Xpert MTB/RIF Ultra在兒童結(jié)核病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

王亞翠 孫琳 申阿東

兒童結(jié)核病存在較多漏診和誤診且死亡率相對(duì)較高，因此，兒童結(jié)核病的防控面臨著很大的挑戰(zhàn)。目前，兒童結(jié)核病診斷的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法如抗酸染色、固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)，敏感度低且耗時(shí)長(zhǎng)。另外，兒童結(jié)核病大多數(shù)為原發(fā)性肺結(jié)核，標(biāo)本的菌載量較低且不易采集，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)培養(yǎng)和涂片檢查陽(yáng)性率低，導(dǎo)致兒童結(jié)核病早期診治相對(duì)困難。因此，研發(fā)更加快速、敏感的檢測(cè)方法對(duì)兒童結(jié)核病的早期診斷和及時(shí)治療至關(guān)重要。

GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱(chēng)“Xpert”)是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦用于結(jié)核病早期診斷和利福平耐藥檢測(cè)的分子診斷技術(shù)。Xpert檢測(cè)技術(shù)具有較高的敏感度和特異度，并且能夠準(zhǔn)確、快速檢測(cè)出MTB及其對(duì)利福平的耐藥性。因此，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷。盡管Xpert檢測(cè)技術(shù)具有較高的敏感度，但是在含菌量較少的患者(如兒童結(jié)核病患者)中的檢測(cè)敏感度較低[1-2]，并且對(duì)不同類(lèi)型的肺外結(jié)核標(biāo)本檢測(cè)敏感度差別較大[3]。為了進(jìn)一步提高Xpert檢測(cè)技術(shù)的敏感度，新一代的Xpert MTB/RIF Ultra(簡(jiǎn)稱(chēng)“Xpert Ultra”)檢測(cè)技術(shù)被研發(fā)并應(yīng)用。該檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于成人結(jié)核病檢測(cè)，并且多項(xiàng)研究結(jié)果證明其診斷成人結(jié)核病的敏感度優(yōu)于Xpert檢測(cè)[4-8]。目前，Xpert Ultra檢測(cè)技術(shù)在兒童結(jié)核病診斷中的研究相對(duì)較少，為此，筆者對(duì)其在此方面的研究及應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、Xpert Ultra與Xpert技術(shù)原理對(duì)比

2017年3月，WHO推薦使用新一代的檢測(cè)方法Xpert Ultra替代Xpert，旨在提高檢測(cè)敏感度。與Xpert相比，Xpert Ultra檢測(cè)技術(shù)的PCR擴(kuò)增體系由原來(lái)的25 μl增加至50 μl，并且在Xpert檢測(cè)單個(gè)ropB目的基因的基礎(chǔ)上增加檢測(cè)2種多拷貝序列IS6110和IS1081。這些技術(shù)的改進(jìn)使Xpert Ultra對(duì)MTB的檢出下限由原來(lái)的112.6 CFU/ml下降為15.6 CFU/ml，與Xpert相比敏感度提高了7倍[9-10]。此外，Xpert Ultra檢測(cè)原理由半定量半巢式循環(huán)閾值比較變?yōu)榘攵砍彩絇CR，并采用了高分辨率熔解曲線(xiàn)技術(shù)。改善了Xpert檢測(cè)ropB基因突變類(lèi)型中“沉默突變”錯(cuò)誤報(bào)陽(yáng)的情況，重新設(shè)計(jì)了ropB基因的分子信標(biāo)，提高了利福平耐藥相關(guān)第553位密碼子突變檢測(cè)能力，以及使Q513Q、F514F沉默突變與其他利福平耐藥相關(guān)的決定區(qū)域的突變得以區(qū)分，從而更好地區(qū)分ropB突變種類(lèi)及在混合感染時(shí)檢測(cè)利福平耐藥情況。Xpert Ultra檢測(cè)技術(shù)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是檢測(cè)時(shí)間明顯縮短，報(bào)陽(yáng)和報(bào)陰時(shí)間由Xpert的110 min分別縮短至77 min和66 min，從而有利于患者的快速診斷和及時(shí)采取治療措施[11]。

二、Xpert Ultra對(duì)兒童結(jié)核病診斷的敏感度

(一)Xpert Ultra檢測(cè)不同類(lèi)型標(biāo)本的敏感度

Xpert Ultra檢測(cè)不同類(lèi)型臨床標(biāo)本的效能不同。在兒童結(jié)核病診斷中檢測(cè)的標(biāo)本類(lèi)型包括痰液、胃液、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、鼻咽抽吸物、糞便等。目前以痰標(biāo)本Xpert Ultra檢測(cè)開(kāi)展的研究最多。研究表明，在呼吸道樣本中，Xpert Ultra檢測(cè)BALF的敏感度最高，胃液和痰液次之，鼻咽拭子較低[12-16]。痰液是肺結(jié)核診斷應(yīng)用最廣泛的呼吸道樣本類(lèi)型。以痰標(biāo)本MTB培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Ultra檢測(cè)痰標(biāo)本診斷肺結(jié)核的敏感度為58%～75%[12-13，15，17]；Meta分析結(jié)果顯示，Xpert檢測(cè)痰標(biāo)本診斷肺結(jié)核的匯總敏感度約為62%[1]。Sun等[14]研究顯示，以MTB培養(yǎng)或涂片抗酸染色鏡檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，Xpert Ultra檢測(cè)BALF標(biāo)本診斷肺結(jié)核的敏感度可達(dá)91%。Zar等[15]研究顯示，以痰培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Ultra檢測(cè)鼻咽抽吸物診斷肺結(jié)核的敏感度為46%。在消化道樣本中，已有很多研究報(bào)道了胃液Xpert檢測(cè)在兒童結(jié)核病診斷中的準(zhǔn)確性[18-23]。Detjen等[1]薈萃分析顯示，Xpert檢測(cè)胃液標(biāo)本診斷肺結(jié)核的匯總敏感度為66%。Sun等[16]研究顯示，以MTB培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Ultra檢測(cè)兒童胃液標(biāo)本診斷肺結(jié)核的敏感度可達(dá)87.5%。兩項(xiàng)研究評(píng)估了Xpert Ultra檢測(cè)兒童糞便標(biāo)本診斷肺結(jié)核的臨床應(yīng)用價(jià)值。Kabir等[24]研究顯示，以痰MTB培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Ultra檢測(cè)兒童糞便標(biāo)本診斷肺結(jié)核的敏感度優(yōu)于Xpert(88.9%vs77.8%)；該研究中糞便標(biāo)本Xpert Ultra陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果中80%為“痕量(trace)”。Liu等[25]研究顯示，Xpert Ultra檢測(cè)糞便和呼吸道樣本的一致性可達(dá)84.1%，檢測(cè)糞便樣本診斷兒童肺結(jié)核的敏感度為45.5%，與細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)敏感度相同。一篇納入9項(xiàng)研究的Meta分析顯示，Xpert檢測(cè)糞便標(biāo)本診斷兒童肺結(jié)核的匯總敏感度為67%[26]，與檢測(cè)痰標(biāo)本的診斷敏感度(62%)相當(dāng)[1]。

(二)Xpert Ultra診斷培陰涂陰結(jié)核病的敏感度

既往研究顯示，結(jié)核病患兒培養(yǎng)陽(yáng)性率約為30%～40%[27]，抗酸染色鏡檢陽(yáng)性率僅為6.8%[28]。因此，在兒童結(jié)核病中也會(huì)存在一定比例的培陰涂陰患者。涂陰患者也具有傳染性，約有10%～20%結(jié)核病患者的傳播來(lái)源于涂陰患者[29]，并且由于缺乏細(xì)菌學(xué)證據(jù)導(dǎo)致誤診誤治，從而使涂陰患者的病死率高達(dá)20%[30]。加強(qiáng)該部分患兒的早期快速診斷，對(duì)于及早診治尤為重要。目前，關(guān)于Xpert Ultra檢測(cè)技術(shù)在涂陰結(jié)核病患者中的應(yīng)用多集中于成人，Xpert Ultra診斷成人培陽(yáng)涂陰肺結(jié)核患者的敏感度優(yōu)于Xpert，較Xpert提高了13%～25%[4-5，10]。Sabi等[13]研究顯示，在Xpert Ultra和Xpert診斷兒童涂陰肺結(jié)核的敏感度分別為44.4%和27.8%，Xpert Ultra的診斷敏感度明顯高于Xpert。由上述研究結(jié)果可知，Xpert Ultra診斷敏感度相對(duì)較好，有助于患兒的早期診斷和早期治療，控制疾病的進(jìn)展。

(三)Xpert Ultra檢測(cè)MTB/HIV雙重感染的敏感度

結(jié)核病是艾滋病患者最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)感染之一，約占20%～50%，艾滋病患者結(jié)核病發(fā)病率是正常人的30倍[31]。艾滋病并發(fā)結(jié)核病患者死亡率較高，特別是兒童患者，免疫損傷更嚴(yán)重，導(dǎo)致MTB廣泛播散、病情進(jìn)展更快和臨床表現(xiàn)復(fù)雜。因此，早期診斷并及時(shí)治療對(duì)降低此類(lèi)患者的死亡率至關(guān)重要。Xpert和Xpert Ultra被推薦用于MTB/HIV雙重感染的檢測(cè)。2014年WHO出版的《國(guó)家結(jié)核病規(guī)劃關(guān)于兒童結(jié)核病處理指南》建議，對(duì)疑似HIV感染的結(jié)核病患兒，Xpert可先于培養(yǎng)法和抗酸染色法作為初篩方法[32]。Meta分析顯示，Xpert診斷兒童結(jié)核病并發(fā)HIV感染的匯總敏感度為70%[1]。Sabi等[13]研究表明，Xpert Ultra檢測(cè)該類(lèi)患者的敏感度更高，較Xpert增加了19%。

三、Xpert Ultra診斷兒童結(jié)核病的特異度

Xpert Ultra檢測(cè)在敏感度增高的同時(shí)不可避免地會(huì)引起特異度降低[33]。該檢測(cè)方法的特異度受檢測(cè)地區(qū)結(jié)核病發(fā)病率及患病人群的影響。在結(jié)核病發(fā)病率低于100/10萬(wàn)的國(guó)家或地區(qū)，Xpert Ultra檢測(cè)的特異度為99%；在結(jié)核病發(fā)病率高于100/10萬(wàn)的國(guó)家或地區(qū)，其檢測(cè)特異度為95%[2]。結(jié)核病發(fā)病率高的地區(qū)人群有既往結(jié)核病病史的比例高，Xpert Ultra因其檢出限較低能夠檢測(cè)到既往感染者體內(nèi)殘存少量的MTB核酸，從而導(dǎo)致其檢測(cè)特異度降低。Xpert Ultra檢測(cè)各種類(lèi)型標(biāo)本用于診斷兒童結(jié)核病時(shí)，其特異度較為接近，為96.9%～99.4%[12-16]，高于其在成人檢測(cè)中的特異度[4]。這可能與成人既往結(jié)核病病史比例高于兒童有關(guān)(21%vs7%)[33]。

四、Xpert Ultra在實(shí)際應(yīng)用中的要點(diǎn)

(一)不同類(lèi)型標(biāo)本檢測(cè)的處理流程及影響因素

痰液、鼻咽抽吸物、BALF的處理流程類(lèi)似，加入標(biāo)本處理液后振蕩并室溫孵育后，加入試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。胃液標(biāo)本因?yàn)閜H值較低，需要加入等體積1.5%的氫氧化鈉中和胃酸；振蕩并室溫孵育，離心后的沉淀添加標(biāo)本處理液并加入試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。糞便標(biāo)本因含有較多的雜質(zhì)，與其他標(biāo)本處理步驟不同。待測(cè)糞便標(biāo)本加入糞便處理液、標(biāo)本處理液和玻璃珠振蕩混勻并室溫孵育，混合物過(guò)濾后才能加入試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

如采集的標(biāo)本10 d內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，則建議放在2～8 ℃冷藏。如長(zhǎng)期儲(chǔ)存則建議冷凍保存。在加入標(biāo)本處理液之后，如不能立即處理則需要放2 ℃～8 ℃冷藏，并于4 h內(nèi)加入試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；如果加入試劑盒后，則需要在30 min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。標(biāo)本的儲(chǔ)存時(shí)間是否會(huì)影響檢出率也存在一些不一致的結(jié)論。例如，Singh等[34]認(rèn)為，隨著胃液儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，Xpert檢測(cè)的陽(yáng)性率也下降，在冷凍儲(chǔ)存650～849 d內(nèi)，其陽(yáng)性率為77.1%，而超過(guò)1050 d后其陽(yáng)性率降至50%。但該研究結(jié)果也提示，即使采用冷凍存放4年以上的胃液標(biāo)本，其檢出率也可以達(dá)到50%。這可能與分子生物學(xué)方法較高的敏感度有關(guān)。盡管如此，在有條件的情況下，采集標(biāo)本后盡快進(jìn)行檢測(cè)有助于保證標(biāo)本的檢出效率。

(二)不同類(lèi)型樣本的選擇和聯(lián)合應(yīng)用

呼吸道樣本中以痰液、BALF、鼻咽拭子使用較多。由于痰標(biāo)本采集具有無(wú)創(chuàng)性，大年齡、能夠自主咳痰兒童可優(yōu)先選擇采用痰液進(jìn)行檢測(cè)。但是大多數(shù)情況下，兒童肺結(jié)核患者痰標(biāo)本獲取難度大，不合格率高且含菌量較少，因此，臨床廣泛探索其他呼吸道標(biāo)本用于Xpert Ultra檢測(cè)，以期提高檢出率。在符合氣管鏡檢查指征且行支氣管肺泡灌洗的結(jié)核病患兒中，BALF也是非常有效的檢測(cè)標(biāo)本。但BALF的采集受醫(yī)院資源設(shè)備、醫(yī)生技術(shù)水平等多種因素的影響，在基層醫(yī)院和疾病高負(fù)擔(dān)國(guó)家和地區(qū)應(yīng)用受到一定的限制。另外，鼻咽抽吸物相對(duì)容易獲取，也可作用無(wú)痰患兒的補(bǔ)充樣本。

除外呼吸道樣本，消化道樣本中胃液和糞便也是兒童結(jié)核病診斷的重要樣本類(lèi)型。兒童因其生理特點(diǎn)無(wú)法咳出呼吸道分泌物，而通過(guò)吞咽活動(dòng)將含有MTB的分泌物吞咽入消化道，在其胃液和糞便標(biāo)本中可檢測(cè)到MTB，因此，適用于排痰困難的兒童。胃液一直被國(guó)內(nèi)外推薦作為住院兒童進(jìn)行病原體檢測(cè)的標(biāo)本類(lèi)型。例如，德國(guó)50%以上的肺結(jié)核患兒都是采用胃液MTB培養(yǎng)得以確診[35]。Meta分析和臨床研究的數(shù)據(jù)也都顯示，Xpert和Xpert Ultra檢測(cè)胃液、糞便與呼吸道標(biāo)本的敏感度接近，甚至略高，均在60%以上[1，25-26]。研究顯示，消化道標(biāo)本檢出的陽(yáng)性率隨年齡逐漸下降[16，35]，在小于1歲患兒中檢出率最高[35]，提示胃液標(biāo)本在咳痰困難的小年齡患兒中診斷價(jià)值更高。

因此，Xpert Ultra檢測(cè)技術(shù)用于兒童肺結(jié)核診斷時(shí)，首先應(yīng)考慮無(wú)創(chuàng)性痰標(biāo)本和鼻咽抽吸物進(jìn)行檢測(cè)。如果患兒不能自主排痰，或者痰液標(biāo)本質(zhì)量無(wú)法達(dá)到檢測(cè)要求時(shí)，可選擇胃液標(biāo)本。其次，糞便標(biāo)本也是很好的補(bǔ)充標(biāo)本類(lèi)型，但目前仍需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。在滿(mǎn)足纖維支氣管鏡檢查適應(yīng)證且條件允許時(shí)，可考慮BALF檢測(cè)。

Zar等[15]指出，2次鼻咽抽吸物取樣用于Xpert Ultra檢測(cè)可將其敏感度增加至54%；單次痰標(biāo)本聯(lián)合單次鼻咽抽吸物進(jìn)行檢測(cè)，Xpert Ultra的敏感度可高達(dá)80%；單次痰標(biāo)本聯(lián)合2次鼻咽抽吸物進(jìn)行檢測(cè)，Xpert Ultra的敏感度可升高至87%。雖然Xpert Ultra檢測(cè)鼻咽抽吸物的敏感度低于痰標(biāo)本，但是多次取樣及聯(lián)合多種不同類(lèi)型標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)也可以提高其對(duì)MTB的檢出率。因此，針對(duì)診斷困難的兒童結(jié)核病患者，尤其是培陰涂陰結(jié)核病和結(jié)核病并發(fā)HIV感染的患兒，選擇敏感度高的分子生物學(xué)方法可提高檢出率，而且多次取樣和聯(lián)合多種標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)也可有效提高其診斷效能。

(三)Xpert Ultra的痕量結(jié)果判讀

Xpert Ultra檢測(cè)結(jié)果在Xpert的基礎(chǔ)上增加了“痕量”這一項(xiàng)?！昂哿俊苯Y(jié)果被認(rèn)為是導(dǎo)致Xpert Ultra檢測(cè)特異度降低的主要原因，通常代表無(wú)活力的細(xì)菌，尤其在有近期結(jié)核病病史的人群中[9]。然而，由于兒童結(jié)核病患者M(jìn)TB載量較低，在兒童中Xpert Ultra檢測(cè)結(jié)果為“痕量”的患者多數(shù)可診斷為結(jié)核病[13-15]。成人有結(jié)核病病史的比例高于兒童，如果將成人Xpert Ultra檢測(cè)為“痕量”患者視為陽(yáng)性，則容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。為了解決這一問(wèn)題，研究者將Xpert Ultra 檢測(cè)“痕量”結(jié)果給出了3種解讀方案：一是直接將該檢測(cè)結(jié)果劃分為陰性結(jié)果；二是將有結(jié)核病病史且出現(xiàn)“痕量”結(jié)果的患者視為陰性；三是重新采集標(biāo)本再進(jìn)行Xpert Ultra檢測(cè)，如果第2次檢測(cè)結(jié)果為陰性則視為陰性患者，如果第2次檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性則視為陽(yáng)性患者[4]。研究表明，第1種方案的Xpert Ultra檢測(cè)特異度最高，但是以該分類(lèi)分析Xpert Ultra檢測(cè)敏感度也會(huì)隨之下降；第2、3種方案在提高Xpert Ultra檢測(cè)特異度的同時(shí)也維持了相對(duì)較高的敏感度[4]。

綜上所述，Xpert Ultra檢測(cè)可以明顯提高兒童結(jié)核病患者，以及臨床難以診斷的涂陰肺結(jié)核患者、結(jié)核病并發(fā)HIV感染等載菌量較低患者的檢出率。目前，在兒童群體中Xpert Ultra檢測(cè)主要應(yīng)用于肺結(jié)核的診斷，并且當(dāng)前所用標(biāo)本多為呼吸道標(biāo)本和胃液標(biāo)本。未來(lái)，還需要評(píng)估Xpert Ultra用于肺外結(jié)核診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值，探討其對(duì)不同類(lèi)型標(biāo)本的檢測(cè)效能。