升降散對(duì)膿毒癥小鼠細(xì)胞炎癥因子抑制作用的研究*

朱 亮 趙 雷 錢風(fēng)華 祁麗麗 夏一春 錢義明 奚 耀

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437）

·研究報(bào)告·

升降散對(duì)膿毒癥小鼠細(xì)胞炎癥因子抑制作用的研究*

朱 亮 趙 雷 錢風(fēng)華 祁麗麗 夏一春 錢義明 奚 耀△

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437）

目的觀察中藥升降散對(duì)膿毒癥小鼠炎癥細(xì)胞因子干擾素-γ（IFN-γ）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白介素-4（IL-4）和白介素-6（IL-6）的抑制作用。方法72只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、膿毒癥組與升降散組，膿毒癥造模后比較升降散干預(yù)前后不同時(shí)間段各組小鼠IFN-γ、TGF-β、IL-4和IL-6水平的變化。結(jié)果IFN-γ水平24 h內(nèi)膿毒癥組呈逐漸上升趨勢(shì)，升降散組呈逐漸下降趨勢(shì)，12 h和24 h膿毒癥組顯著高于升降散組（P＜0.01）。TGF-β水平24 h內(nèi)升降散組均呈逐漸下降趨勢(shì)，各時(shí)段均低于膿毒癥組（P＜0.05或P＜0.01）。IL-4水平24 h內(nèi)升降散組和膿毒癥組呈逐漸下降趨勢(shì)，24 h升降散組低于膿毒癥組和對(duì)照組 （P＜0.05或P＜0.01）。IL-6水平24 h內(nèi)升降散組和膿毒癥組均呈逐漸下降趨勢(shì)，各時(shí)段膿毒癥組均高于升降散組和對(duì)照組（P＜0.01），各時(shí)段升降散組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)論升降散具有抑制膿毒癥小鼠炎癥細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、TGF-β和IL-6的作用。

膿毒癥 升降散 炎癥細(xì)胞因子 IFN-γ TGF-β IL-4 IL-6

膿毒癥（Sepsis）是感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），進(jìn)一步可發(fā)展為嚴(yán)重膿毒癥、膿毒性休克及多器官功能障礙，采用集束化治療方案可得到一定控制，但病死率仍然高達(dá)30%～70%［1］。目前研究熱點(diǎn)主要是以SIRS為理論基礎(chǔ)的炎癥反應(yīng)及炎癥細(xì)胞因子。本研究應(yīng)用中藥升降散對(duì)膿毒癥小鼠進(jìn)行干預(yù)，探討升降散對(duì)炎癥細(xì)胞因子干擾素-γ（IFN-γ）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白介素-4（IL-4）和白介素-6（IL-6）水平的調(diào)控作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性BALB/c小鼠72只，6～8周，體質(zhì)量（20±2）g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物與試劑 升降散由僵蠶6 g，蟬蛻3 g，姜黃3 g和大黃12 g組成，由本院制劑室配制。細(xì)胞分離純化相關(guān)試劑：磷酸緩沖液 PBS，RPMI-1640培養(yǎng)液，PBMC分離液，紅細(xì)胞裂解液，胎牛血清（FBS）等，均由上海中醫(yī)藥大學(xué)提供。IFN-γ、IL-4、TGF-β、IL-6 Elisa試劑盒，由上海欣博盛生物科技有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（PYX-DHS），上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠出品；高速離心機(jī)（TGL-168），上海安亭科學(xué)儀器廠出品；漩渦混合器（XW-80A），上海青浦滬西儀器廠出品；連續(xù)分液器，美國(guó)TOMOS LIFE SCIENCE Group公司出品。酶標(biāo)儀（DENLEY DRAGON Wellscan MK 3）和洗板機(jī)（Wellwash 4 MK2），均由芬蘭Thermo出品。

1.4 分組與造模 按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（對(duì)照組）8只、膿毒癥組24只和中藥升降散治療組（升降散組）24只，后兩組再分為術(shù)后6、12 h和24 h 3個(gè)時(shí)間段亞組（各8只）。小鼠造模前72 h開始每日灌胃2次，升降散組給予升降散12 mL/kg，其余各組以等量生理鹽水灌胃，連續(xù)3 d。制備盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥模型（CLP模型），以50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后沿腹正中線作1.5 cm長(zhǎng)的切口，在盲腸根部結(jié)扎盲腸；用18號(hào)針在盲腸上穿通3次形成盲腸漏，隨后將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。術(shù)畢，立即予生理鹽水50 mL/kg抗休克。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 斷頸法處死小鼠，延左側(cè)肋弓切開肌層，摘取脾臟后取適量脾臟標(biāo)本用于檢測(cè)IFN-γ、TGF-β、IL-4和IL-6的水平。將小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離與純化，細(xì)胞樣本的標(biāo)記、細(xì)胞表面抗原及細(xì)胞內(nèi)染色后，配置標(biāo)本稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品液、洗滌液，加樣、洗板，加入蒸餾水和第一抗體工作液 （空白除外）；再洗板，加酶標(biāo)抗體工作液，再洗板，加底物工作液，加終止液混勻；用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光值。用ELISA方法分別檢測(cè)不同時(shí)間段IFN-γ、TGF-β、IL-4和IL-6的水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，如符合正態(tài)分布和方差齊性采用t檢驗(yàn)，如不符合正態(tài)分布和方差齊性則采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠各時(shí)間段IFN-γ和TGF-β變化的比較見表1。IFN-γ水平24 h內(nèi)膿毒癥組呈逐漸上升趨勢(shì)，升降散組呈逐漸下降趨勢(shì)；6 h時(shí)升降散組與對(duì)照組、膿毒癥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），膿毒癥組高于對(duì)照組（P＜0.05）；12 h和24 h膿毒癥組均顯著高于升降散組和對(duì)照組（P＜0.01），升降散組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TGF-β水平24 h內(nèi)升降散組呈逐漸下降趨勢(shì)；各時(shí)段升降散組和對(duì)照組均低于膿毒癥組 （P＜0.05或P＜0.01），6 h和12 h升降散組顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），24 h升降散組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠各時(shí)間段IFN-γ和TGF-β水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組小鼠各時(shí)間段IFN-γ和TGF-β水平比較（pg/mL，±s）

與對(duì)照組同時(shí)期比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與膿毒癥組同時(shí)期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 時(shí)間 I F N -γ T G F -β對(duì)照組 6 h 3 . 9 2 ± 1 . 1 9 7 7 7 . 3 5 ± 6 7 . 0 3（n = 8） 1 2 h 3 . 6 6 ± 1 . 0 7 7 8 1 . 6 4 ± 8 2 . 2 5 2 4 h 3 . 7 8 ± 1 . 2 2 7 6 5 . 3 9 ± 6 9 . 1 4膿毒癥組 6 h 5 . 1 7 ± 0 . 3 6*1 1 3 9 . 7 8 ± 6 7 . 1 1**（n = 2 4） 1 2 h 6 . 2 4 ± 0 . 4 2**1 1 9 0 . 8 3 ± 5 5 . 8 0**2 4 h 6 . 6 7 ± 0 . 3 5**1 1 8 0 . 6 7 ± 7 0 . 2 3**升降散組 6 h 4 . 1 6 ± 0 . 9 4 1 0 2 0 . 8 9 ± 2 9 . 4 9**△（n = 2 4） 1 2 h 3 . 9 9 ± 0 . 3 4△△9 8 9 . 1 8 ± 5 6 . 2 1**△△2 4 h 3 . 7 8 ± 0 . 7 5△△8 5 3 . 7 8 ± 3 4 . 7 7△△

2.2 各組小鼠各時(shí)段IL-4、IL-6水平的比較 見表2。IL-4水平24 h內(nèi)升降散組和膿毒癥組均呈逐漸下降趨勢(shì)；6 h各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），12 h升降散組低于對(duì)照組（P＜0.05），膿毒癥組與對(duì)照組、升降散組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），24 h升降散組低于對(duì)照組和膿毒癥組（P＜0.05或P＜0.01）。IL-6水平24 h內(nèi)升降散組和膿毒癥組均呈逐漸下降趨勢(shì)，各時(shí)段膿毒癥組均顯著高于升降散組和對(duì)照組 （P＜0.01），各時(shí)段升降散組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。

表2 各組小鼠各時(shí)間段IL-4和IL-6水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組小鼠各時(shí)間段IL-4和IL-6水平比較（pg/mL，±s）

組別 時(shí)間 I L -4 I L -6對(duì)照組 6 h 2 0 . 5 8 ± 3 . 9 4 2 . 4 0 ± 0 . 2 9（n = 8） 1 2 h 2 1 . 3 7 ± 4 . 4 2 2 . 5 6 ± 0 . 3 2 2 4 h 2 0 . 8 9 ± 6 . 9 7 2 . 3 3 ± 0 . 3 9膿毒癥組 6 h 2 0 . 0 5 ± 4 . 7 4 5 4 5 . 8 5 ± 4 6 . 6 4**（n = 2 4） 1 2 h 1 6 . 6 7 ± 2 . 3 7 4 2 7 . 7 3 ± 6 3 . 1 5**2 4 h 1 6 . 3 4 ± 0 . 7 0 2 2 2 . 5 5 ± 1 5 . 8 6**升降散組 6 h 1 5 . 8 1 ± 3 . 3 2 2 4 8 . 9 6 ± 4 6 . 8 5**△△（n = 2 4） 1 2 h 1 4 . 2 5 ± 1 . 0 9*1 8 4 . 6 4 ± 1 8 . 8 9**△△2 4 h 1 3 . 3 0 ± 1 . 1 8**△9 7 . 2 6 ± 1 0 . 7 8**△△

3 討 論

在膿毒癥狀態(tài)下，病原體入侵機(jī)體后通過一系列途徑引起炎癥介質(zhì)級(jí)聯(lián)“瀑布式”的釋放反應(yīng)，促炎因子大量釋放的同時(shí)還伴有抗炎因子的合成和釋放，導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)失衡，使機(jī)體處于抗炎癥反應(yīng)綜合征（CARS）狀態(tài)，即“免疫麻痹”。 膿毒癥患者處于免疫麻痹狀態(tài)時(shí)抵抗力下降，不能有效清除病原體，易導(dǎo)致二重感染，隨著膿毒癥持續(xù)進(jìn)展，最終引起機(jī)體免疫功能的紊亂［2］。其中，活化的CD4+T輔助淋巴細(xì)胞（CD4+Th）起了十分重要的作用。T輔助細(xì)胞1（Th1細(xì)胞）、Th2細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是從屬于CD4+Th的不同亞群。Th1細(xì)胞相關(guān)受體被抗原提呈細(xì)胞激活后表達(dá)T-bet，產(chǎn)生IL-12，激活NK細(xì)胞，主要分泌IL-2、IFN-γ及TNF-α等因子［3］，促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞、NK細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞活化和增殖，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答［4］。Th2細(xì)胞的分化則是由抗原及IL-4R信號(hào)啟動(dòng)，通過STAT6途徑上調(diào)T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA3的表達(dá)，主要分泌IL-4、IL-6、IL-10和IL-13等因子，介導(dǎo)體液免疫、B細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞活化以及IgE的生成［5］。Treg細(xì)胞表達(dá)Foxp3，主要產(chǎn)生TGF-β、IL-10和IL-35等因子，在膿毒癥等狀態(tài)下可表達(dá)高水平的膜結(jié)合性TGF-β1，上調(diào)Treg細(xì)胞比例，進(jìn)而通過Treg細(xì)胞對(duì)免疫應(yīng)答的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用來(lái)抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能［6］。另外，近期發(fā)現(xiàn)的Th17細(xì)胞則是一組表達(dá)特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt，分泌IL-17為主，也分泌IL-21、IL-2、IL-6及TNF-α等因子的亞群［7］。促炎因子主要有TNF-α、IFN-γ、IL-1和IL-6等，主要由Th1和Th17細(xì)胞分泌；抗炎因子主要有TGF-β、IL-4、IL-10和IL-13等［8］，主要由Th2和Treg細(xì)胞分泌。促炎和抗炎因子的相互制約維持平衡對(duì)于機(jī)體內(nèi)環(huán)境保持穩(wěn)定具有重要意義。研究證明［9］，膿毒癥時(shí)促炎因子和抗炎因子同時(shí)升高提示預(yù)后不佳，可能與免疫反應(yīng)的極度紊亂有關(guān)。因此，對(duì)膿毒癥早期藥物干預(yù)的重點(diǎn)在于調(diào)節(jié)促炎和抗炎因子的平衡，以降低或消除炎癥反應(yīng)過度或抗炎反應(yīng)過度（免疫麻痹）狀態(tài)，而維持Th1/Th2、Th17/Treg的動(dòng)態(tài)平衡則決定了促炎和抗炎因子的制約和平衡。

在中醫(yī)學(xué)理論中無(wú)“膿毒癥”名稱，根據(jù)其癥狀及演變過程，一般歸屬于“溫病”、“外感”等范疇［10］。升降散由僵蠶、蟬蛻、姜黃和大黃組方，功用為升清降濁、散風(fēng)清熱，是治療溫病的經(jīng)典方。升降散向上宣發(fā)郁熱，向下降泄?jié)釟?，使毒熱、瘀血、痰濁等病理產(chǎn)物排出體外，邪祛正存，陰陽(yáng)得以平衡。藥理研究證實(shí)，僵蠶有改善凝血、抗血栓等作用，可抑制革蘭陽(yáng)性菌和真菌，并促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌［11］；蟬蛻能降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毛細(xì)血管通透性，明顯抑制非特異性免疫和細(xì)胞免疫［12］。姜黃通過減少中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、降低絲氨酸活性而抑制炎癥反應(yīng)［13］；大黃可清除炎性介質(zhì)，降低危重癥患者血清TNF、IL和內(nèi)毒素的水平，并能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)［14］。研究表明［15-16］，在西醫(yī)治療的基礎(chǔ)上，升降散能降低膿毒癥患者TNF-α、IL-2、IL-4及IL-6等因子水平，提高IL-10水平，從促炎和抗炎兩方面對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控。本研究顯示，促炎因子IFN-γ和IL-6水平24 h內(nèi)在升降散組呈逐漸下降趨勢(shì)，多個(gè)時(shí)間段低于膿毒癥組，提示在膿毒癥狀態(tài)下升降散可抑制促炎因子的分泌，從而在初期減輕對(duì)器官和組織的損傷。另一方面，抗炎因子TGF-β和IL-4水平24 h內(nèi)在升降散組也呈逐漸下降趨勢(shì)，多個(gè)時(shí)段低于膿毒癥組，表明升降散不僅可抑制促炎因子分泌，對(duì)抗炎因子也有一定的調(diào)節(jié)抑制作用，從降低促炎和抗炎的過度反應(yīng)兩方面來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制免疫紊亂，維持免疫平衡。其機(jī)制推測(cè)為升降散通過調(diào)整炎癥細(xì)胞因子水平以正反饋抑制相關(guān)Th細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，在減少Th1和Th17細(xì)胞過度分化的同時(shí)也降低Th2和Treg細(xì)胞的過度分化，調(diào)節(jié)Th1/Th2、Th17/Treg的失衡，從而減緩炎癥反應(yīng)的失控發(fā)展。

本研究目的在于觀察升降散干預(yù)膿毒癥不同時(shí)間段促炎癥和抗炎癥細(xì)胞因子水平的變化以及對(duì)免疫失衡的調(diào)節(jié)作用，為臨床上使用升降散對(duì)膿毒癥患者的免疫失衡狀態(tài)進(jìn)行干預(yù)治療提供有效的依據(jù)。但膿毒癥時(shí)促炎和抗炎癥細(xì)胞因子的變化與多種因素有關(guān)，在不同條件下相互間的促進(jìn)和制約機(jī)制十分復(fù)雜，且升降散的具體作用途徑尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

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Research on the Inhibition of Inflammatory Cytokines by Shengjiang San in Sepsis Mice

ZHU Liang，ZHAO Lei，QIAN Fenghua，et al. Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of T.C.M.，Shanghai 200437，China

Objective：To investigate the inhibitive effects of Shengjiang San（SJS）upon the serum levels of inflammatory cytokines IFN-γ，TGF-β，IL-4 and IL-6 in sepsis mice.Methods：72 experimental mice were randomly divided into three groups：control group of 8 cases，sepsis group of 24 cases and SJS group of 24 cases. After CLP of sepsis model，the serum levels of inflammatory cytokines IFN-γ，TGF-β，IL-4 and IL-6 were compared respectively among the three groups before and after（6 h，12 h and 24 h）SJS participation.Results：At 24 hours，the serum level of IFN-γwas increasing in sepsis group and decreasing in SJS group.In sepsis group，the IFN-γ concentration was higher than that in SJS group at 12 hours and 24 hours（P＜0.01）.Serum level of TGF-β was decreasing in SJS group in 24 hours.It was lower than that in sepsis group at each time point（P＜0.01 or P＜0.05）.The serum level of IL-4 was decreasing in SJS and sepsis group in 24 hours.It in SJS group was lower than that in sepsis and control group at 24 hours（P＜0.05）.The serum level of IL-6 was decreasing both in SJS group and in sepsis group in 24 hours.In sepsis group，it was higher than that in SJS and control group at each time point（P＜0.01）.It was higher in SJS group than that in control group at each time point（P＜0.01）as well.Conclusion：Chinese herb SJS may inhibit the serum levels of inflammatory cytokines IFN-γ，TGF-β，IL-4 and IL-6 in sepsis mice.

Sepsis；Shengjiang San；Inflammatory cytokines；IFN-γ；TGF-β；IL-4；IL-6

R285.5

A

1004-745X（2015）03-0384-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.03.003

2014-12-08）

國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)建設(shè)科室和?？?；國(guó)家中醫(yī)藥管理局“名老中醫(yī)藥專家傳承工作室”建設(shè)項(xiàng)目；上海中醫(yī)藥大學(xué)預(yù)算內(nèi)項(xiàng)目（2013JW52）

△通信作者（電子郵箱：lizhiliu3＠sina.com）