世界衛(wèi)生組織《關(guān)于更新使用結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的建議》的啟示

夏輝 趙雁林

快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)于發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者、確定有效治療方案、獲取良好治療效果，以及阻止結(jié)核病在社區(qū)中的傳播至關(guān)重要。過(guò)去十幾年，結(jié)核病新診斷技術(shù)的研發(fā)取得了顯著進(jìn)展,世界衛(wèi)生組織已經(jīng)推薦了若干新型結(jié)核病診斷技術(shù)。2021年2月 18日，世界衛(wèi)生組織發(fā)布了《關(guān)于更新使用結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的建議》(簡(jiǎn)稱《建議》)(UpdateontheuseofnucleicacidamplificationteststodetectTBanddrug-resistantTB:rapidcommunication)[1]。此文件的發(fā)布與更新表明，在結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的診斷領(lǐng)域又有了新的進(jìn)展和更多可選擇的工具，在原來(lái)推薦的如多色半巢式熒光定量PCR、微流體芯片技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法、線性探針耐多藥及二線抗結(jié)核藥物耐藥性檢測(cè)技術(shù)等的基礎(chǔ)上[2]又提供了更多可選擇的技術(shù)和產(chǎn)品。這些技術(shù)和產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出了較好的診斷效能，為進(jìn)一步推廣應(yīng)用帶來(lái)新的前景。筆者就世界衛(wèi)生組織《建議》的產(chǎn)生背景、涉及技術(shù)的特征、性能指標(biāo)，以及我國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施中相關(guān)領(lǐng)域需要關(guān)注的問(wèn)題和啟示進(jìn)行闡述，供業(yè)內(nèi)人士參考。

一、背景

該文件在發(fā)布前通過(guò)系統(tǒng)綜述分析了目標(biāo)技術(shù)或產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)和成本等，并根據(jù)PICO(PICO是基于循證醫(yī)學(xué)理論將信息格式化的檢索方式，為Participants, Interventions, Comparisons, Outcomes的縮寫)原則，確定技術(shù)指標(biāo)(敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值)、用途、預(yù)期達(dá)到的目的，以及與其他檢查方法的可比性及區(qū)別等。由于在系統(tǒng)綜述過(guò)程中未查詢到所列技術(shù)的成本效果分析，該《建議》中描述的成本分析主要是基于前期類似技術(shù)已發(fā)表研究結(jié)果或單一儀器或試劑的成本。該《建議》的形成是通過(guò)全球?qū)＜医M咨詢，并結(jié)合系統(tǒng)綜述中的技術(shù)指標(biāo)、成本及操作簡(jiǎn)易程度、可接受性、公平性、可獲得性等進(jìn)行綜合判斷，最終給出應(yīng)用建議。

二、推薦的產(chǎn)品技術(shù)

目前世界衛(wèi)生組織結(jié)核病診斷評(píng)估機(jī)制是為了評(píng)估各類結(jié)核病診斷技術(shù)，不再針對(duì)特定產(chǎn)品。以前世界衛(wèi)生組織在推薦使用各種產(chǎn)品和技術(shù)時(shí)往往是單個(gè)產(chǎn)品的推薦，主要是囿于當(dāng)時(shí)可用的技術(shù)種類有限。隨著生物技術(shù)產(chǎn)品的日益增多，世界衛(wèi)生組織不再推薦單一的、某一種特定產(chǎn)品，而是對(duì)技術(shù)進(jìn)行了歸類，主要依據(jù)操作的復(fù)雜程度和手工操作步驟的多寡，將核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(nucleic acid amplification tests， NAAT)進(jìn)行了歸類，分別命名為低度復(fù)雜程度自動(dòng)化核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(low complexity automated NAAT))、中度復(fù)雜程度自動(dòng)化核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(moderate complexity automated NAAT)及高度復(fù)雜程度核酸雜交檢測(cè)技術(shù)(high complexity hybridization-based NAAT)。這些定義描述了技術(shù)的類型(如基于自動(dòng)化的或雜交的NAAT)及操作的復(fù)雜程度(依據(jù)所需設(shè)施、設(shè)備及技術(shù)要求等區(qū)分低度、中度或高度復(fù)雜程度)。需要注意的是，該《建議》所列出的復(fù)雜程度僅作為指導(dǎo)這些技術(shù)產(chǎn)品具體應(yīng)用時(shí)所考慮的其中一種因素，其他包括但不限于診斷準(zhǔn)確性、應(yīng)用地區(qū)的結(jié)核病及耐藥結(jié)核病流行病學(xué)特征、實(shí)施層面的因素(結(jié)果報(bào)告周期、檢測(cè)通量、現(xiàn)有檢驗(yàn)設(shè)施和實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)等)、成本，以及技術(shù)的可接受性、公平性、終端應(yīng)用的價(jià)值和用戶使用偏好等因素。

該《建議》內(nèi)定義的低度復(fù)雜程度自動(dòng)化核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)目前只納入了賽沛的Xpert MTB/XDR，該方法是基于10色熒光通道的多重PCR技術(shù)，需要注意的是Xpert MTB/XDR并不能直接使用原有的GeneXpert儀器平臺(tái)，需要對(duì)儀器核心模塊進(jìn)行更新或者重新購(gòu)買儀器。其完成檢測(cè)1份樣本約需90 min，需要手工操作的步驟非常少。此外，因世界衛(wèi)生組織于2020年10月對(duì)廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的定義進(jìn)行了修訂和更新[3]，準(zhǔn)XDR-TB (Pre-XDR-TB)定義為滿足耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病(MDR/RR-TB)且同時(shí)對(duì)任一氟喹諾酮類藥物耐藥，XDR-TB定義為滿足MDR/RR-TB且同時(shí)對(duì)任一氟喹諾酮類藥物耐藥并至少對(duì)其他A組抗結(jié)核藥物中的一種藥物耐藥。故使用Xpert MTB/XDR并不意味著可以檢測(cè)新定義下的XDR-TB患者，該方法目前也不能檢測(cè)貝達(dá)喹啉、利奈唑胺及其他可能歸入A組的藥物。

《建議》內(nèi)定義的中度復(fù)雜程度自動(dòng)化核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)目前包含4個(gè)平臺(tái)的產(chǎn)品，分別是雅培(RealTime MTB和RealTime MTB RIF/INH)、海恩生命科學(xué)(MTBDR和FluoroType MTB)、碧迪(MAXTMMDR-TB)和羅氏(MTB和MTB-RIF/INH)的產(chǎn)品技術(shù)。這些產(chǎn)品僅可用于診斷結(jié)核病、利福平及異煙肼耐藥。此處“中度復(fù)雜程度”主要依據(jù)涉及的自動(dòng)化核酸提取、自動(dòng)化PCR擴(kuò)增、自動(dòng)化結(jié)果讀取幾個(gè)步驟之間無(wú)需或只有1個(gè)移液步驟。在將檢測(cè)標(biāo)本加入到試劑盒之前，此類“自動(dòng)測(cè)試”僅需初始標(biāo)本處理時(shí)的手工操作，開展此類技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)滿足并采取一定的生物安全防護(hù)措施并配備特定設(shè)備，此外還需要訓(xùn)練有素、操作熟練的實(shí)驗(yàn)室人員來(lái)進(jìn)行檢測(cè)并完成儀器維護(hù)要求等。 此類技術(shù)包含的4種產(chǎn)品雖均為自動(dòng)化產(chǎn)品，但自動(dòng)化程度及結(jié)果報(bào)告周期不盡相同，詳細(xì)對(duì)比情況見(jiàn)表1[4]。4種產(chǎn)品較之前世界衛(wèi)生組織推薦的基于手工操作和人工判讀結(jié)果的線性探針技術(shù)在操作復(fù)雜性方面有了很大改進(jìn)。

表1 中等復(fù)雜程度自動(dòng)化核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)不同產(chǎn)品對(duì)比情況

高度復(fù)雜程度核酸擴(kuò)增雜交檢測(cè)技術(shù)目前只包含了用于吡嗪酰胺耐藥診斷的尼普洛(日本)的Genoscholar PZA-TB Ⅱ方法。其操作與結(jié)果判讀與手工線性探針技術(shù)類似，操作繁瑣，人工操作步驟多，尤其是結(jié)果判讀完全依賴人工判讀，且因吡嗪酰胺耐藥相關(guān)基因pncA突變位點(diǎn)散布于整個(gè)基因，缺乏明顯的集中突變區(qū)域，故需要判讀的條帶多且復(fù)雜，因此結(jié)果判讀受人為因素影響較大。

本次世界衛(wèi)生組織更新的《建議》雖根據(jù)復(fù)雜程度將不同的產(chǎn)品進(jìn)行了大致的歸類，但每大類都包含了特定的診斷產(chǎn)品技術(shù)，不代表其他技術(shù)可以自動(dòng)歸入相應(yīng)的類別，任何新的同類別產(chǎn)品技術(shù)都需要開展具體評(píng)估后追加更新到相應(yīng)的類別。

三、耐藥性檢測(cè)的藥物種類

現(xiàn)有的3種歸類法除了操作復(fù)雜程度外還區(qū)分了檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用范圍，如對(duì)結(jié)核分枝桿菌和抗結(jié)核藥物耐藥性的檢測(cè)。原有的世界衛(wèi)生組織推薦的技術(shù)如Xpert MTB/RIF雖然在全球應(yīng)用最廣泛，但僅能檢測(cè)利福平耐藥性。線性探針技術(shù)既有針對(duì)利福平和異煙肼的檢測(cè)產(chǎn)品，也有針對(duì)氟喹諾酮類及二線注射類藥物的耐藥性檢測(cè)產(chǎn)品，但由于線性探針技術(shù)自動(dòng)化程度較低，使得應(yīng)用該技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室相對(duì)較少。

該《建議》中的低度復(fù)雜程度自動(dòng)化核酸檢測(cè)技術(shù)Xpert MTB/XDR法可同時(shí)檢測(cè)異煙肼、氟喹諾酮類藥物、二線注射類藥物以及乙硫異煙胺相關(guān)的耐藥基因突變。中度復(fù)雜程度的自動(dòng)化核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)目前仍僅針對(duì)結(jié)核分枝桿菌及對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性檢測(cè)。高度復(fù)雜程度的Genoscholar PZA-TB Ⅱ僅可用于檢測(cè)吡嗪酰胺耐藥性，這也是目前唯一的一個(gè)用于檢測(cè)吡嗪酰胺耐藥性的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。

四、三類技術(shù)的診斷效能

1． 低度復(fù)雜程度的自動(dòng)化核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)診斷效能:包含3項(xiàng)研究的1605份樣本的系統(tǒng)綜述結(jié)果顯示，對(duì)在細(xì)菌學(xué)確診的肺結(jié)核患者，以表型藥物敏感性試驗(yàn)為參考，在痰標(biāo)本中檢測(cè)異煙肼耐藥的匯總敏感度為94.2%(95%CI：89.3%～97.0%)，匯總特異度為98.0%(95%CI：95.2%～99.2%)；檢測(cè)氟喹諾酮類藥物耐藥的匯總敏感度為93.1%(95%CI:88.0%～96.1%)，匯總特異度為98.3%(95%CI：94.5%～99.5%)；檢測(cè)阿米卡星耐藥的匯總敏感度為89.1%(95%CI：80.9%～94.1%)，匯總特異度為99.5%(95%CI：96.9%～99.9%)。因乙硫異煙胺的表型藥物敏感性試驗(yàn)的準(zhǔn)確性欠佳，故以inhA啟動(dòng)子區(qū)測(cè)序作為檢測(cè)乙硫異煙胺耐藥性的參考標(biāo)準(zhǔn)，乙硫異煙胺耐藥檢測(cè)的匯總敏感度為96.4%(95%CI：92.2%～98.3%)，匯總特異度為100.0%(95%CI:82.5%～100.0%)。

2．中度復(fù)雜程度的自動(dòng)化核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)診斷效能:包含32項(xiàng)研究的16 726份樣本的系統(tǒng)綜述結(jié)果顯示，以分離培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，中度復(fù)雜程度的自動(dòng)化核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的匯總敏感度為93.0%(95%CI：90.9%～94.7%)，匯總特異度為97.7%(95%CI：95.6%～98.8%)。以表型藥物敏感性試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)利福平耐藥的匯總敏感度為96.7%(95%CI：93.1%～98.4%)，匯總特異度為98.9%(95%CI：97.5%～99.5%)；檢測(cè)異煙肼耐藥的匯總敏感度為86.4%(95%CI：82.8%～89.3%)，匯總特異度為99.2%(95%CI：98.1%～99.7%)。

3．高度復(fù)雜程度的核酸擴(kuò)增雜交檢測(cè)技術(shù)診斷效能：包含7項(xiàng)研究的964份樣本的系統(tǒng)綜述結(jié)果顯示，以表型藥物敏感性試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌學(xué)確診肺結(jié)核患者分離株中，檢測(cè)吡嗪酰胺耐藥的匯總敏感度為81.2%(95%CI：75.4%～85.8%)，匯總特異度為97.8%(95%CI：96.5%～98.6%)。

五、對(duì)我國(guó)結(jié)核病防治的啟示

1．基于循證醫(yī)學(xué)證據(jù)結(jié)合廣泛代表性的專家論證是科學(xué)決策的有效方法：世界衛(wèi)生組織的技術(shù)文件通常都是在系統(tǒng)文獻(xiàn)綜述的基礎(chǔ)上，召集有代表性的專家，根據(jù)PICO原則，確定相關(guān)指標(biāo)，并基于循證醫(yī)學(xué)證據(jù)和專家論證意見(jiàn)，形成具有通用性和普遍性的技術(shù)推薦意見(jiàn)?；谘C醫(yī)學(xué)證據(jù)的科學(xué)決策方法值得我們學(xué)習(xí)和效仿，也需要在此基礎(chǔ)上，根據(jù)具體國(guó)情制定符合我國(guó)國(guó)情的技術(shù)措施和技術(shù)對(duì)策。

2．應(yīng)用創(chuàng)新診斷工具是結(jié)核病精準(zhǔn)診斷及治療的有效手段：由過(guò)去僅能檢測(cè)抗酸桿菌的涂片鏡檢發(fā)展到可以快速準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，由僅能通過(guò)結(jié)果報(bào)告周期約2～3個(gè)月的表型藥物敏感性試驗(yàn)到自動(dòng)化針對(duì)多種藥物的分子生物學(xué)耐藥基因檢測(cè)，甚至是基因組學(xué)預(yù)測(cè)耐藥。結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的創(chuàng)新和進(jìn)步推動(dòng)了結(jié)核病的精準(zhǔn)診斷和治療方案的選擇。《建議》中的低度復(fù)雜程度的Xpert MTB/XDR法可以快速、準(zhǔn)確的提供除利福平之外其他幾種藥物的耐藥性檢測(cè)。該方法適用于縣(區(qū))級(jí)應(yīng)用，可以有效將耐藥結(jié)核病的診斷關(guān)口前移，對(duì)耐藥結(jié)核病的診斷及后續(xù)更加精準(zhǔn)的治療產(chǎn)生促進(jìn)作用。而異煙肼耐藥性結(jié)果的及時(shí)獲得可以準(zhǔn)確診斷MDR-TB，而不是目前的以RR-TB替代MDR-TB。異煙肼敏感性的及時(shí)獲得對(duì)于我國(guó)預(yù)防性治療方案的選擇亦發(fā)揮作用。左氧氟沙星及莫西沙星作為MDR/RR-TB治療中的A類藥物，在組成有效治療方案及保護(hù)貝達(dá)喹啉等其他藥物發(fā)生獲得性耐藥中也發(fā)揮著作用[5-6]，乙硫異煙胺及吡嗪酰胺均歸類為治療MDR/RR-TB的C組藥物，在無(wú)法獲得其他藥品如貝達(dá)喹啉、德拉瑪尼、利奈唑胺時(shí)仍考慮使用[7]，故通過(guò)Xpert MTB/XDR-TB及快速、準(zhǔn)確地獲得氟喹諾酮類及其他藥品耐藥結(jié)果，對(duì)于更加精準(zhǔn)地制定治療方案十分有意義。精準(zhǔn)及有效治療方案的組成有助于殺滅患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌，對(duì)于患者個(gè)體可以提高治愈率，對(duì)于人群而言有助于減少耐藥結(jié)核病的傳播。

《建議》中的低度復(fù)雜程度及中度復(fù)雜程度的自動(dòng)化核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)將有助于其更快地在結(jié)核病防治規(guī)劃中的高質(zhì)量擴(kuò)展。

3.多種創(chuàng)新工具的出現(xiàn)需要因地施策和應(yīng)用：世界衛(wèi)生組織將在2021年更新的《結(jié)核病整合指南模塊3診斷-結(jié)核病快速檢測(cè)》中發(fā)布關(guān)于檢測(cè)結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的最新政策指南。雖然《建議》中所列技術(shù)均未獲得我國(guó)相關(guān)部門的批準(zhǔn)，我們也需要提前考慮如何有效地在結(jié)核病防治規(guī)劃中應(yīng)用這些技術(shù)或同類技術(shù)，不同的地區(qū)可根據(jù)本地異煙肼及氟喹諾酮類藥物的耐藥率、疾病負(fù)擔(dān)、不同層級(jí)的實(shí)驗(yàn)室能力及設(shè)施等制定適宜的策略。若兩種藥物的耐藥率較高，則迫切需要加強(qiáng)基于自動(dòng)化核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，可以考慮在縣(區(qū))級(jí)應(yīng)用Xpert MTB/XDR。相反，若耐藥率低，則在經(jīng)費(fèi)有限的情況下短期內(nèi)可維持現(xiàn)有診斷流程，即在地市級(jí)采用快速耐藥基因檢測(cè)方法檢測(cè)MDR/RR-TB，后續(xù)用表型藥物敏感性試驗(yàn)方法檢測(cè)其他藥物耐藥。在地市級(jí)使用這些技術(shù)，仍然存在標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)延誤、診斷延誤、患者失訪等風(fēng)險(xiǎn)，因此要加強(qiáng)如標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)、患者管理、結(jié)果反饋等配套措施的建立和有效運(yùn)行。但從結(jié)核病控制的角度，還是應(yīng)盡快推廣應(yīng)用這些自動(dòng)化的核酸擴(kuò)增耐藥檢測(cè)技術(shù)，盡可能提供快速準(zhǔn)確的耐藥性診斷。

實(shí)施層面各地需要相應(yīng)的政策支持，如各地物價(jià)的申請(qǐng)、醫(yī)保政策的支持等。對(duì)于使用Xpert MTB/RIF的地方，使用Xpert MTB/RIF時(shí)，除了試劑成本外，亦需要進(jìn)行重新更換模塊及校準(zhǔn)[8]。若引入新的中度復(fù)雜程度自動(dòng)化核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，需要新的設(shè)施、設(shè)備和試劑，實(shí)驗(yàn)室人員和臨床醫(yī)生培訓(xùn)，以及新的質(zhì)量保證系統(tǒng)等。

4．開展基礎(chǔ)與實(shí)施性研究進(jìn)一步創(chuàng)新和改善診斷工具：《建議》中的幾種技術(shù)雖在呼吸道樣本中顯示出較高的敏感度，但在不同國(guó)家、區(qū)域和不同臨床標(biāo)本中的性能，在HIV感染者和兒童中的效能，在肺外樣本中的診斷效能尚未進(jìn)行大范圍評(píng)估[9-10]，在我國(guó)更是缺乏相應(yīng)研究和數(shù)據(jù)。

一些突變頻率較低的位點(diǎn)并沒(méi)有納入作為異煙肼及氟喹諾酮類藥物耐藥檢測(cè)的靶標(biāo)序列[9，11]，可能在某些區(qū)域造成較低的敏感度。目前尚無(wú)基于分子生物學(xué)的貝達(dá)喹啉、德拉瑪尼等新藥的耐藥檢測(cè)技術(shù)，需要進(jìn)一步開展基礎(chǔ)研究和應(yīng)用型研究以創(chuàng)新及改善現(xiàn)有診斷工具。

中度復(fù)雜程度的4種產(chǎn)品迫切需要補(bǔ)充對(duì)其他藥物的耐藥性檢測(cè)。用于吡嗪酰胺耐藥檢測(cè)的高度復(fù)雜程度核酸擴(kuò)增雜交技術(shù)的操作仍過(guò)于復(fù)雜，仍需提升自動(dòng)化水平。

我國(guó)同等功能的技術(shù)，需要范圍更廣的評(píng)估和驗(yàn)證，從而推動(dòng)我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)產(chǎn)品技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。