壯藥三七姜乙酸乙酯提取物抗炎、鎮(zhèn)痛作用的譜-效關(guān)系研究

梁潔 陳輝華 楊川川 曹玉嬪 陳俊 李耀華 陳曉思 柳賢福

中圖分類號(hào) R285;R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）14-1721-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.10

摘 要 目的：考察不同產(chǎn)地壯藥三七姜乙酸乙酯提取物抗炎、鎮(zhèn)痛作用的譜-效關(guān)系。方法：以不同產(chǎn)地的10批三七姜為樣品，分別以二甲苯致小鼠耳廓腫脹、乙酸致小鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)考察其乙酸乙酯提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛活性。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》建立10批三七姜乙酸乙酯提取物的高效液相色譜指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)進(jìn)行共有峰的指認(rèn)。基于Pearson相關(guān)系數(shù)法（以小鼠耳腫脹度和15 min內(nèi)扭體次數(shù)為藥效指標(biāo)）和灰色關(guān)聯(lián)分析法（以耳腫脹抑制率和鎮(zhèn)痛率為藥效指標(biāo)）分析三七姜乙酸乙酯提取物抗炎、鎮(zhèn)痛的譜-效關(guān)系。結(jié)果：10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物均具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，其對(duì)小鼠的耳腫脹抑制率為46.43%～55.16%，對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛率為45.56%～52.72%。10批樣品共確定了18個(gè)共有峰，其與對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.994～0.997。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出了峰1、2、4分別為原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，峰10、18與小鼠耳腫脹度和15 min內(nèi)扭體次數(shù)均呈顯著負(fù)相關(guān)（r分別為-0.853、? ?-0.738，P分別為0.002、0.015）;灰色關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，18個(gè)共有峰與耳腫脹抑制率和鎮(zhèn)痛率的關(guān)聯(lián)度均在0.65以上，其中峰14、1（原兒茶酸）、17、9、4（對(duì)羥基苯甲醛）、2（對(duì)羥基苯甲酸）、16、7、6與耳腫脹抑制率的關(guān)聯(lián)度相對(duì)較高（關(guān)聯(lián)度均高于0.7），峰1（原兒茶酸）、17、14、9、16、2（對(duì)羥基苯甲酸）、4（對(duì)羥基苯甲醛）與鎮(zhèn)痛率的關(guān)聯(lián)度相對(duì)較高（關(guān)聯(lián)度均高于0.7）。結(jié)論：三七姜乙酸乙酯提取物具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，峰1（原兒茶酸）、2（對(duì)羥基苯甲酸）、10、14、17、18等可能是其主要活性成分。

關(guān)鍵詞 三七姜;乙酸乙酯提取物;抗炎;鎮(zhèn)痛;譜-效關(guān)系;Pearson相關(guān)性分析;灰色關(guān)聯(lián)分析

Study on Spectrum-effect Relationship of Anti-inflammatory and Analgesic Effects of Ethyl Acetate Extract from Zhuang Medicine Stahlianthus involucratus

LIANG Jie1，2，3，CHEN Huihua1，YANG Chuanchuan1，CAO Yupin1，CHEN Jun1，LI Yaohua1，CHEN Xiaosi1，LIU Xianfu4（1. School of Pharmacy， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China; 2. Guangxi Zhuang Yao Medicine Center of Engineering and Technology， Nanning 530200， China; 3. Guangxi Superior Chinese Patent Medicine and National Medicine Development Engineering Technology Center， Nanning 530200， China; 4. College of Pharmacy Science， Guangxi University of TCM， Nanning 530222， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the spectrum-effect relationship of analgesic and anti-inflammatory effects of ethyl acetate extract from Zhuang medicine Stahlianthus involucratus from different habitats. METHODS： Ten batches of S. involucratus from different habitats were used as samples to investigate the anti-inflammatory and analgesic activities of ethyl acetate extracts by xylene induced ear swelling test and acetic acid induced writhing test in mice. HPLC fingerprints of 10 batches of ethyl acetate extract from S. involucratus were established and their similarity was evaluated by using Similarity Evaluation System of TCM Chromatogram Fingerprint （2012 edition）， and the common peaks were identified by comparison with the control. The spectrum-effect relationship of anti-inflammatory and analgesic effects of ethyl acetate extract from S. involucratus were analyzed on the basis of Pearson correlation coefficient （auricle swelling degree and writhing times in 15 min as pharmacodynamic indexes） and Grey relational analysis （inhibition rate of ear swelling and analgesic rate as pharmacodynamic indexes）. RESULTS： Ten batches of ethyl acetate extract from S. involucratus had obvious anti-inflammatory and analgesic effects; inhibition rates of ear swelling in mice were 46.43%-55.16%， and the analgesic rates of mice were 45.56%-52.72%. A total of 18 common peaks were identified in 10 batches of samples， and the similarity between them and the control fingerprint was 0.994-0.997. Compared with substance control， the peaks 1， 2 and 4 were identified as protocatechuic acid， p-hydroxy- benzoic acid and p-hydroxybenzaldehyde， respectively. Results of Pearson correlation analysis showed that peak 10 and peak 18 were significantly negative correlated with auricle swelling degree and writhing times in 15 min （r were values -0.853， -0.738，P values were 0.002， 0.015， respectively）. Results of Gray correlation degree analysis showed that the correlation degree of 18 common peaks with inhibition rate of ear swelling and analgesic rate were all greater than 0.65; among them， peaks 14， 1 （protocatechuic acid）， 17， 9， 4 （p-hydroxybenzaldehyde）， 2 （p-hydroxybenzoic acid）， 16， 7 and 6 showed the relatively high correlation degree （correlation degree >0.7）; peak 1 （protocatechuic acid）， 17， 14， 9， 16， 2 （p-hydroxybenzoic acid） and 4 （p-hydroxybenzaldehyde） showed the relatively high correlation degree （correlation degree >0.7）. CONCLUSIONS： The ethyl acetate extract of S. involucratus show good anti-inflammatory and analgesic effects. Peak 1 （protocatechuic acid）， 2 （p-hydroxybenzoic acid）， 10， 14， 17， 18 may be its main active ingredients.

KEYWORDS? ?Stahlianthus involucratus; Ethyl acetate extract; Anti-inflammatory; Analgesic; Spectrum-effect relationship; Pearson correlation analysis; Gray correlation analysis

三七姜為姜科Zingiberaeeae姜七屬植物土田七Stahlianthus involucratus（King ex Bak.）Craib.的塊根和根莖，又稱土田七、小田七、竹田七、毛七、姜三七、姜田七等，其性溫，味辛，具有散瘀、止痛、止血等功效，主治跌打損傷、風(fēng)濕骨痛等[1]。三七姜為廣西民間傳統(tǒng)壯藥，現(xiàn)收載于《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第二卷）》[2]，主要分布于我國(guó)廣西、云南、廣東、福建等省區(qū)[3]?，F(xiàn)代研究表明，三七姜中含有黃酮類、皂苷類、酚類、蒽醌類、三萜類、糖類等多種化學(xué)成分[4]，具有抗腫瘤、抗炎等藥理作用[5-6]。民間常將三七姜根莖作為野生草藥使用，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)風(fēng)濕性骨關(guān)節(jié)疼痛癥狀有一定療效，可用于治療風(fēng)濕骨痛、吐血衄血、月經(jīng)過(guò)多等;且還可炒炭研粉后撒于患處以散瘀消腫、活血止血、行氣止痛，用于治療跌打損傷、蟲(chóng)咬蛇傷、外傷出血等[1]。

本課題組前期對(duì)三七姜不同溶劑提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯提取物具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。目前，譜效學(xué)已被學(xué)者廣泛應(yīng)用于中藥的活性成分和藥理作用關(guān)系的研究中，其可通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法，快捷地篩選出中藥的活性成分，從而分析其藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[7]?；诖?，本研究分別以二甲苯致小鼠耳廓腫脹、乙酸致小鼠扭體反應(yīng)作為炎癥和疼痛模型，考察三七姜乙酸乙酯提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛藥效;并建立不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，然后通過(guò)Pearson相關(guān)系數(shù)法和灰色關(guān)聯(lián)分析法將抗炎、鎮(zhèn)痛藥效與指紋圖譜進(jìn)行關(guān)聯(lián)，旨在初步探討三七姜抗炎、鎮(zhèn)痛作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)壯藥三七姜提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1100型HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）、CPA225D型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）、UPC-Ⅱ-10T型實(shí)驗(yàn)室超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）、HH-S型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）、TGL-16G型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）等。

1.2 主要藥品與試劑

10批三七姜藥材均由本課題組自行采摘，所有藥材經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)滕建北教授鑒定均為姜科植物土田七S. involucratus（King ex Bak.）Craib.的塊根和根莖，其具體來(lái)源信息見(jiàn)表1。復(fù)方醋酸地塞米松乳膏（批號(hào)1812012S，規(guī)格20 g ∶ 15 mg）購(gòu)自華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司;雙氯芬酸二乙胺乳膠劑[批號(hào)VP2181，規(guī)格20 g ∶ 0.2 g（以C14H10Cl2NNaO2計(jì)）]購(gòu)自北京諾華制藥有限公司;原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)RP190605，純度≥98%）、對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品（批號(hào)RP190609，純度≥98%）、對(duì)羥基苯甲醛對(duì)照品（批號(hào)RP180913，純度≥98%）均購(gòu)自成都麥德生科技有限公司;二甲苯（批號(hào)20181022）購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司;冰乙酸（批號(hào)181227）購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司;甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為健康SPF級(jí)KM小鼠，共240只，雄性，體質(zhì)量為18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2016-0002。所有小鼠購(gòu)入后均飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)期間均自由攝食、飲水。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守《廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。所有小鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 三七姜乙酸乙酯提取物的制備

稱取不同產(chǎn)地三七姜粗粉適量，加入8倍量（mL/mg）的80%乙醇，加熱回流提取3次，每次2 h，分別濾過(guò)并合并3次濾液，減壓濃縮至無(wú)醇味，得到三七姜80%乙醇總提物。將總提物用水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取3次，分別合并萃取液，回收乙酸乙酯部位萃取溶劑，蒸干，即得到不同產(chǎn)地三七姜藥材的乙酸乙酯提取物（得率約為1.23%）。將所得提取物密封后置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛作用2.2.1 藥液的制備 臨用前，將“2.1”項(xiàng)下10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物分別用水配成質(zhì)量濃度均為1.5 g/mL（按生藥量計(jì)）的混懸液，備用。

2.2.2 三七姜乙酸乙酯提取物的抗炎作用研究 將120只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、復(fù)方醋酸地塞米松乳膏組（陽(yáng)性對(duì)照，0.06 g/耳，劑量參考本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）和10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物組（0.075 g/耳，以生藥量計(jì)，劑量參考本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組10只，均按組別分籠飼養(yǎng)。各給藥組小鼠分別于右耳正反兩面涂抹相應(yīng)藥液50 μL，空白對(duì)照組小鼠同法涂抹生理鹽水50 μL，每10 min涂抹1次，連續(xù)涂藥1 h，共涂藥6次。末次涂藥結(jié)束10 min后，用生理鹽水擦凈右耳后再用干藥棉擦干。10 min后，除空白對(duì)照組外的其余各組小鼠均于右耳涂抹二甲苯20 μL致炎，分別于致炎后10 min和2 h，再次于右耳涂抹等量二甲苯1次。于再次涂抹二甲苯4 h后，處死小鼠（處死前用生理鹽水擦凈右耳并用干藥棉擦干），剪下雙耳，對(duì)齊，用6 mm打孔器取下圓形耳片，稱定上述圓形耳片的質(zhì)量。根據(jù)以下公式計(jì)算耳腫脹度和耳腫脹抑制率：耳腫脹度（mg）=致炎耳耳片質(zhì)量（mg）-正常耳耳片質(zhì)量（mg）;耳腫脹抑制率（%）=（空白對(duì)照組平均耳腫脹度-給藥組平均耳腫脹度）/空白對(duì)照組平均耳腫脹度×100%。采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。各組小鼠耳腫脹度和耳腫脹抑制率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，與空白對(duì)照組比較，復(fù)方醋酸地塞米松軟膏組和10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物組小鼠的耳腫脹度均顯著降低（P<0.01）。10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠的耳腫脹抑制率為46.43%～55.16%，說(shuō)明各樣品均有較好的抗炎作用。

2.2.3 三七姜乙酸乙酯提取物的鎮(zhèn)痛作用研究 將120只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、雙氯芬酸二乙胺乳膠劑組（陽(yáng)性對(duì)照，0.3 g/只，劑量參考本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）和10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物組（0.45 g/只，以生藥量計(jì)，劑量參考本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組10只，均按組別分籠飼養(yǎng)。于實(shí)驗(yàn)前24 h，剃除各組小鼠腹部被毛（面積約2 cm×2 cm）。各給藥組小鼠每天于脫毛處涂抹相應(yīng)藥液2次（9：00和17：00），每次涂抹0.3 mL（以均勻涂抹于脫毛部位為準(zhǔn)），共涂抹4天;空白對(duì)照組小鼠同法涂抹生理鹽水0.3 mL。于末次涂藥1 h后，各組小鼠均腹腔注射0.6%乙酸溶液（0.2 mL/只），觀察其注射乙酸溶液后15 min內(nèi)的扭體次數(shù)和扭體潛伏期（即第1次扭體反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間），并計(jì)算各給藥組小鼠的鎮(zhèn)痛率：鎮(zhèn)痛率（%）=（空白對(duì)照組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù)）/空白對(duì)照組平均扭體次數(shù)×100%。按“2.2.2”項(xiàng)下方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組小鼠扭體潛伏期、15 min內(nèi)扭體次數(shù)和鎮(zhèn)痛率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，與空白對(duì)照組比較，雙氯芬酸二乙胺乳膠劑組小鼠的扭體潛伏期顯著延長(zhǎng)（P<0.01），10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物組小鼠的扭體潛伏期雖也有所延長(zhǎng)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;雙氯芬酸二乙胺乳膠劑組和10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物組小鼠15 min內(nèi)扭體次數(shù)均顯著減少（P<0.01）。10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物組小鼠的鎮(zhèn)痛率為45.56%～52.72%，說(shuō)明各樣品均有較好的鎮(zhèn)痛作用。

2.3 10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物的HPLC指紋圖譜

2.3.1 溶液制備 （1）對(duì)照品溶液：稱取對(duì)羥基苯甲酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲醛對(duì)照品各適量，加甲醇溶解制成上述成分質(zhì)量濃度分別為 0.212、0.236、0.149 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。（2）三七姜供試品溶液：分別稱取不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物0.1 g，精密稱定，用5 mL甲醇超聲（功率250 W，頻率50 kHz）提取5 min，用甲醇定容到10 mL量瓶中，混勻，過(guò)濾，濾液以13 000 r/min 離心10 min，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.2 色譜條件 以Phenomenex Kinetex XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫梯度（0～20 min，60%B;20～50 min，60%B→80%B;50～75 min，80%B→100%B）;流速為0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 稱取三七姜乙酸乙酯提取物（編號(hào)S9）0.1 g，按“2.3.1（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄色譜圖。結(jié)果，以2號(hào)峰（對(duì)羥基苯甲酸，該峰含量相對(duì)較高、分離度良好且出峰穩(wěn)定）為參照峰（S），計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.18%（n=6）、相對(duì)峰面積的RSD均小于1.80%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取三七姜乙酸乙酯提取物（編號(hào)S9）0.1 g，按“2.3.1（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時(shí)分別按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，以2號(hào)峰為參照峰，計(jì)算得各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.34%（n=6）、相對(duì)峰面積的RSD均小于2.12%（n=6），表明該供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取三七姜乙酸乙酯提取物（編號(hào)S9）0.1 g，精密稱定6份，分別按“2.3.1（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，以2號(hào)峰為參照峰，計(jì)算得各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.34%（n=6）、相對(duì)峰面積的RSD均小于1.77%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6 HPLC指紋圖譜的生成 分別取10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物各0.1 g，按 “2.3.1（2）” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將10批樣品的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》中，以S1樣品的色譜圖為參照?qǐng)D譜（因S1樣品圖譜的色譜峰信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)且峰形較好），設(shè)置時(shí)間窗寬度為 0.1 s，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行色譜峰匹配生成疊加指紋圖譜，并采用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（R）。結(jié)果，共確定了18個(gè)共有峰。10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物的HPLC疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖1。

2.3.7 共有峰的指認(rèn) 取“2.3.1（1）”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。通過(guò)比對(duì)該混合對(duì)照品圖譜與對(duì)照指紋圖譜（圖1B）中各成分峰的保留時(shí)間，指認(rèn)出峰1為原兒茶酸、峰2為對(duì)羥基苯甲酸、峰4為對(duì)羥基苯甲醛。混合對(duì)照品的HPLC圖見(jiàn)圖2。

2.3.8 相似度評(píng)價(jià) 將10批三七姜乙酸乙酯提取物的HPLC指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》中進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果，10批樣品的色譜圖與對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.944～0.997，均大于0.900，說(shuō)明各批樣品化學(xué)成分的一致性較好。10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4 三七姜乙酸乙酯提取物抗炎、鎮(zhèn)痛的譜-效關(guān)系

2.4.1 基于Pearson相關(guān)系數(shù)的譜-效關(guān)系分析 將10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物的18個(gè)共有峰的峰面積與小鼠耳腫脹度（記為β1）、15 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)（記為β2）分別導(dǎo)入SPSS 23.0軟件中，以10批樣品的18個(gè)共有峰峰面積為自變量、藥效指標(biāo)（β1、β2）為因變量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析[8]。結(jié)果顯示，峰10、18與β1呈顯著負(fù)相關(guān)（r分別為-0.853、-0.738，P分別為0.002、0.015），且峰10、18同時(shí)與β2呈顯著負(fù)相關(guān)（r分別為-0.821、-0.809，P分別為0.004、0.005）。以上結(jié)果提示，峰10、18與三七姜乙酸乙酯提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛作用具有顯著相關(guān)性。18個(gè)共有峰與β1、β2的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果分別見(jiàn)表5、表6。

2.4.2 基于灰色關(guān)聯(lián)度的譜-效關(guān)系分析 由于10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物的共有峰峰面積與小鼠藥效指標(biāo)（鎮(zhèn)痛率、耳腫脹抑制率）的量綱不一致，不便于比較，因此在進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析時(shí)，需先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理[9-10]。本研究以10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物的共有峰峰面積為子序列、小鼠藥效指標(biāo)為母序列，采用初值化變換法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理[9-10]。

將無(wú)量綱化處理后的子序列和母序列數(shù)值代入灰色關(guān)聯(lián)度公式：Δi（k）=│λ0（k）-λi（k）│。式中，λi（k）表示不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物的共有峰峰面積，i表示各共有峰的峰號(hào)（1～18），k表示樣品編號(hào);λ0（k）表示不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛指標(biāo)，k表示各產(chǎn)地樣品提取物抗炎、鎮(zhèn)痛指標(biāo)的編號(hào)（1～10）。求出兩個(gè)藥效指標(biāo)絕對(duì)差的最大值和最小值，分別記為Δmax、Δmin。結(jié)果，Δ耳腫脹抑制率max=1.743 6、Δ耳腫脹抑制率min=0.005 3，Δ鎮(zhèn)痛率max=1.783 7、Δ鎮(zhèn)痛率min=0.005 2。將上述最大值和最小值代入灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算公式[9]，計(jì)算18個(gè)共有峰與抗炎、鎮(zhèn)痛藥效指標(biāo)的關(guān)聯(lián)系數(shù)。式中，ρ為分辨系數(shù)，在0～1內(nèi)取值，取值越小，表示關(guān)聯(lián)度系數(shù)差異越大[11-12]。當(dāng)ρ取0.6時(shí)[13]，得到10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物指紋圖譜中18個(gè)共有峰與抗炎、鎮(zhèn)痛藥效指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)。利用所得的關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算關(guān)聯(lián)度（關(guān)聯(lián)度實(shí)質(zhì)上是序列幾何關(guān)系的比較，是母序列與子序列各個(gè)時(shí)刻的關(guān)聯(lián)系數(shù)的平均值[14]），并對(duì)其進(jìn)行排序組成關(guān)聯(lián)序，結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7可知，10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物的18個(gè)共有峰與二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制率以及與乙酸致小鼠扭體的鎮(zhèn)痛率的關(guān)聯(lián)度均在0.65以上，各成分對(duì)抗炎作用貢獻(xiàn)的大小順序依次為峰14>峰1>峰17>峰9>峰4>峰2>峰16>峰7>峰6>峰5>峰11>峰12>峰13>峰3>峰8>峰15>峰18>峰10，各成分對(duì)鎮(zhèn)痛作用貢獻(xiàn)的大小順序依次為峰1>峰17>峰14>峰9>峰16>峰2>峰4>峰7>峰6>峰5>峰18>峰15>峰3>峰11>峰12>峰13>峰10>峰8。同時(shí)，峰14、1（原兒茶酸）、17、9、4（對(duì)羥基苯甲醛）、2（對(duì)羥基苯甲酸）、16、7、6與三七姜乙酸乙酯提取物抗炎藥效的關(guān)聯(lián)度相對(duì)較高（關(guān)聯(lián)度均高于0.7），峰1（原兒茶酸）、17、14、9、16、2（對(duì)羥基苯甲酸）、4（對(duì)羥基苯甲醛）與三七姜乙酸乙酯提取物鎮(zhèn)痛藥效的關(guān)聯(lián)度相對(duì)較高（關(guān)聯(lián)度均高于0.7）。該結(jié)果表明，這些關(guān)聯(lián)度較高的峰（其中包括已知成分原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛等）可能是三七姜乙酸乙酯提取物發(fā)揮藥效的主要成分。

3 討論

3.1 色譜條件的篩選

本課題組前期考察了多種色譜柱（COSMOSIL 5C18-PAQ、Hypersil ODS2和Phenomennex Kinetex XB C18等）的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色譜柱Phenomenex Kinetex XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）對(duì)各成分的分離效果明顯優(yōu)于其他色譜柱。此外，本課題組前期還考察了不同檢測(cè)波長(zhǎng)（220、260、280、300、320 nm）、不同流動(dòng)相（甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%冰乙酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液）、不同流速（0.8、1、1.2 mL/min）對(duì)各成分的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm、流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液、流速為0.8 mL/min時(shí)，各色譜峰的分離效果和峰形均最好，且基線較平穩(wěn)、各峰保留時(shí)間適當(dāng)，故最終確定了“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件。

3.2 三七姜乙酸乙酯提取物抗炎、鎮(zhèn)痛的譜-效關(guān)系分析

本研究主要是想探討三七姜外用的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，因此選擇了外敷藥物復(fù)方醋酸地塞米松軟膏和雙氯芬酸二乙胺乳膠劑作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。其中，復(fù)方醋酸地塞米松軟膏為糖皮質(zhì)激素外用制劑，臨床上常用于炎癥性疾病的治療，且效果顯著[15];雙氯芬酸二乙胺乳膠劑為前列腺素合成抑制劑，其不僅能抑制前列腺素的合成，具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，還能提高痛閾值，從而減輕疼痛及腫脹，最終達(dá)到治療效果[16]。

本研究采用HPLC法對(duì)10批不同產(chǎn)地三七姜乙酸乙酯提取物進(jìn)行了指紋圖譜分析，共標(biāo)定出了18個(gè)共有峰，并指認(rèn)出了其中3個(gè)特征峰。接著，本研究分別采用Pearson相關(guān)系數(shù)法和灰色關(guān)聯(lián)分析法對(duì)這18個(gè)共有色譜峰與三七姜乙酸乙酯提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行了相關(guān)性分析。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明，與三七姜乙酸乙酯提取物抗炎、鎮(zhèn)痛作用具有顯著相關(guān)的是峰10、18;基于灰色關(guān)聯(lián)度分析表明，對(duì)三七姜乙酸乙酯提取物抗炎作用貢獻(xiàn)較大的是峰14、1（原兒茶酸）、17、9、4（對(duì)羥基苯甲醛）、2（對(duì)羥基苯甲酸）、16、7、6，對(duì)其鎮(zhèn)痛作用貢獻(xiàn)較大的是峰1（原兒茶酸）、17、14、9、16、2（對(duì)羥基苯甲酸）、4（對(duì)羥基苯甲醛）。以上各特征峰與三七姜乙酸乙酯提取物對(duì)應(yīng)藥效的關(guān)聯(lián)度雖存在差異，但關(guān)聯(lián)度均高于0.7，可能為三七姜乙酸乙酯提取物發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛效果的主要活性成分[17]。

在上述關(guān)聯(lián)度較高的色譜峰中，筆者指認(rèn)出了原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛這3種成分。占龍等[18]通過(guò)研究原兒茶酸在體外對(duì)白細(xì)胞介素1β誘導(dǎo)炎癥軟骨細(xì)胞的生物學(xué)影響，證實(shí)了其能促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)以及下調(diào)炎癥相關(guān)基因MMP-13的表達(dá)。姜鴻等[19]在火絨草抗急性炎癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，該藥發(fā)揮抗急性炎癥的作用與其所含成分原兒茶酸有關(guān)。 Dikmen等[20]研究發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸通過(guò)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)來(lái)抑制疼痛反應(yīng)。Arslan等[21]通過(guò)小鼠熱板實(shí)驗(yàn)（脊柱上綜合反應(yīng)）和尾巴浸入實(shí)驗(yàn)（脊髓反射）發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸具有鎮(zhèn)痛作用。和蕾等[22]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)羥基苯甲酸具有抗炎活性。劉珊珊等[23]研究表明，天麻中的對(duì)羥基苯甲醛具有抗炎作用?？梢?jiàn)，原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛可能為三七姜藥材抗炎、鎮(zhèn)痛的活性成分之一。

綜上所述，三七姜乙酸乙酯提取物具有一定的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。其中，峰1（原兒茶酸）、2（對(duì)羥基苯甲酸）、4（對(duì)羥基苯甲醛）、14、17、10、18等可能是其抗炎、鎮(zhèn)痛作用的主要活性成分。但本研究?jī)H指認(rèn)出了部分對(duì)抗炎、鎮(zhèn)痛作用貢獻(xiàn)較大的化學(xué)成分，對(duì)其他關(guān)聯(lián)度較高的有效成分仍需結(jié)合超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行深入的挖掘與鑒定。

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（收稿日期：2021-01-22 修回日期：2021-03-28）

（編輯：林 靜）