恒溫微流控系統(tǒng)檢測(cè)及鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌的應(yīng)用價(jià)值

王泉 馬瑞瑛 楊婷 張亞麗 許苗 撒玉玲 陳清波

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)與非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)臨床上引起的疾病難以區(qū)別，在無(wú)菌種鑒定情況下NTM病經(jīng)常被誤診為結(jié)核病，而兩者治療方案明顯不同[1-2]。因此，快速準(zhǔn)確地鑒定MTBC與NTM對(duì)結(jié)核病的早期診斷、早期治療，以及對(duì)疾病防控均具有重要意義。傳統(tǒng)的區(qū)分MTBC與NTM方法主要依靠培養(yǎng)法結(jié)合對(duì)硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)生長(zhǎng)試驗(yàn)，但培養(yǎng)法耗時(shí)較長(zhǎng)。恒溫微流控芯片檢測(cè)系統(tǒng)集等溫?cái)U(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)一體化，具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短等優(yōu)勢(shì)；且其多樣本和多重檢測(cè)等功能可極大簡(jiǎn)化操作流程，降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求，適于基層地區(qū)開(kāi)展[3-4]。筆者利用恒溫微流控芯片技術(shù)檢測(cè)痰液標(biāo)本中MTBC與NTM，并與分枝桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法和PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比，以評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

一、菌株來(lái)源

采用前瞻性研究方法，收集新疆醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院2018年9月至2019年12月間經(jīng)抗酸染色鏡檢陽(yáng)性的痰液標(biāo)本，共624份。

二、儀器和試劑

1.儀器：恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀、MTB-NTM微流控芯片由廣州迪澳生物科技有限公司提供，設(shè)備可進(jìn)行4塊芯片反應(yīng)，每塊芯片可同時(shí)進(jìn)行4份樣本的MTB與NTM區(qū)分鑒定。

2.試劑：萋-尼染色液、酸性改良羅氏培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；DNA提取液(廣州迪澳生物科技有限公司)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.羅氏固體培養(yǎng)和PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)菌種鑒定：將收集合格的3 ml痰液標(biāo)本中加入2倍體積4%的氫氧化鈉溶液后渦旋振蕩混勻，靜置15 min。以無(wú)菌吸管吸取處理后的痰標(biāo)本(約1 ml)均勻接種至酸性改良羅氏培養(yǎng)基斜面上，每支培養(yǎng)基接種2滴(0.1～0.15 ml)。將接種后的培養(yǎng)基連同斜面培養(yǎng)架置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，(36±1) ℃孵育。24 h后再擰緊培養(yǎng)管螺旋蓋放置于直立的培養(yǎng)架上，(36±1) ℃繼續(xù)孵育。將PNB用二甲基甲酰胺溶解稀釋后加入未凝固的改良羅氏培養(yǎng)基中，最終濃度控制在0.5 mg/ml；TCH用滅菌蒸餾水溶解，培養(yǎng)基中最終濃度為5 μg/ml。PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。

2.核酸模板提取：另取1 ml液化后痰標(biāo)本加入離心管，10 000×g離心5 min，棄上清液，加入100 μl的DNA提取液，100 ℃加熱10 min冷卻至室溫，10 000×g離心2 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中備用。

3. 恒溫微流控系統(tǒng)檢測(cè)：分別針對(duì)分枝桿菌復(fù)合群(16S rRNA)及MTBC(IS6110)特異性核酸片段設(shè)計(jì)恒溫引物，并采用引物預(yù)包埋技術(shù)將其固定至微流控芯片。將提取上清液及恒溫反應(yīng)液5 μl(按照每個(gè)反應(yīng)腔室0.2 μl上清液及2.3 μl恒溫反應(yīng)液混合)均分至各反應(yīng)腔，芯片置于核酸恒溫分析儀中，63 ℃反應(yīng)45 min。采用實(shí)時(shí)熒光曲線對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，當(dāng)呈現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線時(shí)該反應(yīng)腔室核酸檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線則結(jié)果為陰性。若16S rRNA和IS6110檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，則鑒定結(jié)果為MTB；若16S rRNA檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，IS6110檢測(cè)結(jié)果為陰性，則鑒定為NTM；若16S rRNA和IS6110檢測(cè)結(jié)果均為陰性，則鑒定結(jié)果為非分枝桿菌。

4. 二代測(cè)序技術(shù)：對(duì)于微流控檢測(cè)系統(tǒng)和PNB及TCH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不一致的標(biāo)本，將樣本核酸交給深圳華大基因公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，使用華大基因研制的專利產(chǎn)品試劑盒中的引物作為測(cè)序上下游引物，測(cè)序儀器型號(hào)為BGISEQ-500。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以“百分率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以羅氏固體培養(yǎng)和PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)菌種鑒定結(jié)果為參照，評(píng)價(jià)恒溫微流控系統(tǒng)檢測(cè)分枝桿菌和鑒定菌種的效能，各指標(biāo)計(jì)算公式如下：敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%。各方法間的一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75，說(shuō)明一致性較好；0.4≤Kappa值<0.75，說(shuō)明一致性一般；Kappa值<0.4，說(shuō)明一致性較差。

結(jié) 果

一、分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果

624份痰標(biāo)本中，經(jīng)羅氏固體培養(yǎng)法檢測(cè)陽(yáng)性612份(98.1%)，其中，515份(82.5%，515/624)經(jīng)PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)菌種鑒定為MTB，97份(15.5%，97/624)鑒定為NTM。恒溫微流控系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性607份(97.3%)，其中，513份(82.2%，513/624)鑒定為MTB，94份(15.1%)鑒定為NTM。恒溫微流控系統(tǒng)和傳統(tǒng)培養(yǎng)法分枝桿菌陽(yáng)性檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.021，P=0.950)。

二、檢測(cè)效能分析

以羅氏固體培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果作為參照標(biāo)準(zhǔn)，恒溫微流控系統(tǒng)檢測(cè)抗酸染色鏡檢陽(yáng)性的痰液標(biāo)本中分枝桿菌的敏感度和特異度分別為99.2%(607/612)和100.0%(12/12)，Kappa值為0.82，見(jiàn)表1。

表1 恒溫微流控系統(tǒng)以痰培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)痰液標(biāo)本分枝桿菌的效能

以PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果作為參照標(biāo)準(zhǔn)，恒溫微流控系統(tǒng)檢測(cè)痰液標(biāo)本中MTBC的敏感度和特異度分別為99.6%和100.0%，Kappa值為0.99，見(jiàn)表2。恒溫微流控系統(tǒng)檢測(cè)痰液標(biāo)本中NTM的敏感度和特異度分別為96.9%和100.0%，Kappa值為0.98，見(jiàn)表3。

表2 恒溫微流控系統(tǒng)以PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)MTBC的效能

表3 恒溫微流控系統(tǒng)以PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)NTM的效能

三、方法間差異性分析

5份分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性而恒溫微流控系統(tǒng)檢測(cè)為陰性的標(biāo)本，經(jīng)PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定，2份為MTBC，3份為NTM。經(jīng)測(cè)序，2份MTBC標(biāo)本得到確證；3份NTM標(biāo)本中1份為偶發(fā)分枝桿菌，2份為諾卡菌。

討 論

傳統(tǒng)的MTBC與NTM的區(qū)分采用培養(yǎng)法結(jié)合PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)，耗時(shí)較長(zhǎng)(約2～6周)[5]。恒溫微流控系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)對(duì)4份標(biāo)本多指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)，從進(jìn)樣到結(jié)果判讀僅需1 h，同傳統(tǒng)方法相比有效縮短了檢測(cè)和鑒定時(shí)間。另外，反應(yīng)在恒溫條件下即可進(jìn)行，對(duì)設(shè)備的要求相對(duì)較低；蝶式微流控芯片使用普通聚乙烯材料制作，采用離心進(jìn)樣方式可有效降低檢測(cè)成本，進(jìn)一步降低了患者的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，適合于現(xiàn)場(chǎng)和基層單位應(yīng)用。

本研究利用基于核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)開(kāi)發(fā)的微流控芯片與設(shè)備對(duì)624份抗酸染色鏡檢陽(yáng)性的痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用羅氏固體培養(yǎng)法和PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)菌種鑒定進(jìn)行對(duì)比，探討該技術(shù)檢測(cè)分枝桿菌和鑒定MTBC與NTM的應(yīng)用價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)法分枝桿菌陽(yáng)性檢出率為98.1%，恒溫微流控系統(tǒng)陽(yáng)性檢出率為97.3%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以改良羅氏固體培養(yǎng)法結(jié)果為參照，恒溫微流控系統(tǒng)檢測(cè)分枝桿菌具有較高的敏感度(99.2%)和特異度(100.0%)，能直接區(qū)分分枝桿菌與其他呼吸道致病菌感染；Kappa值為0.82，表明該方法與培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果一致性較好，具有較高的檢測(cè)效能，適用于臨床標(biāo)本分枝桿菌感染初篩。王桂榮等[6]利用多重PCR技術(shù)檢測(cè)MTB和NTM臨床分離株的敏感度分別為99.36%和98.00%；特異度分別為99.32%和98.00%?？梢?jiàn)，該方法具有較高的檢測(cè)敏感度和特異度，但其結(jié)果判讀采用瓊脂糖凝膠電泳，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用價(jià)值較低。張潔等[7]研究顯示，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法和菌種鑒定方法相比，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)MTBC的敏感度為99.0%，檢測(cè)NTM的敏感度為75.4%，總符合率為99.0%。本研究顯示，以PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)菌種鑒定結(jié)果為參照，恒溫微流控系統(tǒng)鑒定MTBC與NTM的敏感度分別為99.6%和96.9%，Kappa值分別為0.99與0.98，說(shuō)明以核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)的恒溫微流控系統(tǒng)適用于痰液標(biāo)本中MTBC與NTM的鑒定。

此外，本研究中有5份分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性而恒溫微流控系統(tǒng)檢測(cè)為陰性的標(biāo)本，測(cè)序結(jié)果顯示2份為MTB，1份為偶發(fā)分枝桿菌。恒溫微流控系統(tǒng)檢測(cè)為陰性的原因是當(dāng)痰標(biāo)本中分枝桿菌分布較為集中時(shí)，分配給待考評(píng)檢測(cè)體系的標(biāo)本可能不含菌或含菌量低于或接近待反應(yīng)體系的最低檢出限，導(dǎo)致其結(jié)果為陰性。2份標(biāo)本經(jīng)PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定為NTM，而測(cè)序結(jié)果為諾卡菌，可能是培養(yǎng)過(guò)程中污染所致。王建等[5]對(duì)2175株分枝桿菌進(jìn)行PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)，初步鑒定的93株NTM有14株為假陽(yáng)性，與本研究的現(xiàn)象類似。這說(shuō)明以培養(yǎng)法為參照標(biāo)準(zhǔn)在鑒定NTM時(shí)存在一定不足，以核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)的篩查結(jié)果相對(duì)可靠。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，恒溫微流控系統(tǒng)在以抗酸染色鏡檢陽(yáng)性為診斷基礎(chǔ)時(shí)，鑒定痰液標(biāo)本中MTBC與NTM具有較好的性能。這為該方法的普及提供了有力的證據(jù)。當(dāng)然，本研究也存在一定的不足：(1)無(wú)法對(duì)菌株耐藥情況進(jìn)行檢測(cè)；(2)NTM 因菌種差異而導(dǎo)致臨床用藥也不相同，本檢測(cè)系統(tǒng)無(wú)法對(duì)NTM臨床分離株進(jìn)行菌種鑒定。