鹽酸西那卡塞納米結(jié)晶的制備及體外溶出度研究

張慶明,徐云燕,夏 超

0 引 言

鹽酸西那卡塞(cinacalcet hydrochloride,CINA)是美國(guó)藥品食品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的第一個(gè)鈣敏感受體激動(dòng)劑，成為治療繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)的主要藥物[1]。它能有效地抑制甲狀旁腺組織的增殖，減少甲狀旁腺激素的分泌，保護(hù)骨骼等靶器官[2]。現(xiàn)有的CINA劑型是Amgen公司的一種商品名為Sensipar?的片劑。然而，Sensipar?片的CINA溶出率緩慢導(dǎo)致其在體內(nèi)的生物利用度較低[3]。此外，其受食物種類(lèi)的影響較大，需要與食物一起服用增強(qiáng)吸收，這導(dǎo)致該藥餐前餐后的生物利用度相差較大，因此CINA的臨床應(yīng)用中患者依從性差[4]。許多學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了研究：Yang等[5]制備固體分散片來(lái)提高CINA的溶解效率；Cao等[6]開(kāi)發(fā)了一種無(wú)食物效應(yīng)的CINA自微乳化給藥系統(tǒng)。有文獻(xiàn)表明納米結(jié)晶是一種很有前景的制劑手段，它可以提高藥物的安全性、溶出度、口服生物利用度，以及消除空飽腹?fàn)顟B(tài)之間的差異[7-10]。本研究利用納米結(jié)晶制備鹽酸西那卡塞納米結(jié)晶(CINA-NCs)來(lái)提高CINA的溶解度和體外溶出度，以期提高其生物利用度，從而提高藥效。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥高效液相色譜儀(LA-20A，日本島津)，冷凍干燥機(jī)(中國(guó)新芝生物科技有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-200A，中國(guó)上海亞榮生化儀器廠)，馬爾文粒度儀Zetasizer(Nano ZS90，Malven Instruments，英國(guó))，超聲儀(中國(guó)寧波善思生物科技有限公司)，差示掃描量熱儀(STA449C，NerzschCo.Ltd，德國(guó))，掃描電鏡(S-4800, Hitachi Ltd,Tokyo, 日本)。X-射線粉末衍射儀(GNR APD2000，意大利)，渦旋混合器(WH-2，中國(guó)上海湖西分析儀器廠)，恒溫振蕩培養(yǎng)箱(THz-98B，中國(guó)上海益恒科學(xué)儀器有限公司)。CINA(純度99%以上)購(gòu)自江蘇恒瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)20170603(中國(guó)江蘇)。無(wú)水乙醇購(gòu)自無(wú)錫亞盛化工有限公司(江蘇)。聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus)是從德國(guó)巴斯夫公司采購(gòu)的?；蹃?lái)自上海阿拉丁生物化學(xué)科技有限公司(中國(guó)上海)。微晶纖維素(MCC)購(gòu)自武漢勝天宇生物有限公司(中國(guó)湖北)。交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(CCNa)來(lái)源于上海華威藥業(yè)科技有限公司(中國(guó)上海)。實(shí)驗(yàn)室自制雙蒸水。實(shí)驗(yàn)中使用的其余材料都是分析級(jí)的。

1.2方法

1.2.1 納米結(jié)晶的制備采用沉淀-超聲法制備CINA-NCs。將100 mg的CINA分散在1 mL的無(wú)水乙醇中作為有機(jī)相，將100 mg的Soluplus溶解在50 mL的雙蒸水中作為水相。有機(jī)相在冰浴中快速注入到水相中。然后用超聲波處理混合物。超聲狀態(tài)參數(shù)設(shè)定為3 s，間隔2 s，400 W，30 min。通過(guò)蒸餾脫除乙醇，最終得到CINA-NCs。在制備過(guò)程中，考察有機(jī)相中CINA濃度、穩(wěn)定劑濃度、水相與有機(jī)相體積比、超聲功率輸入、超聲時(shí)間等因素對(duì)納米顆粒的質(zhì)量的影響。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，選擇Soluplus作為穩(wěn)定劑，并通過(guò)肉眼觀察CINA-NCs的形態(tài)，然后測(cè)定粒度和多分散指數(shù)(polydispersity index，PDI)為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.2響應(yīng)面法(Box-Behnken)設(shè)計(jì)采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化處方[11]。設(shè)計(jì)中考慮了三個(gè)因素和三個(gè)水平，見(jiàn)表1。這三個(gè)因素分別是A：有機(jī)相中的CINA濃度、B：穩(wěn)定劑濃度、C：水相與有機(jī)相體積比。實(shí)驗(yàn)由軟件Design-Expert8.0.6 (StatEase Inc.，USA)設(shè)計(jì)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)執(zhí)行3次。

表 1 鹽酸西那卡塞納米結(jié)晶制備優(yōu)化處方的響應(yīng)面法Box-Behnken設(shè)計(jì)

1.2.3冷凍干燥采用冷凍干燥機(jī)對(duì)優(yōu)化后的CINA-NCs進(jìn)行冷凍干燥制得凍干粉。將三批凍干樣品放入小瓶中，在低于-60 ℃的冷阱中預(yù)凍12 h，然后將樣品在0.01 kPa真空、-50 ℃下冷凍干燥48 h，得到冷凍干燥的CINA-NCs?？疾靸龈煞墼陔p蒸水中的再分散性。另外，對(duì)凍干前后的顆粒大小和PDI進(jìn)行評(píng)價(jià)，以考察凍干前后的差異。

1.2.4凍干CINA-NCs的表征①顆粒大小、PDI和Zeta電位測(cè)定。取出適量?jī)龈傻腃INA-NCs，分散在雙蒸水中。然后將溶液稀釋到合適的濃度。用馬爾文粒度儀測(cè)定其粒徑、PDI和Zeta電位，每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。②差示掃描量熱[12]。采用差示掃描量熱儀(DSC)，以鋁坩堝為參照物，對(duì)適量的CINA原料藥、Soluplus、物理混合物(處方比例的CINA、Soluplus)以及凍干CINA-NCs進(jìn)行分析。加熱范圍為30～250 ℃，速度為每分鐘10 ℃。③X射線粉末衍射測(cè)試。分別取CINA原料藥、Soluplus、物理混合物(處方比例的CINA、Soluplus)和凍干CINA-NCs適量，進(jìn)行X射線粉末衍射儀(XRPD)分析，具體的測(cè)試條件為：銅靶，加速電壓：40 kV；加速電流：40 mA；衍射角(2θ) 4°/min，掃描范圍：5～50°[13]。④原料藥、樣品觀察。5 kV加速電壓下，用掃描電鏡(SEM)觀察CINA原料藥和CINA-NCs的形貌[14]。用金-鈀濺射后，對(duì)樣品進(jìn)行觀察。⑤飽和溶解度分析。將過(guò)量的CINA原料藥、CINA和Soluplus的混合物和凍干CINA-NCs分別加入5 mL雙蒸水中，渦旋混合。然后將混合物置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，在25 ℃，300 r/min下孵育48 h，平衡后，將樣品以5000 r/min的速度離心10 min，然后將樣品放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱，轉(zhuǎn)速為300 r/min，孵化48 h，平衡后，將樣品以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。上清液過(guò)濾(0.45 μm)，適當(dāng)稀釋后用高效液相色譜法分析飽和溶解度。

1.2.5穩(wěn)定性研究對(duì)凍干CINA-NCs進(jìn)行室溫下0～6個(gè)月的穩(wěn)定性研究。考察凍干CINA-NCs在室溫下6個(gè)月的穩(wěn)定性。即將凍干的CINA-NCs保存在密閉的小瓶中，定期取出適量的CINA-NCs，在0、1、2、3、6個(gè)月的預(yù)定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行復(fù)溶分析。以粒徑和PDI為評(píng)價(jià)指標(biāo)。每個(gè)樣品都進(jìn)行3次分析，以減少誤差。

1.2.6CINA-NCs膠囊的制備及體外溶出度研究以MCC為填充劑，CCNa為崩解劑，滑石粉為潤(rùn)滑劑，將30 mg凍干CINA-NCs制成膠囊。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)膠囊劑的處方進(jìn)行研究，以不同處方制備的膠囊劑在pH 6.8磷酸鹽緩沖液(PBS)中30 min的累積溶出度進(jìn)行評(píng)價(jià)，見(jiàn)表2。以體外溶出度為指標(biāo)考察膠囊劑的最佳溶出度。以《中國(guó)藥典》2015年版方法為基礎(chǔ)，采用漿法測(cè)定膠囊、市售片(Sensipar?)和原料藥的體外溶出度。溶出介質(zhì)分別為pH 1.2鹽酸緩沖液、pH 4.5醋酸緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液和水。將樣品放入900 mL的培養(yǎng)基中，攪拌速度為75 r/min，37 ℃，然后在5、10、15、20、30、45、60和90 min取出樣品5 mL，加入等量的緩沖液以保持緩沖液體積恒定。樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，用高效液相色譜法測(cè)定CINA的含量。

表2 鹽酸西那卡塞納米結(jié)晶膠囊劑三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié) 果

2.1 因素考察

2.1.1 有機(jī)相中CINA的濃度當(dāng)濃度從80 mg/mL增加到120 mg/mL時(shí)，粒徑和PDI變化不大，但當(dāng)濃度大于120 mg/mL時(shí)，粒徑和PDI明顯增加。初步測(cè)定有機(jī)相中CINA的濃度范圍為80～100 mg/mL。見(jiàn)圖1a。

2.1.2穩(wěn)定劑濃度當(dāng)CINA濃度為100 mg/mL時(shí)，由于弱立體效應(yīng)，當(dāng)其他因素保持不變時(shí)，隨著穩(wěn)定劑濃度的增加，粒徑先減小后增大。當(dāng)穩(wěn)定劑濃度大于3.5 mg/mL時(shí)，由于顆粒的聚集，促進(jìn)了奧斯瓦爾德熟化。因此，初步確定了Soluplus的濃度范圍為1.5～3.5 mg/mL。見(jiàn)圖1b。

2.1.3水相與有機(jī)相的體積比當(dāng)體積比在30∶1到60∶1時(shí)，粒徑變化不大。較大的顆粒尺寸使超聲難以進(jìn)行，這可能是由于粘性懸浮液在比例為20∶1時(shí)造成的，因此最佳的體積比為30∶1～50∶1。見(jiàn)圖1c。

2.1.4超聲波因素隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，粒徑和PDI先減小后增大，見(jiàn)圖1d。最佳超聲時(shí)間為30 min，當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)30 min時(shí)，顆粒尺寸和PDI開(kāi)始增大。超聲波功率輸入越強(qiáng)，顆粒越小，見(jiàn)圖1e。但是，當(dāng)功率輸入大于400 W時(shí)，由于納米結(jié)晶的不穩(wěn)定性，顆粒尺寸和PDI變大。因此，當(dāng)功率為400 W時(shí)，可以獲得最佳的納米結(jié)晶。

a: 有機(jī)相中不同CINA濃度；b: 不同穩(wěn)定劑濃度；c: 不同水相與有機(jī)相體積比; d: 超聲時(shí)間; e: 超聲功率

2.2配方優(yōu)化粒徑和PDI隨穩(wěn)定劑濃度和CINA濃度的增加先減小后增大。在一定范圍內(nèi)，體積比的增加導(dǎo)致顆粒尺寸和PDI的減小。隨著體積比和穩(wěn)定劑濃度的增加，粒徑和PDI先減小后增大。見(jiàn)圖2?？偟膩?lái)說(shuō)，模型揭示了粒徑和PDI在一定范圍內(nèi)有最小值。A(有機(jī)相中的CINA濃度)、B(穩(wěn)定劑濃度)、C(水相與有機(jī)相的體積比)的多項(xiàng)式回歸方程如下：

R1(粒徑)=248.35-53.12A-31.42B-19.82C-27.34AB-17.44AC+ 7.71BC+137.60A2+22.72B2+118.92C2

(R2=0.9941,P<0.0001)

R2(PDI)=0.17-0.034A-0.021B-0.014C-0.017AB-0.011AC+0.005235BC+0.088A2+0.03B2+0.076C2

(R2=0.9934,P<0.0001)

a:有機(jī)相中的CINA濃度; b:穩(wěn)定劑濃度; c: 水相與有機(jī)相的體積比

從回歸方程和響應(yīng)面結(jié)果來(lái)看，CINA在有機(jī)相中濃度為108 mg/mL、Soluplus濃度為2.7 mg/mL、水相與有機(jī)相的比例為40∶1時(shí)獲得最佳配方。同時(shí)，將超聲功率輸入和持續(xù)時(shí)間設(shè)定為400 W，30 min。根據(jù)最佳配方，考察顆粒大小為(244±2)nm,PDI為0.168±0.001。

2.3凍干及穩(wěn)定性研究?jī)龈煞鄣脑俜稚⑿匝芯恐邪l(fā)現(xiàn)，制備得到的納米結(jié)晶凍干粉的分散率較好，且顆粒大小和PDI變化不大，見(jiàn)表3。

2.4性狀

2.4.1 粒徑、PDI和Zeta電位優(yōu)化后的凍干CINA-NCs的粒徑為(257.3±13.740)nm，PDI為0.185±0.002，Zeta電位為(-31.7±0.012)mV。

2.4.2差示掃描量熱通過(guò)差示掃描量熱法顯示CINA原料藥、Soluplus、物理混合物和凍干CINA-NCs的溫度曲線，見(jiàn)圖3。CINA原料藥在180 ℃時(shí)有明顯的吸熱尖峰，而在171 ℃時(shí)由于晶體形態(tài)的不同也有微弱的吸熱峰。物理混合物的熱像圖與原料藥的相似。此外，在180 ℃時(shí)，CINA-NCs的熱像圖中有一個(gè)弱吸熱峰。上述現(xiàn)象可以證明CINA-NCs中CINA的結(jié)晶狀態(tài)在制備和凍干過(guò)程中沒(méi)有本質(zhì)上的變化，但是由于晶體更小，所以峰強(qiáng)度變?nèi)酢?/p>

表3 三批凍干CINA-NCs樣品的再分散性試驗(yàn)結(jié)果

a: CINA原料藥; b: Soluplus;c: CINA原料藥和Soluplus物理混合物; d: CINA納米結(jié)晶

2.4.3X-射線粉末衍射XRPD進(jìn)一步證實(shí)了CINA的結(jié)晶狀態(tài)，見(jiàn)圖4。CINA原料藥在4°、11°、14°、18°和26°處呈現(xiàn)明顯的峰型。由于其無(wú)定型結(jié)構(gòu)，Soluplus呈現(xiàn)出駝峰。凍干后的CINA-NCs呈現(xiàn)出CINA的特征峰。但凍干粉末的峰值強(qiáng)度比物理混合物弱。峰值強(qiáng)度的降低可能是由于制備過(guò)程中CINA-NCs的粒徑減小所致。

2.4.4掃描電鏡結(jié)果CINA原料藥呈棒狀，粒徑分布較寬。而Soluplus具有巨大的球形性。物理混合物清楚地呈現(xiàn)出棒狀CINA原料藥和球形Soluplus的簡(jiǎn)單混合物。相比之下，Soluplus顯示為大量的薄片。凍干CINA-NCs的形貌呈寬粒徑范圍的納米球，從圖上方框的放大圖中可以看出，很明顯鑲嵌在Soluplus片狀中。見(jiàn)圖5。

圖4 粉末X射線衍射圖

a: CINA原料藥;b:Soluplus;c: CINA原料藥和Soluplus物理混合物;d: CINA納米結(jié)晶[D(2)為圖中小紅框的局部放大圖]

2.4.5飽和溶解度25 ℃時(shí)，CINA原料藥、物理混合物和凍干CINA-NCs在雙蒸水中的飽和溶解度分別為35.20 μg/mL、178.53 μg/mL、2.67 mg/mL。凍干粉的溶解度明顯大于原料藥和物理混合物，進(jìn)一步表明納米結(jié)晶能顯著提高CINA的溶解度。

2.5穩(wěn)定性研究根據(jù)長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究結(jié)果，粒徑和PDI差異不明顯，見(jiàn)表4。結(jié)果表明，冷凍干燥的CINA-NCs在室溫下0～6個(gè)月物理性質(zhì)穩(wěn)定,符合要求。

表4 CINA-NC凍干粉的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6膠囊的最佳處方及體外溶出度研究膠囊的最佳配方由30 mg凍干CINA-NCs、30%(w/v)MCC、8%(w/v)CCNa和2%(w/v)滑石粉組成，見(jiàn)表5。制備的CINA-NCs膠囊在四種不同介質(zhì)中的累積溶出度值均大于95%，溶出速率明顯大于市售片劑和原料藥。此外，通過(guò)數(shù)據(jù)可以證實(shí)膠囊的溶解不受pH值的影響。見(jiàn)圖6。

表5 膠囊處方篩選的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(%,w/v)

a:pH 1.2 鹽酸緩沖液; b：pH 4.5 醋酸緩沖液; c：pH 6.8 PBS;d：水

3 討 論

本研究采用沉淀-超聲法制備CINA-NCs。采用單因素法進(jìn)行初步優(yōu)化，并采用Box-Behnken設(shè)計(jì)法成功篩選出最優(yōu)處方。采用冷凍干燥法對(duì)CINA-NCs進(jìn)行干燥，并用DSC和XRPD對(duì)其進(jìn)行了表征，表明其結(jié)晶狀態(tài)沒(méi)有本質(zhì)的變化，DSC峰值強(qiáng)度的降低可能是由于制備過(guò)程中CINA-NCs的粒徑減小所致。根據(jù)Noyes-Whitney方程，具有大表面積的小顆粒尺寸可以增加溶解速率[15-16]，所以制備的CINA-NCs溶出度較高。溶出度研究進(jìn)一步證實(shí)了該納米結(jié)晶具有促進(jìn)溶出的作用。利用掃描電鏡對(duì)凍干后的CINA-NCs進(jìn)行了形態(tài)觀察，進(jìn)一步證明了在制備過(guò)程和凍干過(guò)程中，CINA-NCs的結(jié)晶狀態(tài)變化不大。

因?yàn)槭惺跾ensipar?在pH 4.5的醋酸緩沖液中的累積溶出度最高，在pH 1.2的鹽酸緩沖液中以80.5%位居第二。然而，在pH 6.8 PBS中的累積溶解率僅為40.01%，這證實(shí)了Sensipar?的溶解度取決于pH值。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CINA原料藥在pH 1.2鹽酸緩沖液、pH 4.5醋酸緩沖液、pH 6.8 PBS和水中的累積溶出度分別為17.45%、19.98%、5.12%和16.79%，溶出率極低，且受pH值的影響較大。然而，本實(shí)驗(yàn)制備CINA-NCs膠囊在四種不同介質(zhì)中的累積溶出度值均大于95%，溶出速率明顯大于市售片劑和原料藥。此外，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明本實(shí)驗(yàn)制備的膠囊溶解性能不受pH值的影響。

綜上所述，納米結(jié)晶是一種很有前途的技術(shù)，CINA-NCs可以改善難溶性藥物CINA的溶解度，提高口服生物利用度，從而提高藥效。