異功散對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)和腸道菌群的影響

梁燕妮 歐陽學(xué)認(rèn) 廖永州

摘要 目的：研究異功散對(duì)支氣管哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)的抑制及其對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用。方法：將無特定病原體（SPF）級(jí)雄性小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、異功散組和西藥組，每組10只。通過抗生素誘導(dǎo)、致敏和霧化激發(fā)建立腸道菌群紊亂的哮喘小鼠模型。觀察小鼠一般情況、肺組織病理變化，對(duì)各組小鼠糞便進(jìn)行16S rRNA測序并分析治療前后腸道菌群的變化。結(jié)果：1）異功散組和西藥組的哮喘小鼠的生理狀態(tài)、哮喘癥狀較模型組明顯好轉(zhuǎn);2）與模型組比較，異功散組和西藥組小鼠肺組織炎癥反應(yīng)得到明顯改善;3）與空白對(duì)照組比較，模型組的Chao1指數(shù)顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，異功散組和西藥組的Chao1指數(shù)明顯回升（P<0.05）。與模型組比較，異功散組的擬普雷沃菌屬和普雷沃菌屬的比例明顯回升，而乳桿菌屬和擬桿菌屬的比例下降。結(jié)論：異功散改善哮喘小鼠的癥狀和氣道炎癥反應(yīng)的作用可能與其恢復(fù)腸道菌群的豐富度和多樣性以及調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)的平衡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 異功散;哮喘;脾胃虛弱;氣道;炎癥反應(yīng);腸道菌群;16S rRNA測序

Abstract Objective：To study the inhibitory effect of Yi Gong Powder on airway inflammation in bronchial asthma mice and its regulation on the structure of intestinal flora.Methods：SPF grade male mice were randomly divided into a blank control group，a model group，a Yi Gong Powder group and a Western medicine group，with 10 in each group.A mouse model of asthma with intestinal flora disorder was established through antibiotic induction，sensitization and nebulization.The general condition of mice and the pathological changes of lung tissues were observed.The feces of each group of mice were sequenced by 16S rRNA and the changes of intestinal flora before and after treatment were analyzed.Results：1）The physiological status and asthma symptoms of asthma mice in Yi Gong Powder group（Y）and Western medicine group were better than those in model group.2）Compared with the model group，the lung tissue inflammation of the Yi Gong Powder group and the Western medicine group was significantly improved.3）16S rRNA sequencing results showed that：compared with the blank control group，the Chao1 index of the model group was significantly reduced（P<0.01）; compared with the model group，the Chao1 index of the Yi Gong Powder group increased significantly（P<0.05）.At the genus level of the bacterial group structure，compared with the model group（M），the proportion of Alloprevotella and Prevotella in the Yi Gong Powder group increased significantly，but there was a certain gap from blank control group，while the proportion of Lactobacillus and Bacteroides has declined.Conclusion：The effects of Yi Gong Powder on improving the symptoms and airway inflammation in asthmatic mice may be related to restoring the richness and diversity of intestinal flora and regulating the balance of flora structure.

Keywords Yi Gong Powder; Asthmatic; Spleen and stomach weakness; Airway; Inflammatory reaction; Intestinal flora; 16S rRNA sequencing

中圖分類號(hào)：R256.12;R562.2+5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.007

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）是一種以慢性氣道炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病[1]。近20年來我國兒童哮喘的患病率呈顯著上升趨勢(shì)，且總體上以學(xué)齡前兒童最高[2]。哮喘對(duì)兒童的生活、學(xué)習(xí)甚至生命帶來嚴(yán)重的危害，如何更有效的防治哮喘一直是亟待解決的問題。有證據(jù)表明，微生物群在宿主的腸黏膜和免疫系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮著不可或缺的作用[3]，而大量服用抗生素的嬰幼兒在菌群結(jié)構(gòu)遭到破壞的同時(shí)也增加了患哮喘疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。近年來，腸道菌群與哮喘等過敏性疾病的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。

從中醫(yī)“整體觀念”的角度出發(fā)，腸道微生態(tài)的組成、結(jié)構(gòu)多樣性和菌群代謝狀態(tài)的平衡與穩(wěn)定是維持“脾主運(yùn)化”正常功能狀態(tài)的重要因素[5-6]。在某種情況下這種平衡和穩(wěn)定一旦被破壞，就會(huì)出現(xiàn)脾胃功能的失調(diào)，如脾胃虛弱導(dǎo)致“脾主運(yùn)化”功能減弱，津液疏布失常而釀生痰濁。中醫(yī)認(rèn)為哮病以宿痰伏于肺為主因，而脾胃虛弱則是貫穿哮喘病發(fā)作期與緩解期總病程的核心病機(jī)[7]，故中醫(yī)對(duì)哮喘的治療應(yīng)注意培補(bǔ)中焦，而異功散是健脾益氣的代表方劑之一。本實(shí)驗(yàn)擬探討異功散對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)的抑制及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，為中醫(yī)藥防治哮喘提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取無特定病原體（SPF）級(jí)健康雄性BALB/C小鼠40只，3周齡，體質(zhì)量（13±3）g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。本實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)要求（倫理審批號(hào)：20190611028）。喂養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度為22～23 ℃，濕度為60%～70%，每天光照與黑夜各12 h交替。

1.1.2 藥物 異功散按《小兒藥證直訣》所載原方比例：人參、茯苓、白術(shù)、陳皮、甘草各10 g。中藥均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，制成水煎劑，并配成含生藥約1 g/mL的溶液，充分?jǐn)噭?，貯于4 ℃冰箱備用[8]。卵清蛋白（OVA）（上海麥克林生化科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：A800616），Al（OH）3（上海麥克林生化科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：A800852），常樂康膠囊（酪酸梭菌二聯(lián)活菌散）（山東科興生物制品有限公司，國藥準(zhǔn)字S20020015），頭孢哌酮坦鹽鈉（上海麥克林生化科技有限公司，國藥準(zhǔn)字S838445）。

1.1.3 試劑與儀器 電子天平稱（杭州萬特衡器有限公司，型號(hào)：WT型）;冰凍切片機(jī)（Thermo Scientific公司，美國，型號(hào)：CryoStar NX50）;生物顯微鏡（Nikon公司，日本，型號(hào)：55i）;彩色圖像分析系統(tǒng)（Media Cybernetics公司，美國，型號(hào)：Image-Pro Plus7）;超低溫冰箱（海爾公司，型號(hào)：DW-86L626）;小動(dòng)物超聲霧化器[歐姆龍自動(dòng)化（中國）有限公司，型號(hào)：NE-C28P]。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用簡單隨機(jī)分配法，將小鼠分為空白對(duì)照組、模型組、異功散組和西藥組，每組10只。哮喘小鼠模型的建立[9]：適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d結(jié)束后（第0天），給予BALB/C小鼠0.5 g/L的頭孢哌酮水溶液，自由飲用，連續(xù)5 d。第6天將頭孢哌酮水換成無菌水。分別于第0天和第7天在小鼠雙側(cè)胸部、腹股溝4部位各皮下注射0.15 mL配置好的卵清蛋白（OVA）凝膠致敏劑（將OVA 1 mg和氫氧化鋁200 mg溶于生理鹽水1 mL中配制而成），同時(shí)腹腔注射0.4 mL，共計(jì)1 mL進(jìn)行致敏。第14天開始將小鼠置于25 cm×20 cm×20 cm有機(jī)玻璃盒內(nèi)，超聲霧化吸入1%OVA誘發(fā)哮喘，1次/d，30 min/次，連續(xù)5 d。當(dāng)小鼠出現(xiàn)嗆咳、呼吸困難、躁動(dòng)不安、活動(dòng)量下降等癥狀時(shí)表示哮喘激發(fā)成功。

1.2.2 給藥方法 第20天開始給藥干預(yù)，異功散組以每次10 mL/kg的給藥量經(jīng)口灌服;西藥組灌服常樂康0.4 mL[10]，同時(shí)給予布地奈德2 mL+生理鹽水2 mL霧化15 min;模型組及空白對(duì)照組均灌服生理鹽水。以上各組給藥均為1次/d，連續(xù)1周，療程結(jié)束24 h后處死小鼠取材。

1.2.3 標(biāo)本采集 采用頸椎脫臼法處死小鼠，沿正中線由下而上剪開胸腔，逐層游離、暴露肺組織。摘取左肺組織，將其放入4%多聚甲醛溶液。同時(shí)每組隨機(jī)挑選5只小鼠的結(jié)腸糞便，收集至無菌EP管，并于液氮中保存。

1.2.4 指標(biāo)檢測與方法 1）觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、納食、大小便、呼吸、毛發(fā)形體、姿態(tài)、活動(dòng)及體質(zhì)量等一般情況。2）肺和支氣管組織形態(tài)學(xué)變化：左肺組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（HE染色），鏡下觀察各組小鼠支氣管形態(tài)和平滑肌損傷情況，炎性細(xì)胞浸潤情況以及管腔內(nèi)是否有滲出物等。3）16S rRNA測序：小鼠糞便樣本由上海銳翌生物科技有限公司進(jìn)行腸道菌群檢測。提取20個(gè)糞便樣本的DNA，并進(jìn)行質(zhì)檢。16S rRNA擴(kuò)增選擇區(qū)域?yàn)閂3-V4區(qū)，使用的通用引物為341F和806R。在通用引物的5′端加上適合Illumina Miseq PE250測序的index序列和接頭序列，完成特異性引物的設(shè)計(jì)。forward primer（5′-3′）：CCTACGGGRSGCAGCAG（341F）reverse primer（5′-3′）：GGACTACVVGGGTATCTAATC（806R）。對(duì)樣本中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化、PCR產(chǎn)物定量和均一化，最后使用Illumina Miseq PE250進(jìn)行上機(jī)測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)采用單因素方差分析，否則用秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量變化及一般狀況

造模前，各組小鼠反應(yīng)正常。除空白對(duì)照組外，其余組小鼠在造模過程中，給予OVA霧化激發(fā)后小鼠出現(xiàn)呼吸急促，躁動(dòng)不安，弓背，蜷縮，搔抓面部，納食、活動(dòng)減少，毛發(fā)無光澤及體質(zhì)量下降等情況。與模型組比較，給予異功散和西藥干預(yù)后，小鼠精神較前好轉(zhuǎn)，毛發(fā)相對(duì)更有光澤，納食、活動(dòng)增多，體質(zhì)量也明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 肺部病理學(xué)指標(biāo)

空白對(duì)照組小鼠的肺組織支氣管、肺泡結(jié)構(gòu)清晰，未見炎癥反應(yīng)細(xì)胞;模型組小鼠支氣管周圍灶狀慢性炎癥細(xì)胞浸潤、支氣管上皮細(xì)胞鱗狀化生，偶見上皮細(xì)胞脫落，肺泡間隔中度增厚，增厚程度為正常厚度的3～5倍;異功散組和西藥組支氣管周圍未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管上皮細(xì)胞未見鱗狀化生及脫落，大部分區(qū)域肺泡間隔未見增厚，局部肺泡間隔輕度增厚，肺泡腔內(nèi)未見巨噬細(xì)胞。見圖1。

2.3 異功散對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 物種Alpha多樣性指數(shù)分析 本實(shí)驗(yàn)收集了空白對(duì)照組、模型組、異功散組和西藥組各5只小鼠的糞便標(biāo)本。根據(jù)16S rRNA測序結(jié)果繪制稀釋曲線如圖2，曲線趨向于平坦，表明測序量基本覆蓋樣品中所有物種，測序深度達(dá)到要求，可滿足分析需求。根據(jù)小鼠腸道菌群的Chao1豐富度指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)繪制圖3A、3B。圖中顯示：1）與空白對(duì)照組比較，模型組的Chao1指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;給予異功散和西藥干預(yù)之后Chao1指數(shù)明顯回升，且異功散組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2）與空白對(duì)照組比較，模型組的Shannon指數(shù)有所下降，給予異功散和西藥干預(yù)后Shannon指數(shù)有一定程度的上升，但4組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.2 物種Beta多樣性指數(shù)分析 各組小鼠腸道菌群的差異可通過繪制PCoA主成分分析圖（圖4）表示，其中相同顏色的點(diǎn)的距離越近說明其菌群的構(gòu)成越相似?？瞻讓?duì)照組、模型組與異功散組的樣品距離遠(yuǎn)，各組的菌群構(gòu)成存在明顯差異;而西藥組與空白對(duì)照組和模型組的距離較近，其群落差異較小。

2.3.3 物種菌群結(jié)構(gòu)分析 從圖5中可發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，模型組的擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）的比例顯著降低，普雷沃菌屬（Prevotella）的比例也有所下降，而乳桿菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides）的比例明顯上升。與模型組比較，給予藥物干預(yù)后，異功散組的擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）和普雷沃菌屬（Prevotella）的比例明顯回升，但與正常組有一定差距，而乳桿菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides）的比例下降;西藥組的乳桿菌屬（Lactobacillus）和嗜黏蛋白-艾克曼菌屬（Akkermansia）的比例明顯增加。

3 討論

目前，兒童支氣管哮喘的研究取得了一定的進(jìn)展，雖然其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但可以肯定的是哮喘的發(fā)生發(fā)展與免疫有關(guān)。Russell等[11]發(fā)現(xiàn)圍產(chǎn)期及新生小鼠經(jīng)抗生素處理后其過敏性哮喘的檢測指標(biāo)增加的同時(shí)，腸道細(xì)菌菌群的組成也發(fā)生了顯著變化，說明小鼠發(fā)生哮喘的危險(xiǎn)性增加可能與抗生素的使用改變了其腸道菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)。這與Ahmadizar等[12]的研究結(jié)果相似，即生命早期接觸抗生素會(huì)增加成長后期出現(xiàn)過敏性哮喘的風(fēng)險(xiǎn)。而有研究證實(shí)，腸道黏膜遠(yuǎn)端部位的微生物群可以調(diào)節(jié)宿主的全身性免疫反應(yīng)，從而有助于減少致敏和過敏性炎癥反應(yīng)[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)在造模前期選用抗生素頭孢哌酮誘導(dǎo)小鼠腸道菌群紊亂，并通過卵清蛋白（OVA）致敏、霧化激發(fā)，使小鼠出現(xiàn)呼吸急促，躁動(dòng)不安，弓背，蜷縮，納食、活動(dòng)減少等哮喘發(fā)作癥狀，根據(jù)模型組小鼠的肺組織病理和腸道菌群與空白對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定腸道菌群紊亂的哮喘小鼠模型成功建立。給予藥物干預(yù)后，與模型組比較，異功散組和西藥組小鼠的哮喘癥狀明顯緩解，體質(zhì)量明顯增加（P<0.05），并且肺組織炎癥反應(yīng)得到明顯改善，表明異功散在哮喘的治療中有較好的療效，這與既往的研究結(jié)果相一致[8]。

腸道微生態(tài)的結(jié)構(gòu)變化不僅可以反映機(jī)體健康狀況，而且與哮喘等過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系。李春燕等[15]以哮喘急性發(fā)作期患者開展病例對(duì)照研究，結(jié)果提示，哮喘患者的腸道菌群發(fā)生了明顯改變，表現(xiàn)為多樣性明顯降低，結(jié)構(gòu)改變、失衡。在本實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠腸道菌群的Chao1豐富度指數(shù)顯著降低，Shannon多樣性指數(shù)也有所下降，并且在Beta多樣性分析中，其與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明哮喘模型小鼠的腸道菌群的確發(fā)生了改變，表現(xiàn)在豐富度和多樣性的降低，國外學(xué)者Arrieta等[16]的研究同樣也表明了哮喘小鼠腸道菌群的這種變化。藥物干預(yù)后，與模型組比較，異功散組的Chao1豐富度指數(shù)明顯升高，并且與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Shannon多樣性指數(shù)也有所上升。表明異功散可以使哮喘小鼠腸道菌群的豐富度恢復(fù)到正常水平，并在一定程度上增加其多樣性。

在菌群結(jié)構(gòu)分析中，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠的腸道菌群在菌屬水平上，表現(xiàn)為乳桿菌屬和擬桿菌屬的比例明顯升高，普雷沃菌屬和擬普雷沃菌屬的比例下降。國外研究者Ling等[17]、Chen等[18]同樣也發(fā)現(xiàn)過敏患兒的腸道菌群中乳桿菌屬、擬桿菌屬明顯增加，而普雷沃菌屬明顯減少，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。實(shí)驗(yàn)中，給予藥物干預(yù)后，比較于模型組，異功散組的乳桿菌屬和擬桿菌屬比例明顯下降，而普雷沃菌屬和擬普雷沃菌屬的比例則增加，且優(yōu)勢(shì)菌屬所占的比例更接近于正常組。這與王鐵柱[19]、鄉(xiāng)世健等[20]對(duì)哮喘模型動(dòng)物給予藥物干預(yù)后菌屬的變化結(jié)果相吻合。

中醫(yī)認(rèn)為，脾虛是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵[21-22]。熊英等[23]發(fā)現(xiàn)脾虛所致的腸道菌群紊亂可能是加重兒童哮喘和導(dǎo)致哮喘慢性炎癥反應(yīng)狀態(tài)的重要病機(jī)之一，所以對(duì)哮喘的治療離不開健脾補(bǔ)中之法，而異功散則是此法的代表方劑之一。研究證實(shí)，健脾中藥復(fù)方有助于調(diào)節(jié)腸道菌群，維持腸道微生態(tài)的平衡[24]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示哮喘小鼠的腸道菌群豐富度和多樣性及菌群結(jié)構(gòu)的確發(fā)生了改變，而這種改變?cè)诋惞ι⒌母深A(yù)下得到了一定程度上的恢復(fù)，表明異功散可能通過恢復(fù)哮喘小鼠腸道菌群的平衡，從而實(shí)現(xiàn)改善哮喘癥狀和氣道炎癥反應(yīng)的作用。本實(shí)驗(yàn)為中醫(yī)藥從腸道微生態(tài)角度防治哮喘提供了新的思路，其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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（2020-08-27收稿 責(zé)任編輯：徐穎）