不同產(chǎn)地蠶蛹的HPLC指紋圖譜研究及多組分含量測定

鄭倩倩 王小芳 路麗娟 張淼 趙艷普

中圖分類號 R284;R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）14-1747-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.14

摘 要 目的：建立蠶蛹指紋圖譜和多組分含量測定方法，為全面評價蠶蛹的質(zhì)量提供參考。方法：以不同產(chǎn)地的18批蠶蛹為樣品，采用高效液相色譜法（HPLC）進行測定。色譜柱為資生堂CAPCELL PAK C18 AQ S5，流動相為甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（梯度洗脫），檢測波長為260 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012年版）》進行HPLC指紋圖譜分析及相似度評價，并通過與對照品色譜圖比對進行色譜峰的指認;測定蠶蛹樣品中尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、尿苷等4個核苷類成分的含量。結(jié)果：在18批蠶蛹樣品的HPLC指紋圖譜中確定了16個共有峰，指認了3號峰為尿嘧啶、6號峰為鳥嘌呤、7號峰為黃嘌呤、8號峰為尿苷;各樣品圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.912～1.000。尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、尿苷分別在5.34～534、5.28～528、5.06～506、5.195～519.5 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積線性關系良好（r均不低于0.999 8）;檢測限分別為0.032 4、0.032 0、0.030 7、0.031 2 μg/mL，定量限分別為0.106 8、0.105 6、0.101 2、0.103 0 μg/mL;精密度、重復性、穩(wěn)定性（24 h）試驗的RSD均小于1.00%（n=6）;平均加樣回收率為100.15%～102.95%，RSD均小于2.00%（n=9）。含量測定結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地蠶蛹中尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、尿苷的含量分別為0.41%～2.46%、0.37%～1.98%、0.72%～2.63%、0.94%～3.67%。結(jié)論：所建蠶蛹HPLC指紋圖譜及其4個核苷類成分含量測定方法的專屬性較強，且準確、可靠，可用于蠶蛹的質(zhì)量評價及質(zhì)量控制。

關鍵詞 蠶蛹;高效液相色譜法;指紋圖譜;含量測定;核苷類成分

Study on HPLC Fingerprint of Bombyx mori from Different Producing Areas and Content Determination of Multi-component

ZHENG Qianqian，WANG Xiaofang，LU Lijuan，ZHANG Miao，ZHAO Yanpu（Shijiazhuang Food and Drug Inspection Center， Shijiazhuang 050000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the fingerprint of Bombyx mori and the method for the content determination of multi- components， and to provide reference for comprehensive quality evaluation of B. mori. METHODS：Using 18 batches of B. mori from different producing areas as samples， HPLC method was used. The column was Shiseido CAPCELL PAK C18 AQ S5 with mobile phase consisted of methanol-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 260 nm， and column temperature was set at 30 ℃. The sample size was 10 μL. HPLC fingerprint analysis and similarity evaluation were performed by using TCM Chromatogram Fingerprint Similarity Evaluation System （2012 edition）， and the chromatographic peak was identified by comparing with the chromatogram of reference substance. The contents of 4 nucleosides as uracil， guanine， xanthine， uridine were determined. RESULTS：A total of 16 common peaks were identified in HPLC fingerprint for 18 batches of B. mori，and peaks 3， 6 ， 7 and 8 were identified as uracil， guanine， xanthine and uridine. The similarity of sample chromatogram with control fingerprint were 0.912-1.000. The linear range of uracil， guanine， xanthine and uridine were 5.34-534，5.28-528，5.06-506，5.195-519.5 μg/mL（r≥0.999 8）. The limits of detection were 0.032 4， 0.032 0， 0.030 7， 0.031 2 μg/mL， and the limits of quantitation were 0.106 8， 0.105 6， 0.101 2， 0.103 0 μg/mL. RSDs of precision， reproducibility and stability tests （24 h） were all lower than 1.00% （n=6）. Average recoveries were 100.15%-102.95%，and RSDs were all lower than 2.00%（n=9）. The content determination results showed that the content of uracil， guanine， xanthine and uridine of B. mori from different producing areas were 0.41%-2.46%，0.37%-1.98%， 0.72%-2.63%， 0.94%-3.67%， respectively. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprint and content determination method of 4 nucleosides were specific， accurate and reliable， which can be used for the quality evaluation and control of B. mori.

KEYWORDS? ?Bombyx mori; HPLC; Fingerprint; Content determination; Nucleosides

蠶蛹又稱小蜂兒[1]，為蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx mori Linnaeus的干燥蛹[2]。據(jù)《本草綱目》記載，蠶蛹炒食可治風及勞瘦，研敷可治惡瘡，研末飲服可退熱、除蛔蟲，煎煮飲服可止消渴[1]。蠶蛹在全國各地均有分布，且作為傳統(tǒng)的藥食同源中藥材，其營養(yǎng)和藥用價值都很高[3-4]?，F(xiàn)代研究表明，蠶蛹含有豐富的營養(yǎng)成分及蛋白質(zhì)、多糖等生物活性成分，具有促進肝細胞再生、降低膽固醇、降血脂、降血糖及延緩衰老、抗腫瘤等多種作用[5-7]。此外，蠶蛹作為動物藥，體內(nèi)還存在多種核苷類物質(zhì)（如黃嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤、尿苷等），其可參與DNA的代謝過程，具有抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性，并可調(diào)節(jié)機體的心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等，具有較高的研究價值[8-9]。在醫(yī)藥領域，目前已研究開發(fā)出了多種含核苷類成分的藥物，如碘苷、利巴韋林、阿昔洛韋等，且研究、應用范圍還在擴大[10]。中藥指紋圖譜作為一種可量化的綜合性化學鑒定方法，具有整體性和模糊性的特點[11-13]，可用來評價中藥材及中成藥的整體質(zhì)量[14-16]。鑒于此，本研究擬采用高效液相色譜法（HPLC）建立不同產(chǎn)地蠶蛹的指紋圖譜，并對黃嘌呤、尿苷、尿嘧啶、鳥嘌呤等4個核苷類成分進行定量分析，以期更科學、全面地評價蠶蛹的質(zhì)量。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有1260型HPLC儀（美國Agilent公司）、XS105DU型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）、P180H型超聲波清洗機（德國Elmasonic公司）、FW100型高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本研究共收集蠶蛹藥材18批，分別來自河北（8批）、浙江（5批）和四川（5批）;所有藥材經(jīng)石家莊市食品藥品檢驗中心畢飛霞副主任藥師鑒定均為蠶蛾科昆蟲家蠶B. mori Linnaeus的干燥蛹，具體來源信息見表1。尿嘧啶（批號100469-201302，純度99.6%）、鳥嘌呤（批號140631-201205，純度99.6%）、黃嘌呤（批號140662- 200802，純度99.1%）、尿苷（批號111887-200202，純度98.6%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為去離子水（電導率為18.0 MΩ·cm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以資生堂CAPCELL PAK C18 AQ S5（250 mm×4.6 mm，5 ?m）為色譜柱，以甲醇（A）-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～13 min，100%B;13～30 min，100%B→85%B;30～50 min，85%B→40%B;50～55 min，40%B）;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為260 nm;進樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取蠶蛹樣品，粉碎（過三號篩），精密稱取上述粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入水25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理40 min，放冷至室溫;再次稱定質(zhì)量，用水補足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 混合對照品溶液 稱取黃嘌呤對照品10.12 mg、鳥嘌呤對照品10.56 mg、尿苷對照品10.39 mg、尿嘧啶對照品10.68 mg，置于同一10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液。將上述貯備液用50%甲醇稀釋20倍，制成每1 mL中含黃嘌呤50.6 μg、鳥嘌呤52.8 μg、尿苷51.9 μg、尿嘧啶53.4 μg的混合對照品溶液。

2.2.3 空白溶液 以樣品的提取溶劑（水）作為空白溶液。

2.3 專屬性試驗

取“2.2”項下供試品溶液（編號CY-5）、混合對照品溶液以及空白溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各待測成分的色譜峰與相鄰色譜峰間的分離度均大于1.5，以各成分計的理論板數(shù)均大于6 000，且空白溶液對測定無干擾，說明此方法專屬性良好。專屬性試驗的HPLC色譜圖見圖1。

2.4 指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 精密度試驗 精密稱取蠶蛹樣品（編號CY-5）0.5 g，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，然后按照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。以8號峰（尿苷峰）為參照峰（S，該峰的保留時間相對居中且與其余色譜峰的分離度良好），計算得16個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.3%（n=6）、相對峰面積的RSD均小于0.5%（n=6），表明該方法的精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 精密稱取蠶蛹樣品（編號CY-5）0.5 g，共6份，分別按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，然后按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以8號峰為參照峰，計算得16個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.8%（n=6）、相對峰面積的RSD均小于0.9%（n=6），表明該方法的重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取蠶蛹樣品（編號CY-5）0.5 g，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以8號峰為參照峰，計算得16個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2%（n=6），表明該供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 指紋圖譜建立及相似度評價 精密稱取18批蠶蛹樣品各0.5 g，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，然后分別按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將18批蠶蛹樣品的HPLC圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》中，以樣品CY-1的圖譜為參照圖譜，設置時間窗寬度為0.1 min，通過多點校正和色譜峰匹配生成樣品疊加指紋圖譜，采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（R）;然后以對照指紋圖譜為參照，進行各樣品圖譜的相似度評價。同時，通過將對照指紋圖譜與對照品色譜圖（圖1B）進行比對，進行色譜峰的指認。結(jié)果，18批蠶蛹樣品中共標定了16個共有峰;通過與對照品色譜圖比對，指認了其中4個共有峰，分別為尿嘧啶（3號峰）、鳥嘌呤（6號峰）、黃嘌呤（7號峰）和尿苷（8號峰）。各樣品圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.912～1.000，說明18批蠶蛹樣品具有很高的相似性。18批蠶蛹樣品的HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜見圖2，相似度評價結(jié)果見表2。

2.5 4個核苷類成分的含量測定

2.5.1 線性關系考察 分別精密量取“2.2.2”項下混合對照品貯備液0.5、5、10、25、50 mL，置于不同的100 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容，搖勻，制成5個不同質(zhì)量濃度的線性工作液。將上述線性工作液分別按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分的質(zhì)量濃度為橫坐標（x，μg/mL）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸。結(jié)果，各待測成分均在其相應質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積的線性關系良好（r均不低于0.999 8），詳見表3。

2.5.2 檢測限和定量限考察 取“2.2.2”項下混合對照品貯備液，以50%甲醇倍比稀釋，然后按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。分別以信噪比3 ∶ 1、10 ∶ 1計算待測成分的檢測限和定量限，結(jié)果見表3。

2.5.3 精密度試驗 精密稱取蠶蛹樣品（編號CY-5）0.5 g，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，然后按照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、尿苷峰面積的RSD分別為0.21%、0.35%、0.24%、0.53%（n=6），表明該方法的精密度良好。

2.5.4 重復性試驗 精密稱取蠶蛹樣品（編號CY-5）0.5 g，共6份，分別按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，然后按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并采用外標法計算各成分的含量。結(jié)果，尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、尿苷含量的RSD分別為0.51%、0.65%、0.44%、0.59%（n=6），表明該方法的重復性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 精密稱取蠶蛹樣品（編號CY-5）0.5 g，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時分別按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、尿苷峰面積的RSD分別為0.71%、0.75%、0.64%、0.79%（n=6），表明該供試品溶液在室溫放置24 h的穩(wěn)定性良好。

2.5.6 準確度考察 取已知含量的蠶蛹樣品（編號CY-5）樣品9份，每份0.25 g，精密稱定，分別按已知量的50%、100%、150%加入相應混合對照品溶液，每個質(zhì)量濃度平行操作3份，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，然后按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算4個成分的加樣回收率。結(jié)果，尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、尿苷的平均加樣回收率分別為102.95%（RSD=1.79%，n=9）、102.05%（RSD=1.74%，n=9）、101.70%（RSD=1.73%，n=9）、100.15%（RSD=1.82%，n=9），表明本方法的準確度良好，結(jié)果見表4。

2.5.7 蠶蛹樣品中4個成分的含量測定 取18批蠶蛹樣品，分別按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，然后按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并采用外標法分別計算各成分的含量。結(jié)果，浙江產(chǎn)蠶蛹中尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、尿苷的平均含量最高，分別為2.28%、1.56%、2.45%、3.20%;其次是四川產(chǎn)蠶蛹，4個成分的平均含量分別為1.09%、1.11%、2.00%、2.53%;河北產(chǎn)蠶蛹中上述4個成分的含量最低，平均含量分別為0.57%、0.50%、0.85%、1.41%?？梢?，不同產(chǎn)地蠶蛹樣品中4個核苷類成分的含量差異較大。18批蠶蛹樣品中4個核苷類成分的含量測定結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 樣品提取方法的選擇

在前期研究中，筆者分別采用甲醇、水、乙醇、30%乙醇為提取溶劑進行蠶蛹樣品的提取。結(jié)果顯示，以甲醇、乙醇、30%乙醇為樣品的提取溶劑時，色譜圖中色譜峰信息量較少;而以水為提取溶劑時，色譜圖中各色譜峰的分離度均較好，且信息量較多，因此最終選用水作為蠶蛹樣品的提取溶劑。在此基礎上，筆者又分別考察了回流提取和超聲提取兩種提取方法對蠶蛹樣品色譜圖的影響，發(fā)現(xiàn)這兩種樣品提取方式對結(jié)果的影響差異不大，但鑒于超聲提取操作更簡便，故本研究最終選取超聲提取的方式進行蠶蛹樣品的處理。此外，筆者通過考察不同料液比（1 ∶ 25、1 ∶ 50、1 ∶ 100，g/mL）、不同提取時間（30、40、50 min）對結(jié)果的影響，最終選擇料液比1 ∶ 50（g/mL）、提取時間40 min。

3.2 色譜條件的選擇

在前期研究中，筆者先后采用兩種流動相體系（甲醇-水、甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液）進行了分離條件的探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇-水為流動相進行梯度洗脫時，樣品的色譜峰達不到基線分離，且樣品圖譜的信息量較少;而采用甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相進行梯度洗脫時，樣品圖譜中的色譜峰數(shù)量多、峰形對稱性和分離度均較好，圖譜所反映的樣品信息量較大，故本研究最終以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相進行梯度洗脫。此外，筆者前期利用二極管陣列檢測器在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)鳥嘌呤、尿苷、尿嘧啶、黃嘌呤分別在258、260、266、 274 nm波長處有最大吸收。經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)，在260 nm波長處，供試品溶液中各待測成分色譜峰與其余色譜峰分離良好，故本研究最終選擇260 nm作為測定波長。接著，筆者又對不同柱溫（25、30 、35 ℃）和不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）進行了考察，結(jié)果當柱溫為30 ℃、流速為1.0 mL/min時各色譜峰的峰形最好。

3.3 指紋圖譜及含量測定結(jié)果分析

指紋圖譜作為整體、穩(wěn)定的化學鑒別手段，在中藥材及中成藥質(zhì)量控制中具有重要作用。本研究建立了18批蠶蛹樣品的HPLC指紋圖譜，并進行了相似度評價。結(jié)果，本研究共確認了16個共有峰，并指認了尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、尿苷等4個成分;18批樣品的相似度均大于0.900，表明河北、四川、浙江產(chǎn)蠶蛹的成分具有較高的相似性。蠶蛹作為動物藥，體內(nèi)存在的核苷類物質(zhì)是其代表性成分，具有重要的作用[8-10]。其中，黃嘌呤可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)，具有擴張支氣管的作用，可作為支氣管擴張劑治療哮喘;尿苷具有免疫調(diào)節(jié)等功能，可用于治療巨型紅血球貧血以及肝腦血管、心血管等疾病;尿嘧啶可抑制腫瘤細胞增殖，可用于腫瘤的治療;鳥嘌呤可拮抗代謝調(diào)控，具有信號傳遞作用，常被作為痛風癥研究的生理指標[17-19]。筆者對18批蠶蛹樣品中尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、尿苷等4個核苷類成分進行定量分析發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地樣品中上述4個成分的含量差異較大，其中以浙江產(chǎn)蠶蛹的平均含量最高，其次是四川產(chǎn)蠶蛹，而河北產(chǎn)蠶蛹的平均含量最低，這可能與各產(chǎn)地的氣候、地理位置等不同有關。

綜上所述，本研究所建立的不同產(chǎn)地蠶蛹HPLC 指紋圖譜及多組分含量測定方法的專屬性較強，且準確、可靠。結(jié)合指紋圖譜和核苷類成分的定量研究，可以為區(qū)分蠶蛹的產(chǎn)地以及全面、準確地控制蠶蛹的質(zhì)量提供參考。

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（收稿日期：2021-04-09 修回日期：2021-06-15）

（編輯：林 靜）