蘇丹紅I在辣椒活性成分辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂提取過(guò)程中的遷移規(guī)律研究

武耐英，高 偉 ，楊清山，連運(yùn)河，張紅蕾

（1.河北工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院, 河北邯鄲 056038；2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司, 河北邯鄲 057250）

辣椒除大量用作食用蔬菜外，由于其中活性化合物辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂的存在，使得辣椒在食品、化學(xué)和制藥工業(yè)中應(yīng)用廣泛[1?5]。一般來(lái)說(shuō)，辣椒制品的品質(zhì)與顏色密切相關(guān)，因此有些不法商家應(yīng)用大量的合成染料來(lái)提高產(chǎn)品的審美吸引力。其中，蘇丹紅染料由于其優(yōu)良的感官特征和價(jià)格低廉的特點(diǎn)，經(jīng)常非法用作食品染料[6?7]。據(jù)歐盟快速警報(bào)系統(tǒng)（RASFF）的報(bào)告顯示，許多辣椒制品中均檢出蘇丹紅染料[8]，這樣勢(shì)必會(huì)影響消費(fèi)者的健康。并且國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將蘇丹紅染料列為三類致癌物，包括歐洲共同體在內(nèi)的大多數(shù)國(guó)家都不允許將其應(yīng)用于食品中[9]，并逐步確立了蘇丹紅的最大殘留限量和檢測(cè)限量[10?12]。為了有效控制各產(chǎn)品中的蘇丹紅，越來(lái)越多學(xué)者著手于蘇丹紅的檢測(cè)方法及溯源研究[13?15]。

到目前為止，蘇丹紅的污染來(lái)源可歸結(jié)為三類：非法添加、交叉污染[16]或天然污染[17?18]。其中，蘇丹紅的天然污染應(yīng)引起人們廣泛關(guān)注。前期研究發(fā)現(xiàn)，辣椒種植過(guò)程中農(nóng)資材料污染不可避免會(huì)引起辣椒蘇丹紅污染，且只有蘇丹紅I污染被檢出[18]，因此在辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂制備過(guò)程中，蘇丹紅I污染會(huì)隨著提取過(guò)程發(fā)生遷移，最終進(jìn)入提取物中。此外，提取、精制過(guò)程要經(jīng)過(guò)干燥和濃縮步驟，污染物可能在這些步驟得以富集，使得提取物中污染物含量水平較高[19?20]。因此，必須了解蘇丹紅I在辣椒活性成分提取過(guò)程中的遷移和分配機(jī)制，以確保辣椒提取行業(yè)的食品安全。有報(bào)道指出，大多數(shù)蘇丹紅在辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂提取過(guò)程中會(huì)遷移至辣椒紅中[21]，但未對(duì)實(shí)驗(yàn)中用到的提取檢測(cè)方法、全過(guò)程蘇丹紅遷移情況進(jìn)行全面研究，遷移機(jī)理也未有涉及。

因此，本研究旨在研究辣椒活性成分提取全過(guò)程中各產(chǎn)品蘇丹紅I含量、蘇丹紅I總量、色價(jià)、總辣椒堿以及遷移率，分析蘇丹紅I遷移規(guī)律及遷移機(jī)理。這些結(jié)果可為去除或降低辣椒活性成分中的蘇丹紅I污染提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；辣椒堿（97%）、二氫辣椒堿 （90%） 標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；乙腈、甲酸、乙酸 色譜純，美國(guó)Fisher公司；正己烷、氯化鈉、95%乙醇 分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；1000 kg辣椒 5354號(hào)甜椒 采自新疆庫(kù)爾勒。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS），配以BEH C18柱（50 mm×2.1 mm×5 μm） 美國(guó)Waters公司；Agilent 1260 高效液相色譜 美國(guó)Agilent科技公司；UV-1900 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津儀器公司；TH-300B超聲波清洗機(jī) 濟(jì)寧天華超聲儀器有限公司；XW-80A漩渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；FW135研磨機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；H-2050R冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)設(shè)備有限公司；ZH-001制粒機(jī) 河北石家莊新樂(lè)市正宏辣椒機(jī)械有限公司；Milli-Q 超純水器 美國(guó)Millipore公司；0.22 μm針頭過(guò)濾器和0.45 μm針頭過(guò)濾器 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂的提取 提取辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂的工藝流程如圖1所示，此工藝為優(yōu)化后的工業(yè)生產(chǎn)工藝[22]。實(shí)驗(yàn)時(shí)棄去辣椒籽，保留辣椒皮與胎座，45 ℃烘干，粉碎、過(guò)60目篩。得到的辣椒粉與0.2 MPa的水蒸汽接觸30～40 s的同時(shí)造粒成圓筒狀的辣椒粒。用正己烷（m:v=1:2.5）在55 ℃萃取辣椒粒150 min后，蒸發(fā)正己烷，獲得紅辣素（由辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂構(gòu)成）。隨后，在45 ℃加入5%的氯化鈉溶液進(jìn)行沉淀（m:v=2:1）。待固液分離完全后，棄去沉淀，上清液紅辣素層用95%乙醇提純兩次。最后，上層液在真空度0.09 MPa、90 ℃下精制1～2 h，得到辣椒油樹(shù)脂。下層液在真空度0.09 MPa、50 ℃下精制5～6 h，得到辣椒紅。

圖1 活性成分辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂提取工藝流程Fig.1 Scheme for active ingredients paprika red and capsicum oleoresin extraction process

1.2.2 蘇丹紅I的提取和測(cè)定 采集三批辣椒原料，每批樣品從不同包裝中隨機(jī)抽取三份樣本。按照歐盟修訂方法提取蘇丹紅I[23]。準(zhǔn)確稱取干燥后的辣椒原料，及提取過(guò)程中獲得的辣椒粉、辣椒粒、紅辣素、辣椒紅、辣椒油樹(shù)脂（固體樣品需粉碎混勻，液體樣品需混合均勻），按m:v=1:10加入乙腈，用漩渦混合器充分混合，超聲500 W提取10 min，10000 r/min，5 ℃下離心5 min，取上清液，用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行檢測(cè)。

蘇丹紅I測(cè)定：采用UPLC-MS/MS檢測(cè)，色譜柱為反相C18Waters ACQUITY BEH 柱（50 mm×2.1 mm，5 μm）；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL；流動(dòng)相由乙腈（溶劑A）和0.1%甲酸水溶液（溶劑B）組成，流速為0.35 mL/min，流動(dòng)相梯度洗脫條件為：0～0.5 min為70% A，0.5～3 min線性增至95% A，保持1 min，1 min內(nèi)降至70% A。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子檢測(cè)（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）對(duì)定性和定量離子進(jìn)行MS測(cè)定。毛細(xì)管電壓，1.0 kV； 萃取錐孔電壓，3.0 V；RF透鏡電壓，0.0 V；錐孔反吹氣流量，50 L/h； 脫溶劑氣流量，700 L/h。采用249.3/93.1和249.0/156.1離子對(duì)定性，249.3/156.1離子對(duì)定量。離子源溫度和脫溶溫度分別為120 ℃和420 ℃。

用空白樣品處理液配成系列蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以峰面積對(duì)被測(cè)組分的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍和10倍信噪比（S/N）確定方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）?？瞻讟悠分刑砑尤齻€(gè)不同水平的蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.4、 4.0、 10.0 μg/kg），測(cè)定回收率，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。辣椒的不同部分，胎座、果皮、籽中蘇丹紅I的提取和測(cè)定。

1.2.3 色價(jià)和總辣椒堿含量的測(cè)定 辣椒紅中的色素含量可用色價(jià)值衡量。辣椒油樹(shù)脂中的辛辣成分含量可用總辣椒堿衡量，主要包含辣椒堿、二氫辣椒堿和降二氫辣椒堿。為明確活性物質(zhì)提取方法的可靠性、蘇丹紅I在提取過(guò)程中的遷移規(guī)律以及與色價(jià)及總辣椒堿遷移規(guī)律，對(duì)各產(chǎn)品的色價(jià)和總辣椒堿均進(jìn)行測(cè)定。

采用GB 1886.34-2015 的方法測(cè)定辣椒、辣椒粉、辣椒粒、紅辣素、辣椒油樹(shù)脂、辣椒紅色素的色價(jià)[24]。根據(jù)不同樣品色價(jià)值調(diào)整稀釋倍數(shù)，確保吸光度值在0.3～0.7之間。色價(jià)的計(jì)算公式如下：

辣椒、辣椒粉、辣椒粒、紅辣素、辣椒油樹(shù)脂、辣椒紅色素中的總辣椒堿含量的提取和測(cè)定方法可概括如下[25]： 將25 g辣椒、辣椒粉、辣椒粒分別用95%乙醇回流，2 g紅辣素、200 g辣椒紅、0.1 g辣椒油樹(shù)脂分別在80 ℃下用95%乙醇超聲輔助提取2 h。用0.45 μm濾膜過(guò)濾提取液，反相高效液相色譜-紫外檢測(cè)器測(cè)定。流動(dòng)相由0.6%乙酸（溶劑A），59.4%水（溶劑B）和40%乙腈（溶劑C）組成，等度洗脫。流動(dòng)相流速為1.5 mL/min，波長(zhǎng)設(shè)置為280 nm。

以辣椒堿和二氫辣椒堿作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立測(cè)定總辣椒堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度X（mg/L）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，得到辣椒堿和二氫辣椒堿的回歸方程分別為：Y=5.84×103?1.62×103X，r2=0.9993；Y=6.13×103?5.07×103X，r2=0.9996。線性范圍均為20～100 mg/L。以三倍信噪比計(jì)算辣椒堿和二氫辣椒堿檢出限分別為0.5 mg/L和0.1 mg/L。因二氫辣椒堿和降二氫辣椒堿結(jié)構(gòu)非常相似（圖2），降二氫辣椒堿定量時(shí)采用二氫辣椒堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線，考慮到兩者分子量的不同，將降二氫辣椒堿出峰處峰面積對(duì)應(yīng)的濃度換算為降二氫辣椒堿濃度。以辣椒堿、二氫辣椒堿和降二氫辣椒堿之和計(jì)算總辣椒堿含量。

圖2 辣椒堿、二氫辣椒堿和降二氫辣椒堿的分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular structure of capsanthin, dihydrocapsaicin and nordihydrocapsaicin

1.2.4 遷移率計(jì)算 假設(shè)提取了1000 kg的辣椒原料，基于每個(gè)樣本的質(zhì)量和蘇丹紅I的含量計(jì)算得到蘇丹紅I總量（μg）。

辣椒、辣椒粉、辣椒粒、紅辣素、辣椒油樹(shù)脂、辣椒紅色素的色價(jià)、總辣椒堿和蘇丹紅I的遷移率使用公式（2）計(jì)算：

其中，X提取物表示萃取后樣品的色價(jià)、總辣椒堿和蘇丹紅總量。X原料分別表示原料辣椒的色價(jià)、總辣椒堿和蘇丹紅I總量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

工藝流程圖采用Microsoft Visio 2007繪制。采集三批辣椒樣品，每批從不同包裝中隨機(jī)抽取三份辣椒樣本。每份辣椒樣本及提取得到的辣椒粉、辣椒粒、紅辣素、辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂的色價(jià)、總辣椒堿、蘇丹紅I含量均平行測(cè)定三次，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。蘇丹紅I遷移率用九個(gè)樣本的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)采用SPSS version 21軟件處理，應(yīng)用Duncan’s法進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05為顯著性差異，同一列不同字母表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的驗(yàn)證

從辣椒中提取的色素和辛辣物質(zhì)分別是辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂。提取過(guò)程中每個(gè)產(chǎn)品的色價(jià)和總辣椒堿遷移率結(jié)果見(jiàn)表1。由結(jié)果可見(jiàn)，辣椒紅的總辣椒堿遷移率和辣椒油樹(shù)脂的色價(jià)遷移率與其它物質(zhì)存在顯著性差異（P＜0.05）。辣椒紅含有較多的色素類物質(zhì)，色價(jià)遷移率為96.32%，而辣椒油樹(shù)脂含有較多的辣味類物質(zhì)，它的總辣椒堿遷移率為97.43%。辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂的總色價(jià)遷移率為97.01%，總辣椒堿遷移率為97.57%，表明辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂提取過(guò)程能較大程度保留辣椒原料中的色價(jià)和總辣椒堿，該提取方法是可行的。

表1 辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂提取過(guò)程中色價(jià)和總辣椒堿的遷移率(%)Table 1 Transfer rate of color value and total capsaicinoids during the extraction process of paprika red and capsicum oleoresin(%)

2.2 提取過(guò)程各產(chǎn)品中蘇丹紅I的含量

本研究的辣椒原料中僅檢測(cè)出蘇丹紅I，未檢到蘇丹紅II、III和IV存在，該結(jié)果與前期研究結(jié)果吻合[17?18]。對(duì)辣椒、辣椒粉、辣椒粒、紅辣素、辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂中蘇丹紅I的檢測(cè)方法性能進(jìn)行了研究，結(jié)果如表2。線性范圍為0.1～20 μg/kg，檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.04～0.09 μg/kg和0.09～0.25 μg/kg，回收率在84.13%～90.25%之間。同時(shí)，對(duì)6個(gè)相同加標(biāo)樣品分別進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)方法的精密度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.25%～8.76%。結(jié)果表明，該方法可以滿足蘇丹紅I檢測(cè)。

表2 蘇丹紅I檢測(cè)方法性能研究Table 2 Major analytical performance for the determination of Sudan I

辣椒中蘇丹紅I的含量為0.08～0.22 μg/kg（表3），遠(yuǎn)低于歐洲委員會(huì)設(shè)定的13 mg/kg[10]。辣椒粉中蘇丹紅I質(zhì)量濃度比辣椒中增加了4.5%～12.5%。隨后采用造粒的方式來(lái)提高過(guò)濾和提取效率，由于造粒過(guò)程只有形狀發(fā)生了改變，因此辣椒粒中蘇丹紅I含量與辣椒粉中持平。正己烷萃取后紅辣素的質(zhì)量約為辣椒粒的1/10，相應(yīng)地紅辣素中的蘇丹紅I含量約為辣椒粒的9.4～10.7倍，表明辣椒粒中的蘇丹紅I幾乎全部得以萃取至紅辣素中。最終，辣椒紅中含有0.98～2.94 μg/kg蘇丹紅I，而辣椒油樹(shù)脂中未檢測(cè)到蘇丹紅I。從結(jié)果可以看出，經(jīng)過(guò)工業(yè)提取，蘇丹紅I幾乎全部留在辣椒紅中。

表3 不同批次提取中各產(chǎn)品質(zhì)量遷移率及蘇丹紅I的含量Table 3 Mass transfer rate and concentration of Sudan I in different products of different batches

同時(shí)，對(duì)辣椒各部分，即辣椒胎座、辣椒皮和籽的干重及其中的蘇丹紅I分布進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表4。由結(jié)果可見(jiàn)，辣椒中的蘇丹紅I主要存在于辣椒皮中，其殘留量占全辣椒的86%，辣椒籽中蘇丹紅I殘留量最少。研究中只選取了辣椒皮和胎座用于粉碎，且辣椒籽中蘇丹紅I含量較低，所以棄去辣椒籽后，辣椒粉中蘇丹紅I質(zhì)量濃度比辣椒中有所增加。

2.3 蘇丹紅I遷移規(guī)律

依據(jù)提取時(shí)每批樣品不同樣本的質(zhì)量和檢出的蘇丹紅I水平，計(jì)算出各個(gè)產(chǎn)品中蘇丹紅I的總量（μg），用以計(jì)算蘇丹紅I在每個(gè)過(guò)程中的遷移率（表5）。

表5 不同產(chǎn)品蘇丹紅I總含量（μg）和蘇丹紅I遷移率（%）Table 5 Total Sudan I amount (μg) and transfer rate of Sudan I (%) at different products

在目前的研究中，辣椒籽質(zhì)量占全辣椒質(zhì)量的12.10%，籽中蘇丹紅I總量占全辣椒的4.75%（表4）。工業(yè)生產(chǎn)中粉碎過(guò)程采用投包割料方式，該過(guò)程質(zhì)量會(huì)損失35.20%（表4），這樣就意味著辣椒皮和胎座存在23.30%的質(zhì)量損失，因此辣椒粉中保留了辣椒中蘇丹紅I總量的70.0%。造粒和隨后的提取過(guò)程對(duì)蘇丹紅I遷移的影響可以忽略不計(jì)（P＞0.05）。幾乎所有存在于紅辣素中的蘇丹紅I都轉(zhuǎn)移到辣椒紅中，約為辣椒中的67.56%，而辣椒油樹(shù)脂中未檢測(cè)到蘇丹紅I。

表4 辣椒胎座、辣椒皮及籽的干重、蘇丹紅I含量及蘇丹紅I總量Table 4 Dry weight, concentration of Sudan I and the total Sudan I amount of paprika pericarp, placenta and seeds

從整個(gè)提取過(guò)程來(lái)看，蘇丹紅I僅在95%乙醇加入后的分離過(guò)程進(jìn)行了重新分配，在整個(gè)提取過(guò)程中均未有減少。用95%乙醇分離紅辣素后，溶液進(jìn)入兩相體系，由上層醇溶相和下層油溶相組成，蘇丹紅I將在兩相之間分配。包含辣椒堿，二氫辣椒堿和降二氫辣椒堿的辣椒堿類化合物由于極性與乙醇相似而易于轉(zhuǎn)移至上層醇溶相中[26]。相反，辣椒紅中的色素主要包括辣椒玉紅素和辣椒紅素[27]。辣椒中70%～80%的辣椒紅色素是以脂肪酸酯形式存在，酯化過(guò)程使得辣椒紅色素的脂溶性更強(qiáng)[28?29]，因此辣椒紅傾向于轉(zhuǎn)移至下層油溶相。文獻(xiàn)表明，化合物的親和力取決于其物理化學(xué)性質(zhì)，如分子量、親脂性（log P）。蘇丹紅I的log P為5.86，高于3，所以為高度親脂性化合物[30]，因此高親脂性的蘇丹紅I傾向于進(jìn)入下層油溶層的辣椒紅中。

3 結(jié)論

在辣椒油樹(shù)脂和辣椒紅的提取過(guò)程中，蘇丹紅I只在辣椒去籽操作環(huán)節(jié)去除一部分，其余蘇丹紅I全部遷移至辣椒紅中。辣椒紅中蘇丹紅I約占全辣椒蘇丹紅I總量的67.56%。蘇丹紅I遷移性主要是由于與辣椒紅相似的脂溶性決定的。本研究中辣椒加工過(guò)程中蘇丹紅I的污染情況、遷移、分配機(jī)理的系統(tǒng)性研究，可以為適時(shí)調(diào)整提取工藝提供可行的建議。