性釋放細(xì)胞因子進(jìn)入乳汁腔的重要關(guān)卡，也是血液和乳汁腔內(nèi)有機(jī)交互的關(guān)鍵，對(duì)于奶牛的泌乳啟動(dòng)、維持和退化均有重要意義[15]，血乳屏障功能主要依靠上皮細(xì)胞完整性及細(xì)胞間連接方式協(xié)同實(shí)現(xiàn)。緊密連接是構(gòu)成血乳屏障完整結(jié)構(gòu)的主要成分，其主要由咬合蛋白（occludin）、緊密連接蛋白（claudin-1）等連接而成，并與閉鎖小帶緊密連接蛋白-1（ZO-1）及細(xì)胞骨架蛋白直接或間接結(jié)合，形成穩(wěn)定的連接結(jié)構(gòu)，任何蛋白的丟失均可導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)完整性的破壞[16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管筆者前期研究證實(shí)蜂膠對(duì)于各種病原微生物引起的乳腺上皮細(xì)胞炎癥有明顯的改善作用[11,17]，但蜂膠抗乳腺炎的系統(tǒng)研究仍很匱乏，對(duì)抗乳腺炎的作用機(jī)制仍未清楚，特別是蜂膠與乳腺屏障功能和緊密連接間的作用機(jī)制也需在體內(nèi)試驗(yàn)層面上進(jìn)一步探究。系統(tǒng)挖掘蜂膠對(duì)乳腺炎的保護(hù)作用機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，將對(duì)蜂膠在奶牛乳腺炎防治中的應(yīng)用產(chǎn)生重大的指導(dǎo)意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】富含生物活性化合物的低蠟蜂膠提取物最常用乙醇作為溶劑進(jìn)行提取[18-20]。此外，小鼠乳腺炎模型已被證明可模擬牛乳腺炎，并且可用于研究乳腺炎病原體在乳腺內(nèi)感染的特異性宿主免疫應(yīng)答，是一種有效、可重復(fù)的體內(nèi)替代方法[21-22]。故本次研究通過(guò)建立LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺組織炎性損傷模型，在明確中國(guó)蜂膠乙醇提取物中主要活性組分的基礎(chǔ)上，從體內(nèi)試驗(yàn)的層面上來(lái)探索、闡明中國(guó)蜂膠乙醇提取物（ethanol extract of Chinese propolis, EECP）對(duì)LPS誘導(dǎo)乳腺炎的作用機(jī)制，以期為蜂膠在防治奶牛乳腺炎的應(yīng)用上提供新的思路和潛在藥物靶點(diǎn)，進(jìn)一步并為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

動(dòng)物試驗(yàn)于2019年10—11月在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。其余試驗(yàn)于2019年7月至2020年1月、2020年10月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所完成。

1.1 主要材料與試劑

蜂膠樣品為中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠，于2017年11月采自山東省泰安市實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)條件：動(dòng)物試驗(yàn)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)施（試驗(yàn)設(shè)施執(zhí)照為 SYXK-JING-2015-0046）。32只雌性 ICR 小鼠（10周齡，30—32 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量認(rèn)證號(hào)為SCXK-JING-2016-0006）。8只/籠飼養(yǎng)于光照（12 h晝夜循環(huán)）和溫度（20—23℃）穩(wěn)定的房間內(nèi)，并持續(xù)供應(yīng)經(jīng)過(guò)濾的無(wú)病原菌的空氣，保持室內(nèi)相對(duì)濕度為50%。小鼠自由采食飲水，飲食供應(yīng)為商業(yè)化無(wú)污染（SPF級(jí)）飼料。試驗(yàn)嚴(yán)格遵守浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利規(guī)章制度，并通過(guò)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行。

主要試劑：咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、桑色素、咖啡酸苯乙基酯、柚皮素、芹菜素、柯因、楊梅素、槲皮素、高良姜素、松屬素、香草酸、短葉松素、短葉松素三乙酸酯、3,4-二甲氧基肉桂酸、沒(méi)食子酸、蘆丁等標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma 公司）；色譜純甲醇、乙醇、乙腈（美國(guó)MREDA technology 公司）；脂多糖（Lipopo1ysaccharide 來(lái)源于大腸桿菌 0111：B4，美國(guó)Sigma公司）；黃蓍膠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無(wú)水乙醇、二甲苯、石炭酸 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；4%多聚甲醛、地塞米松（Dexamethasone, DEX）（北京索萊寶科技有限公司）；蘇木素染液、伊紅染液 （上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、天狼星紅染色液（杭州浩克生物科技有限公司）；Occludin 抗體、ZO-1 抗體（美國(guó)Proteintech公司）；ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢華美生物有限公司）；DAB顯色試劑盒（美國(guó)Abcam公司）；CarryHelix RNA 提取試劑盒（北京佳利恒達(dá)生物科技有限公司）、PrimeScript RT Master kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green?Premix Ex Taq II試劑盒（日本Takara 公司）；RT-qPCR引物（生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；一抗（Occludin、ZO-1）、羊抗兔二抗（HRP）（美國(guó)proteintech 公司）。

1.2 主要儀器

N-EVAP112氮吹儀購(gòu)自美國(guó) Organomation公司；SY-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自南京昕?jī)x生物科技有限公司；KQ-500超聲清洗儀購(gòu)自杭州法特超聲波科技有限公司；6470B UHPLC-QqQ-MS/MS購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；Milii-Q純水機(jī)購(gòu)自美國(guó)Millinpore公司；Nanodrop 2000型分光光度計(jì)、PCR擴(kuò)增儀和熒光定量 PCR儀均購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher公司；DYY-6D型電泳儀購(gòu)自上海華科實(shí)驗(yàn)器材有限公司；SpectraMax iD5酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器（上海）有限公司；微孔板恒溫振蕩儀購(gòu)自上海虔鈞科學(xué)儀器有限公司；組織脫水機(jī)購(gòu)自北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司；石蠟包埋機(jī)購(gòu)自輔光精密儀器（上海）有限公司；石蠟切片機(jī)購(gòu)自杭州艾普儀器設(shè)備有限公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自北京博恒遠(yuǎn)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 中國(guó)蜂膠乙醇提取物的制備 參考文獻(xiàn)[23]的方法，將采集到的蜂膠敲碎，稱(chēng)取100 g的粗蜂膠粉末，加入 95% 乙醇1L，放在超聲儀中40℃超聲3 h，取出燒杯靜置過(guò)夜后取上清。將獲得的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至恒重，放入冰箱中-20℃保存待用。

1.3.2 超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜（UHPLC-QqQ-MS/MS）分析EECP多酚類(lèi)化合物 采用超高效液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)EECP中多酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行成分分析，在負(fù)離子模式下用色譜柱proshell 120 SB-C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，2.7 μm）進(jìn)行提取物分離。流動(dòng)相由甲酸水（0.1% v / v）溶液（A）和乙腈（B）組成，流速為0.25 mL·min-1，40℃下梯度洗脫。梯度洗脫程序如下：0—1 min，5%B；1—6 min，5%—55% B；6—20 min，55%—95% B；20—27 min，95% B。進(jìn)樣體積為2 μL，后運(yùn)行時(shí)間為3 min。質(zhì)譜條件如下：氣體溫度為300℃；氣體流速為11 L·min-1；噴霧器壓力為40 psi；毛細(xì)管電壓為3 500 v；鞘氣溫度為350℃；鞘氣流速為10 L·min-1。

使用 Mass Hunter軟件（版本 B 8.0，Agilent Technologies）進(jìn)行分析并獲得LC-MS數(shù)據(jù)。試驗(yàn)重復(fù) 3次，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。

1.3.3 小鼠乳腺炎模型建立 將32只ICR母鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，試驗(yàn)分組與設(shè)計(jì)如下：

空白對(duì)照組：灌胃 7d黃蓍膠溶液（0.5%），最后一天灌胃1 h后經(jīng)呼吸麻醉機(jī)異氟烷氣體，麻醉后進(jìn)行仰臥保定，將其第四、五對(duì)乳區(qū)用75%的酒精進(jìn)行消毒，用滅菌后的眼科剪剪去乳頭尖端 1mm，暴露出乳導(dǎo)管，之后用圓鈍型微量注射器吸取生理鹽水緩慢注入到乳導(dǎo)管中，經(jīng)注射處理后，置于籠中飼養(yǎng)24 h后，仰臥保定；摘除眼球處死，用75%的酒精對(duì)小鼠腹部進(jìn)行消毒，收集乳腺組織；部分組織置于4%的多聚甲醛，剩余組織-80℃保存待用。處死前4 h最后一次灌胃0.5%的黃蓍膠溶液（圖1）。

模型組：灌胃7 d黃蓍膠溶液（0.5%），最后一天灌胃1 h后經(jīng)呼吸麻醉機(jī)異氟烷氣體，麻醉后進(jìn)行仰臥保定，將其第四、五對(duì)乳區(qū)用75%的酒精進(jìn)行消毒，用滅菌后的眼科剪剪去乳頭尖端 1 mm，暴露出乳導(dǎo)管，之后用圓鈍型微量注射器吸取LPS緩慢注入到乳導(dǎo)管中，經(jīng)LPS（1 mg·kg-1）注射處理后，置于籠中飼養(yǎng)24 h后，仰臥保定；摘除眼球處死，用75%的酒精對(duì)小鼠腹部進(jìn)行消毒，收集乳腺組織；部分組織置于4%的多聚甲醛，剩余組織-80℃保存待用。處死前4 h最后一次灌胃0.5%的黃蓍膠溶液。

中國(guó)蜂膠乙醇提取物試驗(yàn)組：灌胃7 d 100 mg·kg-1的中國(guó)蜂膠乙醇提取物，最后一天灌胃1 h后經(jīng)呼吸麻醉機(jī)異氟烷氣體，麻醉小鼠，第四、五對(duì)乳頭管灌注1mg·kg-1的LPS，24 h后處死，處死前4 h最后一次灌胃中國(guó)蜂膠乙醇提取物。

陽(yáng)性對(duì)照組：灌胃 7 d 5 mg·kg-1的地塞米松（dexamethasone, DEX），最后一天灌胃1 h后后經(jīng)呼吸麻醉機(jī)異氟烷氣體，麻醉小鼠，第四、五對(duì)乳頭管灌注1 mg·kg-1的LPS，24 h后處死，處死前4 h最后一次灌胃DEX。

1.3.4 乳腺病理切片的制作及觀察 將乳腺組織從小鼠體內(nèi)分離，立即用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，12 h后換相同固定液，繼續(xù)固定12 h，后石蠟包埋，切片。將制作好的石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-無(wú)水乙醇Ⅰ10 min-無(wú)水乙醇Ⅱ10 min-95%酒精5 min-90%酒精5 min-80%酒精5 min-70%酒精5 min-蒸餾水洗。

蘇木精-伊紅染色：將切片放入蘇木素染液中染色20 min；用分化液分化30s；自來(lái)水浸泡15 min；用伊紅染液復(fù)染2 min；用自來(lái)水浸泡2 min。用95%乙醇脫水2次，再用100%乙醇脫水2次，每次為1 min。經(jīng)脫水后的切片放入二甲苯石炭酸（3﹕1）中1 min，再放入二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）中各 1 min，用中性樹(shù)膠封固，鏡下觀察。

天狼猩紅染色液染色： 切片入飽和苦味酸天狼猩紅染色液內(nèi)染色8min，后將切片入無(wú)水酒精漂洗數(shù)分鐘，用中性樹(shù)膠封固，鏡下觀察。

1.3.5 乳腺組織炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-10的檢測(cè) 稱(chēng)取小鼠乳腺組織100 mg，剪成小塊放入1.5 mL的離心管中，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。

1.3.6 乳腺組織緊密連接蛋白基因mRNA表達(dá)測(cè)定

（1）RNA提取 稱(chēng)取20 mg左右的乳腺組織，加600 μL的組織裂解液，用電動(dòng)勻漿儀勻漿。將組織勻漿均勻接種到六孔板中，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。先往組織勻漿中加入15 μg·mL-1的EECP預(yù)處理2 h，接著加LPS（1 μg·mL-1）處理12 h，收集處理好的組織。參考王蓓等[25]的方法，采用 CarryHelix RNA 提取試劑盒進(jìn)行乳腺組織總RNA的提取。

（2）cDNA合成 按照 PrimeScript RT Master kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求操作加樣，反應(yīng)體系如表1所示。37℃反應(yīng)15 min、85℃反應(yīng)5 s，反轉(zhuǎn)錄的cDNA保存在-20℃。

表1 RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系Table 1 RNA reverse transcription reaction system

（3）引物設(shè)計(jì)與合成 試驗(yàn)所用引物均由上海生工生物有限公司合成，引物序列信息見(jiàn)表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)引物序列Table 2 The primer sequence of related genes in RT-qPCR

（4）熒光定量PCR 以cDNA為模板，按照 TB Green? Premix Ex Taq II試劑盒要求操作加樣，反應(yīng)體系如表3所示。以GAPDH作為管家基因，利用相對(duì)定量（ΔΔCт）法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系Table 3 Real-time fluorescent quantitative PCR reaction system

1.3.7 乳腺組織緊密連接蛋白免疫組織化學(xué)染色病理切片的制作參照 1.3.4，-20℃冷凍保存。取出切片室溫放置30 min，丙酮固定30 min，用PBS清洗；用3% H2O2甲醇液孵育30 min，然后，PBS清洗；用一抗工作液（Occludin：1﹕100；ZO-1﹕1﹕50）37℃孵育1 h后4℃過(guò)夜；PBS清洗，用二抗工作液（1﹕1 000）37℃ 孵育1 h；PBS清洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，在37℃下孵育30 min；PBS清洗，用 DAB試劑顯色；最后，脫水，透明，中性樹(shù)膠封閉，在顯微鏡下拍照觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，利用one-way ANOVA法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)并作圖。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜（UHPLCQqQ-MS/MS）分析多酚類(lèi)化合物方法學(xué)評(píng)價(jià)

蜂膠提取物中的功能活性成分與多酚類(lèi)化合物的種類(lèi)和含量相關(guān)，試驗(yàn)首先基于超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜（UHPLC-QqQ-MS/MS），對(duì)色譜條件及質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，建立了相應(yīng)的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，具體試驗(yàn)參數(shù)詳見(jiàn)1.3.2。通過(guò)添加回收率來(lái)驗(yàn)證方法準(zhǔn)確性。在 5、10、20 μg·mg-1共 3 個(gè)添加水平下，進(jìn)行蜂膠提取物的添加回收試驗(yàn)，結(jié)果表明：蜂膠提取物中17種多酚類(lèi)化合物的添加回收率在70.2%—120.1%范圍內(nèi)（表4），可實(shí)現(xiàn)EECP中多酚類(lèi)成分的精確定量。

表 4 中國(guó)蜂膠乙醇提取物中代表性多酚類(lèi)化合物的回收率和精密度Table 4 Recoveries and precisions of the 17 polyphenols in Chinese poplar propolis

2.2 UHPLC-QqQ-MS/MS法測(cè)定中國(guó)蜂膠乙醇提取物中主要多酚類(lèi)成分

課題組前期采用福林酚法和硝酸鋁法測(cè)定EECP中總酚酸和總黃酮含量，測(cè)得該中國(guó)山東楊樹(shù)型蜂膠乙醇提取物中總酚酸含量為106.35 mg GAE·g-1，總黃酮含量為320.85 mg RE·g-1[17]。本研究進(jìn)一步利用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜對(duì)EECP中主要的化學(xué)成分進(jìn)行分析，結(jié)果如表5所示，EECP中的多酚類(lèi)成分主要包括咖啡酸、咖啡酸苯乙酯、柯因、高良姜素、松屬素、短葉松素、3, 4-二甲氧基肉桂酸以及短葉松素三乙酸酯，其中又以高良姜素（12.88±0.57 μg·mg-1）、短葉松素 3-乙酸酯（12.93±0.59 μg·mg-1）、松屬素（8.56±0.27 μg·mg-1）和短葉松素（8.52±0.25 μg·mg-1）的含量最高。

表5 中國(guó)蜂膠乙醇提取物中主要的多酚類(lèi)物質(zhì)成分Table 5 Major polyphenolic constituents in EECP

2.3 中國(guó)蜂膠乙醇提取物對(duì) LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺炎乳腺組織病理變化的影響

中國(guó)蜂膠乙醇提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺炎乳腺組織病理切片觀察結(jié)果如圖2、3所示，H.E染色結(jié)果表明，對(duì)照組乳腺組織腺泡結(jié)構(gòu)完整，無(wú)肉眼可見(jiàn)的病理變化，乳腺管和腺泡中沒(méi)有觀察到嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。LPS處理組可觀察到乳腺組織腺泡結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，且伴隨有炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。與LPS處理組相比，中國(guó)蜂膠乙醇提取物處理組和陽(yáng)性對(duì)照組能夠有效減輕 LPS刺激下的炎性癥狀，如腺泡結(jié)構(gòu)、大小較為正常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)乳腺管和腺泡的數(shù)量減少。利用天狼星紅染色可見(jiàn)，乳腺管等膠原纖維被染成紅色，肌纖維被染成黃色，LPS刺激導(dǎo)致膠原陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，即藥物處理可有效提示膠原染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。這些結(jié)果也清楚說(shuō)明中國(guó)蜂膠乙醇提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺細(xì)胞炎癥病理變化具有顯著的保護(hù)作用。

2.4 中國(guó)蜂膠乙醇提取物對(duì) LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺炎組織中炎癥因子表達(dá)的影響

利用ELISA法對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺炎乳腺組織中炎癥因子的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。由圖 4可知，LPS處理組乳腺組織中IL-1β, IL-6和IL-10的表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），而連續(xù)灌胃一周中國(guó)蜂膠乙醇提取物的小鼠乳腺組織中，其炎癥因子的表達(dá)水平顯著低于LPS處理組（P＜0.05）。此外，陽(yáng)性對(duì)照組與LPS處理組相比，對(duì)炎癥因子的抑制作用優(yōu)于中國(guó)蜂膠乙醇提取物處理組；單因素差異分析發(fā)現(xiàn)，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，EECP處理組未表現(xiàn)出顯著差異（P＞0.05）。以上的結(jié)果說(shuō)明，中國(guó)蜂膠乙醇提取物能夠抑制LPS刺激小鼠乳腺組織中炎癥因子的釋放。

2.5 中國(guó)蜂膠乙醇提取物對(duì)乳腺組織緊密連接蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

由圖5可得，與空白組相比，LPS處理組顯著降低了乳腺組織中緊密連接蛋白Occludin、Cluadin-1、ZO-1mRNA的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05）。對(duì)檢測(cè)連續(xù)灌胃一周100 mg·mL-1EECP小鼠其乳腺組織中緊密連接蛋白基因Occludin、Cluadin-1、ZO-1mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于 LPS處理組（P＜0.05）。此外，陽(yáng)性對(duì)照組（DEX處理組）與LPS處理組相比，緊密連接蛋白Occludin、Cluadin-1、ZO-1mRNA的轉(zhuǎn)錄量也顯著上升（P＜0.05）。而中國(guó)蜂膠提取物試驗(yàn)組（EECP處理組）與陽(yáng)性對(duì)照組（DEX處理組）的緊密連接蛋白Occludin、Cluadin-1、ZO-1mRNA的轉(zhuǎn)錄量差異不顯著，且其效果與陽(yáng)性藥物地塞米松（5 mg·kg-1）相類(lèi)似。

2.6 中國(guó)蜂膠乙醇提取物對(duì)乳腺組織緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1表達(dá)的影響

對(duì)免疫組化結(jié)果（圖6，7）分析可得，在正常的乳腺組織中Occludin和ZO-1定位于細(xì)胞膜上，且細(xì)胞之間的緊密連接結(jié)構(gòu)完整。但經(jīng)乳頭管灌注 1 mg·kg-1的LPS后兩種蛋白的表達(dá)量顯著下降，細(xì)胞邊界變模糊且細(xì)胞間的空隙變大。與LPS處理組相比，中國(guó)蜂膠乙醇提取物處理組跟 DEX處理組乳腺組織中兩種緊密連接蛋白的表達(dá)量增加，細(xì)胞邊界變得清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)也較為完整。結(jié)果表明，中國(guó)蜂膠乙醇提取物能夠有效減弱LPS降低乳腺組織中緊密連接蛋白表達(dá)的作用效果，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)乳腺組織緊密連接的作用。

3 討論

近年來(lái)，本課題組一直致力于蜂膠在預(yù)防或治療炎癥性疾病方面的研究[11,17,23-27]。植物化學(xué)成分分析研究結(jié)果表明，本研究所使用的中國(guó)蜂膠乙醇提物（EECP）中主要活性組分包括柯因、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、槲皮素和松屬素等多酚類(lèi)化合物，此結(jié)果與前期有關(guān)蜂膠化學(xué)組成的研究報(bào)道基本一致[11,28-29]。這也為后續(xù)進(jìn)一步研究單一組分對(duì)奶牛乳腺炎的預(yù)防治療作用及相關(guān)藥物研制提供參考。

乳腺炎是由乳房組織感染引起的炎癥反應(yīng)，造成乳腺組織感染的因素復(fù)雜多樣，主要包括有外界刺激、生活環(huán)境、病原微生物和乳腺組織遭到機(jī)械損傷，而絕大部分奶牛乳腺炎由病原微生物粘附乳腺組織引起[1,3]。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的重要組成成分，據(jù)報(bào)道，LPS刺激乳腺組織后，會(huì)造成腺泡上皮細(xì)胞脫落、形狀和大小發(fā)生改變，并伴隨有炎性細(xì)胞（中性粒細(xì)胞）的大量浸潤(rùn)以及乳腺組織發(fā)生充血，前人研究發(fā)現(xiàn)，灌胃高劑量蒲公英甾醇可使大鼠乳腺組織中乳腺腺泡上皮細(xì)胞脫落、組織出血等狀況顯著改善[30]。在本研究中，乳腺組織病理切片結(jié)果表明，EECP同樣能夠顯著減輕LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺組織所引起的腺泡結(jié)構(gòu)破壞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷，表明EECP具有良好的抗乳腺炎效果。

此外，細(xì)胞因子是細(xì)胞間信息交換的關(guān)鍵信使分子，參與調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)和炎癥反應(yīng)。大量研究表明，蜂膠中的多酚類(lèi)化合物能夠顯著抑制LPS刺激下乳腺組織中炎癥因子的表達(dá)[31-32]。而本研究中乳腺組織上清ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，EECP可顯著抑制炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-10的表達(dá)。故本研究進(jìn)一步證實(shí)了EECP可通過(guò)減輕乳腺組織病理?yè)p傷和降低炎癥因子的表達(dá)來(lái)達(dá)到保護(hù)小鼠免受LPS侵害的作用。

上皮和內(nèi)皮屏障的完整性是體內(nèi)平衡所必需的，它是由稱(chēng)為緊密連接的細(xì)邊緣結(jié)構(gòu)維持的。在危重癥疾病中，緊密連接可能被破壞，導(dǎo)致屏障功能障礙，表現(xiàn)為毛細(xì)血管滲漏、肺水腫和多器官衰竭等。咬合蛋白存在于上皮和內(nèi)皮之間的緊密連接中，是第一個(gè)被鑒定的完整膜緊密連接蛋白[33]。眾多研究表明咬合蛋白對(duì)緊密連接功能至關(guān)重要：咬合蛋白在 Madin-Darby犬腎臟（MDCK）細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)跨上皮電阻[34]；在敲除了咬合蛋白的小鼠中，發(fā)現(xiàn)緊密連接自身形態(tài)未受影響，經(jīng)檢測(cè)其腸上皮屏障功能正常；然而，在胃、腦、肺以及睪丸等組織中發(fā)現(xiàn)了異常；結(jié)果表明咬合蛋白在維持緊密連接穩(wěn)定和屏障功能正常等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[35]。通常情況下，咬合蛋白的表達(dá)量一旦降低會(huì)造成血腦屏障、血睪屏障、肺上皮屏障以及腸上皮屏障等的破壞，繼而引發(fā)多種疾病的發(fā)生[36]。ZO-1即閉鎖小帶蛋白1，也是構(gòu)成緊密連接的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一。它是膜相關(guān)信號(hào)分子家族的成員，可以充當(dāng)分子支架，將跨膜蛋白組織到離散的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域，如上皮細(xì)胞間連接和神經(jīng)突觸[37]。其次，緊密連接蛋白Claudins是構(gòu)成緊密連接復(fù)合物的主要成分，它的異常表達(dá)可導(dǎo)致上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞及功能受損[38]。在本研究中，EECP處理組可顯著提升緊密連接蛋白基因（Occludin、ZO-1、Cluadin-1）mRNA的轉(zhuǎn)錄水平?；跓晒舛糠治龅慕Y(jié)果，采用免疫組化實(shí)驗(yàn)方法對(duì)Occludin和ZO-1蛋白進(jìn)行定位和定量分析，發(fā)現(xiàn) EECP組能顯著增強(qiáng)緊密連接蛋白在細(xì)胞膜的分布和表達(dá)。課題組前期通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn)證明，EECP可抑制炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的表達(dá)，上調(diào)乳腺上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的轉(zhuǎn)錄量并增加其在細(xì)胞間的分布[17]；桑色素已被證明能顯著降低 LPS誘導(dǎo)的TNF-α, IL-1β, IL-6,CCL2和CXCL2mRNA 的表達(dá)，并抑制LPS降低的Claudin-3、Occludin的表達(dá)[39]，本試驗(yàn)結(jié)果與之相一致。綜合以上研究結(jié)果表明，EECP能顯著減輕LPS刺激所引起的乳腺組織緊密連接的破壞，證實(shí)了EECP對(duì)血乳屏障具有良好的保護(hù)作用。

4 結(jié)論

蜂膠作為一種動(dòng)植物雙源性天然物質(zhì)，具有包括抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[40]，本研究表明，中國(guó)蜂膠乙醇提取物對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎具有良好的作用效果，具有替代傳統(tǒng)抗生素應(yīng)用于奶牛乳腺炎防治的潛力。灌胃中國(guó)蜂膠提取物能夠顯著緩解 LPS注射導(dǎo)致的小鼠乳腺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、緩解乳腺腺泡結(jié)構(gòu)損傷；同LPS組相比，中國(guó)蜂膠提取物灌胃處理可有效抑制 LPS導(dǎo)致的小鼠乳腺組織中炎癥因子的釋放，并可提高小鼠乳腺中緊密連接蛋白的mRNA表達(dá)，緩解LPS注射所導(dǎo)致的乳腺上皮細(xì)胞緊密連接的破壞?；诒狙芯拷Y(jié)果，未來(lái)可進(jìn)一步深入探索蜂膠抗乳腺炎的作用機(jī)理，這也將全面揭示蜂膠對(duì)乳腺炎的保護(hù)作用，并為蜂膠在制備奶牛乳腺炎預(yù)防藥品和開(kāi)發(fā)蜂膠飼料添加劑中的實(shí)際應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。