α-硫辛酸對胰島素抵抗HepG2細胞糖代謝紊亂的改善作用

安仙蓉 管俊歡 楊秀麗 吳先進 梁冰

中圖分類號 R965;Q493.4 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）14-1703-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.07

摘 要 目的：研究α-硫辛酸對胰島素抵抗HepG2細胞糖代謝紊亂的改善作用。方法：采用MTT法測定25～1 000 ?mol/L α-硫辛酸對人肝癌細胞HepG2存活率的影響，以確定α-硫辛酸給藥濃度。實驗設陰性對照組、胰島素抵抗組（1×10-7 mol/L胰島素）、聯合抵抗組（30 ?mol/L 亞砷酸鈉+1×10-8 mol/L胰島素）和α-硫辛酸低、中、高濃度組。按分組加入α-硫辛酸作用HepG2細胞12 h后，再分別給予相應濃度的亞砷酸鈉或/和胰島素繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用葡萄糖氧化酶法檢測細胞葡萄消耗量，比色法檢測細胞己糖激酶、丙酮酸激酶活性，蒽酮法檢測細胞糖原含量，Western blot法檢測細胞中葡萄糖轉運體4（GLUT4）、磷酸化糖原合成激酶3β（p-GSK3β）、GSK3β蛋白表達水平和磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值。結果：25、50、100 ?mol/L的α-硫辛酸對細胞存活率無明顯影響（P>0.05），且細胞存活率均大于96%，故將其作為后續(xù)研究的低、中、高濃度。與陰性對照組比較，胰島素抵抗組、聯合抵抗組細胞葡萄糖消耗量、己糖激酶和丙酮酸激酶活性、糖原含量、GLUT4和p-GSK3β蛋白表達水平、p-Akt/Akt和p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低，GSK3β蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。與聯合抵抗組比較，α-硫辛酸各濃度組細胞葡萄糖消耗量（α-硫辛酸低濃度組除外）、己糖激酶（α-硫辛酸低、中濃度組除外）和丙酮酸激酶（α-硫辛酸低、中濃度組除外）活性、糖原含量、GLUT4（α-硫辛酸低濃度組除外）、p-GSK3β蛋白表達水平和p-Akt/Akt（α-硫辛酸低、中濃度組除外）、p-GSK3β/GSK3β（α-硫辛酸低濃度組除外）比值均顯著升高，GSK3β（α-硫辛酸低、中濃度組除外）蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），且α-硫辛酸高濃度組細胞糖原含量、GLUT4蛋白表達水平、p-GSK3β/GSK3β比值和α-硫辛酸中、高濃度組細胞p-GSK3β蛋白表達水平的改善效果更明顯（P<0.05）。結論：α-硫辛酸對胰島素抵抗HepG2細胞的糖代謝紊亂具有一定的改善作用，其機制可能與增加葡萄糖消耗，增強糖代謝相關酶活性，提高糖原含量，上調Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平和GLUT4、p-GSK3β蛋白的表達水平，下調GSK3β蛋白的表達水平有關。

關鍵詞 α-硫辛酸;人肝癌細胞HepG2;亞砷酸鈉;胰島素抵抗;糖代謝紊亂;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B

Improvement Effects of α-lipoic Acid on Glucose Metabolism Disorder of Insulin Resistant HepG2 Cells

AN Xianrong1，GUAN Junhuan1，YANG Xiuli1，WU Xianjin1，LIANG Bing1，2（1. Dept. of Pharmacology， School of Basic Medical Sciences， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， China; 2. Key Laboratory of Environmental Pollution and Disease Monitoring， Ministry of Education， Guiyang 550025， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of α-lipoic acid on glucose metabolism disorder of insulin resistant HepG2 cells. METHODS： The effects of 25-1 000 ?mol/L α-lipoic acid on survival rate of human hepatoma cell HepG2 were determined by MTT assay so as to determine the concentration of α-lipoic acid. Negative control group， insulin resistance group （1×10-7 mol/L insulin）， combination resistance group （30 ?mol/L sodium arsenite+1×10-8 mol/L insulin）， α-lipoic acid low- concentration， medium-concentration and high-concentration groups were set up. HepG2 cells were treated with α-lipoic acid for 12 h and then cultured with corresponding concentration of sodium arsenite or/and insulin for 24 h. The glucose oxidase method was used to detect the glucose consumption， colorimetric method was used to detect hexokinase activity and pyruvate kinase activity， and anthrone method was used to detect glycogen content. Western blot assay was used to detect the protein expression of GLUT4， p-GSK3β and GSK3β as well as the ratio of p-Akt/Akt and p-GSK3β/GSK3β. RESULTS： 25， 50， 100 ?mol/L α-lipoic acid had no significant effect on the survival rates of HepG2 cells （P>0.05）， and survival rates of HepG2 cells were higher than 96%， so they were used as the low， medium and high concentration for follow-up study. Compared with negative control group， glucose consumption， the activities of hexokinase and pyruvate kinase， glycogen content， protein expression of GLUT4 and p-GSK3β， the ratio of p-Akt/Akt and p-GSK3β/GSK3β were decreased significantly in insulin resistance group and combined resistance group， while the protein expression of GSK3β was increased significantly （P<0.05）. Compared with combination resistance group， the glucose consumption （except for α-lipoic acid low- concentration group）， the activities of hexokinase （except for α-lipoic acid low-concentration and medium-concentration groups） and pyruvate kinase （except for α-lipoic acid low-concentration and medium-concentration groups）， glycogen contents， protein expression of GLUT4 （except for α-lipoic acid low-concentration group） and p-GSK3β， the ratio of p-Akt/Akt （except for α-lipoic acid low-concentration and medium-concentration groups） and p-GSK3β/GSK3β （except for α-lipoic acid low-concentration groups） were increased significantly in α-lipoic acid groups， while protein expression of GSK3β （except for α-lipoic acid low-concentration and medium-concentration groups） was decreased significantly （P<0.05）; glycogen content， protein expression of GLUT4 and the ratio of p-GSK3β/GSK3β in α-lipoic acid high-concentration group as well as the protein expression of p-GSK3β in α-lipoic acid medium-concentration and high-concentration groups were improved significantly（P<0.05）. CONCLUSIONS： α-lipoic acid can improve the disorder of glucose metabolism in insulin resistant HepG2 cells， the mechanism of which may be associated with the increase of glucose consumption， the activities of glucose metabolism related enzymes and? glycogen content， and expression up-regulation of the phosphorylation levels of Akt and GSK3β protein， the expression of GLUT4 and p-GSK3β proteins， down-regulation of the expression of GSK3β protein.

KEYWORDS? ?α-lipoic acid; Human hepatoma cell HepG2; Sodium arsenite; Insulin resistance; Glucose metabolism disorder; PI3K/Akt

砷是廣泛分布于自然界的非金屬元素，具有較強的毒性，長期飲用含砷量較高的水會引起慢性砷中毒[1]。已有流行病學調查結果顯示，環(huán)境砷暴露與糖尿病患病率或發(fā)病率增加有關，且砷暴露條件下的糖尿病特征與2型糖尿病相似[2-5]。因此，砷與糖尿病的關系成為砷中毒研究領域的熱點問題之一。

α-硫辛酸是一種兼具水溶性和脂溶性的代謝抗氧化物，臨床研究發(fā)現，該成分可促進體內葡萄糖的吸收，具有調節(jié)血糖平衡的作用[6]。此外，α-硫辛酸還能改善糖尿病周圍神經病變引起的臨床癥狀（如肢體麻木、燒灼感、刀割樣痛、針刺樣痛癥狀）[7-8]。不僅如此，α-硫辛酸還可解除重金屬對巰基酶的毒性作用，促進大鼠體內重金屬的外排，減少重金屬在其體內的蓄積[9]。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的重要原因[10]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路是胰島素信號轉導的重要通路之一，其可通過調節(jié)下游葡萄糖轉運體4（GLUT4）、糖原合成激酶3β（GSK3β）蛋白的表達來參與細胞的糖代謝過程，該通路的傳遞受阻與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關[11]。本課題組前期研究發(fā)現，一定濃度的亞砷酸鈉與1×10-8 mol/L胰島素聯合可致人肝癌細胞HepG2產生胰島素抵抗，提示砷可能具有加速或促進胰島素抵抗形成的作用?；诖耍狙芯恳驭?硫辛酸為受試藥物，基于PI3K/Akt信號通路探討該成分對亞砷酸鈉聯合胰島素所致胰島素抵抗HepG2細胞糖代謝紊亂的改善作用，旨在為砷暴露下糖尿病治療藥物的研發(fā)提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括2001HY-6003型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）、SW-CJ-2D型超凈工作臺（浙江蘇凈凈化設備有限公司）、IX71型倒置顯微鏡（日本Hitachi公司）、Elx800 UV型酶標儀（美國BioTek公司）、722SP型可見分光光度計（上海棱光技術有限公司）、Universal HoodⅡ型凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）、WD-9405D型水平搖床和DYCZ-24DN型電泳儀（北京市六一儀器廠）、Allegray 64R Centrifuge型臺式高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

亞砷酸鈉對照品（批號H4525，純度97%）購自山東西亞化學工業(yè)有限公司;胰島素對照品（批號J1001A，純度96.8%）購自大連美侖生物技術有限公司;α-硫辛酸對照品（批號1077287，純度>99%）購自美國Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基（批號8121089）購自美國Gibco公司;1%青霉素-鏈霉素雙抗（批號J190005）購自美國HyClone公司;胎牛血清（批號19070506）購自浙江天杭生物科技股份有限公司;葡萄糖測定試劑盒（批號20200902137）購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;二甲基亞砜（DMSO）、MTT、糖原含量試劑盒、己糖激酶試劑盒、丙酮酸激酶試劑盒、RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）制備試劑盒（批號分別為12130234、1117X054、20200903、20201211、20201112、20200916、20201030、20201116）均購自北京索萊寶科技有限公司;兔抗磷酸化Akt（p-Akt，Ser473位點）、Akt單克隆抗體（批號分別為P31749、4691S）均購自美國CST公司;兔抗GLUT4、磷酸化GSK3β（p-GSK3β，Ser9位點）、GSK3β、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號分別為NQ30、10016184、00083124、00047696、116154）均購自武漢三鷹生物技術有限公司;快速封閉液、化學發(fā)光試劑盒（批號分別為P0252、123119200731）均購自上海碧云天生物科技有限公司;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

人肝癌細胞HepG2購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

HepG2細胞復蘇后，接種在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。

2.2 α-硫辛酸的細胞毒性檢測

采用MTT法進行檢測。取對數生長期HepG2細胞，以6×103個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h;棄去培養(yǎng)基，加入α-硫辛酸終濃度分別為25、50、100、200、500、1 000 ?mol/L的普通培養(yǎng)基（無血清，下同）200 ?L，記為α-硫辛酸組;另設不含藥物的陰性對照組和不含細胞、不含藥物的調零組，每組設3個復孔。培養(yǎng)12 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT試劑20 ?L，培養(yǎng)4 h后，棄去板中液體，加入DMSO 150 ?L，避光振蕩10 min，使用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，并計算各組的細胞存活率：細胞存活率（%）=（OD實驗組-OD調零組）/（OD陰性對照組-OD調零組）×100%。實驗重復3次。

2.3 分組與給藥

以HepG2細胞為研究對象，建立胰島素抵抗模型。實驗設陰性對照組（只有細胞、不含藥物）、胰島素抵抗組（1×10-7 mol/L胰島素，濃度參考文獻[12]和前期研究結果設置）、聯合抵抗組（30 ?mol/L亞砷酸鈉+1×10-8 mol/L胰島素，濃度參考前期研究結果設置）和α-硫辛酸低、中、高濃度組（25、50、100 ?mol/L，濃度參考α-硫辛酸細胞毒性實驗結果設置）。將對數生長期HepG2細胞適量，按照各實驗所需的密度接種于96孔板、6孔板或者細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h;棄去培養(yǎng)基，α-硫辛酸各濃度組加入相應濃度的含藥普通培養(yǎng)基，其他組加入等體積的普通培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h;棄去培養(yǎng)基，聯合抵抗組和α-硫辛酸各濃度組加入含有30 ?mol/L 亞砷酸鈉和1×10-8 mol/L 胰島素的普通培養(yǎng)基，胰島素抵抗組加入含有1×10-7 mol/L胰島素的普通培養(yǎng)基，陰性對照組加入等體積的普通培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)檢測。

2.4 細胞葡萄糖消耗量和細胞毒性檢測

采用葡萄糖氧化酶法和MTT法分別進行檢測。取對數生長期HepG2細胞，以6×103個/孔接種于96孔板中，按照“2.3”項下方法分組、給藥、培養(yǎng)，另增設不含藥物、不含細胞的空白對照組和1×10-8 mol/L胰島素組，每組設3個復孔。每孔取培養(yǎng)基上清液2 ?L與葡萄糖測定試劑盒中反應試劑進行反應，嚴格按試劑盒說明書進行操作。反應完成后，使用酶標儀在505 nm波長處檢測各孔的OD值，并計算各組細胞葡萄糖消耗量：葡萄糖含量（mmol/L）=（各組OD值/校準液OD值）×校準液濃度，葡萄糖消耗量（mmol/L）=空白對照組細胞上清液中葡萄糖含量-各實驗組細胞上清液中葡萄糖含量。葡萄糖消耗量檢測結束后，再按“2.2”項下MTT法進行檢測并計算每組細胞存活率。實驗重復3次。

2.5 細胞己糖激酶、丙酮酸激酶活性檢測

采用比色法進行檢測。取對數生長期HepG2細胞，以5×106個/瓶接種于細胞培養(yǎng)瓶中，按照“2.3”項下方法分組、給藥、培養(yǎng)，每組設3個培養(yǎng)瓶。每組分別收集500萬細胞，加入己糖激酶、丙酮酸激酶提取液各1 mL，裂解細胞后，于4 ℃下以8 000×g離心10 min，取上清液30 ?L，與己糖激酶、丙酮酸激酶試劑盒中的反應試劑進行反應，嚴格按相應試劑盒說明書進行操作。在上清液與己糖激酶反應試劑反應20 s、5 min 20 s時利用可見分光光度計在340 nm波長處檢測各組的吸光度（A20 s、A5 min 20 s）值，并計算各組細胞的己糖激酶活性：己糖激酶（U/104 cell）=2.226×（A5 min 20 s-A20 s）;在上清液與丙酮酸激酶反應試劑反應20 s、2 min 20 s時利用可見分光光度計在340 nm波長處檢測各組的A20 s、A2 min 20 s值，并計算各組細胞的丙酮酸激酶活性：丙酮酸激酶（U/104 cell）=5.226×（A20 s-A2 min 20 s）。實驗重復3次。

2.6 細胞糖原含量檢測

采用蒽酮法進行檢測。取對數生長期HepG2細胞，以5×106個/瓶接種于細胞培養(yǎng)瓶中，按照“2.3”項下方法分組、給藥、培養(yǎng)，每組設3個培養(yǎng)瓶。每組分別收集500萬細胞，加入糖原提取液750 ?L，裂解細胞后，于25 ℃下以8 000×g離心10 min，取上清液，備用。同時，增設空白組（水）、標準組（0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液）。每組取上清液60 ?L，與糖原含量試劑盒中的反應試劑進行反應，嚴格按試劑盒說明書進行操作。反應完成后，使用酶標儀在620 nm波長處檢測各組的A值，并計算各組細胞的糖原含量：糖原含量（?g/104 cell）=0.450×（A實驗組-A空白組）/（A標準組-A空白組）/細胞數量×1 000。實驗重復3次。

2.7 細胞中p-Akt、Akt、GLUT4、p-GSK3β、GSK3β蛋白表達水平檢測

采用Western blot法進行檢測。取對數生長期HepG2細胞，以6×105個/孔接種于6孔板中，按照“2.3”項下方法分組、給藥、培養(yǎng)，每組設3個復孔。每組棄去上清液，裂解細胞后，于4 ℃下以15 294×g離心10 min，取上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各組細胞的蛋白濃度。蛋白于100 ℃煮沸變性5 min。取變性蛋白樣品進行SDS-PAGE分離，轉膜，經快速封閉液室溫封閉30 min后，加入p-Akt、Akt、GLUT4、p-GSK3β、GSK3β單克隆抗體（稀釋比例均為1 ∶ 1 000）和GAPDH單克隆抗體（稀釋比例為1 ∶ 5 000），于4 ℃孵育過夜;用TBST溶液洗膜10 min×3次，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 5 000），室溫孵育1.5 h;用TBST溶液洗膜10 min×3次，經化學發(fā)光液顯色后，使用凝膠成像分析儀曝光成像。采用Image Lab 5.2.1軟件對目的條帶進行灰度值分析，計算目標蛋白的表達水平和磷酸化水平：目的蛋白的表達水平=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值，目的蛋白的磷酸化水平=磷酸化目的蛋白灰度值/總目的蛋白灰度值。實驗重復3次。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析。數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢測。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 α-硫辛酸對HepG2細胞存活率的影響

與陰性對照組比較，α-硫辛酸25、50、100 ?mol/L組細胞的存活率均無顯著變化（P>0.05），而α-硫辛酸500、1 000 ?mol/L組細胞的存活率均顯著降低（P<0.05），詳見表1。因此，后續(xù)實驗選擇25、50、100 ?mol/L作為α-硫辛酸的低、中、高濃度。

3.2 α-硫辛酸對HepG2細胞葡萄糖消耗量和存活率的影響

與陰性對照組比較，胰島素抵抗組、聯合抵抗組細胞的葡萄糖消耗量均顯著降低（P<0.05），而其余各組細胞的存活率均無顯著變化（P>0.05）。與聯合抵抗組比較，α-硫辛酸中、高濃度組細胞的葡萄糖消耗量均顯著升高（P<0.05），但兩者組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表2。

3.3 α-硫辛酸對HepG2細胞己糖激酶、丙酮酸激酶活性的影響

與陰性對照組比較，胰島素抵抗組、聯合抵抗組細胞的己糖激酶、丙酮酸激酶活性均顯著降低（P<0.05）。與聯合抵抗組比較，α-硫辛酸高濃度組細胞的己糖激酶、丙酮酸激酶活性均顯著升高（P<0.05），詳見表3。

3.4 α-硫辛酸對HepG2細胞糖原含量的影響

與陰性對照組比較，胰島素抵抗組、聯合抵抗組細胞的糖原含量均顯著降低（P<0.05）。與聯合抵抗組比較，α-硫辛酸低、中、高濃度組細胞的糖原含量均顯著升高（P<0.05）。與α-硫辛酸低、中濃度組比較，α-硫辛酸高濃度組細胞的糖原含量均顯著升高（P<0.05），詳見表4。

3.5 α-硫辛酸對HepG2細胞中p-Akt、Akt、GLUT4、p-GSK3β、GSK3β蛋白表達水平的影響

與陰性對照組比較，胰島素抵抗組、聯合抵抗組細胞中GLUT4、p-GSK3β蛋白表達水平和p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低，GSK3β蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。與聯合抵抗組比較，α-硫辛酸各濃度組細胞中GLUT4（α-硫辛酸低濃度組除外）、p-GSK3β蛋白表達水平和p-Akt/Akt（α-硫辛酸低、中濃度組除外）、p-GSK3β/GSK3β（α-硫辛酸低濃度組除外）比值均顯著升高，GSK3β（α-硫辛酸低、中濃度組除外）蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）。與α-硫辛酸低濃度組比較，α-硫辛酸中、高濃度組細胞中p-GSK3β蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。與α-硫辛酸中濃度組比較，α-硫辛酸高濃度組細胞中GLUT4蛋白表達水平和p-GSK3β/GSK3β比值均顯著升高（P<0.05），詳見圖1、表5。

4 討論

2型糖尿病主要表現為胰島B細胞分泌胰島素不足或外周組織（例如肝、脂肪、骨骼肌）發(fā)生胰島素抵抗[13]。HepG2細胞是人肝癌細胞，其保留了大部分肝細胞生物學特征和代謝特點，是用于研究胰島素抵抗發(fā)生機制和降糖藥物作用機制的理想模型[14]。

本研究以α-硫辛酸作為受試藥物，探討其對亞砷酸鈉聯合胰島素所致胰島素抵抗HepG2細胞糖代謝紊亂的改善作用。首先，本研究通過MTT法檢測了α-硫辛酸對HepG2細胞的毒性，結果發(fā)現，25、50、100 ?mol/L的α-硫辛酸對HepG2細胞的存活率均無明顯影響，且細胞的存活率均在96%以上，因此選擇25、50、100 ?mol/L作為后續(xù)實驗中α-硫辛酸的低、中、高濃度。

已有研究表明，胰島素抵抗時外周組織對葡萄糖的消耗量減少，造成機體血糖升高[15]。本研究通過測定葡萄糖消耗量發(fā)現，與陰性對照組比較，聯合抵抗組細胞葡萄糖消耗量顯著降低，而α-硫辛酸中、高濃度組細胞葡萄糖消耗量均顯著高于聯合抵抗組，由此說明α-硫辛酸可在一定程度上改善亞砷酸鈉聯合胰島素所致的HepG2細胞胰島素抵抗。

肝是葡萄糖代謝的主要場所之一，其可通過調控糖酵解、糖原合成來維持機體的血糖平衡[16]。己糖激酶是糖酵解途徑中控制葡萄糖代謝速率的首個關鍵酶，丙酮酸激酶是糖酵解過程中催化磷酸烯醇丙酮酸和腺苷二磷酸轉變成丙酮酸和腺苷三磷酸的磷酸基轉移酶，兩者都是糖酵解過程中重要的限速酶[17-18]。當肝細胞內己糖激酶和丙酮酸激酶活性下降時，會導致肝細胞對葡萄糖的利用減少，糖原合成降低，從而引發(fā)肝臟胰島素抵抗[19]。本研究通過檢測糖代謝相關酶活性及糖原含量發(fā)現，與陰性對照組比較，聯合抵抗組細胞的己糖激酶、丙酮酸激酶活性和糖原含量均顯著降低，提示細胞糖代謝發(fā)生了紊亂;而α-硫辛酸高濃度組細胞的己糖激酶、丙酮酸激酶活性和α-硫辛酸各濃度組細胞的糖原含量均顯著高于聯合抵抗組，且高濃度組細胞的糖原含量顯著高于α-硫辛酸低、中濃度組。這說明α-硫辛酸可通過提高糖代謝相關酶活性和糖原含量來改善亞砷酸鈉聯合胰島素所致的HepG2細胞胰島素抵抗。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，Ser473位點的磷酸化是Akt活化的主要標志[20]。當肝細胞受到胰島素刺激時，Akt蛋白磷酸化被激活，激活的Akt參與調控細胞的葡萄糖轉運和糖原合成[21]。GLUT4是糖轉運蛋白之一，p-Akt可使GLUT4發(fā)生易位，讓GLUT4從細胞囊泡中轉移并嵌入至細胞膜上，從而把葡萄糖從細胞外轉移到細胞內[22]。GLUT4是維系機體血糖平衡的關鍵因子，故是抗糖尿病的靶點之一[23]。此外，p-Akt可使GSK3β的Ser9位點發(fā)生磷酸化，抑制GSK3β蛋白表達，激活細胞的糖原合成[24]。GSK3β可通過磷酸化失活來促進糖原合成，進一步增加細胞對葡萄糖的利用率，從而達到降血糖的目的，故近年來GSK3β被作為治療糖尿病的新靶點之一[25]。本研究通過Western blot法檢測糖代謝相關蛋白的表達水平發(fā)現，與陰性對照組比較，聯合抵抗組細胞中GLUT4、p-GSK3β蛋白表達水平和p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低，GSK3β蛋白表達水平顯著升高。這提示亞砷酸鈉聯合胰島素可降低GLUT4蛋白表達，造成葡萄糖轉運的障礙，同時下調GSK3β蛋白磷酸化水平，造成糖原合成的異常，從而降低細胞對葡萄糖的利用率，導致糖代謝紊亂的發(fā)生。與聯合抵抗組比較，α-硫辛酸各濃度組細胞GLUT4（α-硫辛酸低濃度組除外）、p-GSK3β蛋白表達水平和p-Akt/Akt（α-硫辛酸中、低濃度組除外）、p-GSK3β/GSK3β（α-硫辛酸低濃度組除外）比值均顯著升高，GSK3β（α-硫辛酸中、低濃度組除外）蛋白表達水平顯著降低。這提示α-硫辛酸可通過增加GLUT4蛋白表達來改善葡萄糖轉運障礙，同時通過上調GSK3β蛋白磷酸化水平、抑制GSK3β蛋白表達來改善細胞糖原合成的異常，從而增加細胞對葡萄糖的利用率，改善亞砷酸鈉聯合胰島素所致胰島素抵抗HepG2細胞的糖代謝紊亂。

綜上所述，α-硫辛酸對亞砷酸鈉聯合胰島素所致胰島素抵抗HepG2細胞的糖代謝紊亂具有一定的改善作用，其機制可能與增加葡萄糖消耗，增強糖代謝相關酶活性，提高糖原含量，上調Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平和GLUT4、p-GSK3β蛋白的表達水平，下調GSK3β蛋白的表達水平有關。本研究結果為砷暴露下糖尿病治療藥物的研發(fā)提供了實驗基礎，但糖代謝過程還受諸多因素調控，砷對糖代謝的影響有待進一步的深入研究加以證實。

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（收稿日期：2021-03-04 修回日期：2021-06-07）

（編輯：鄒麗娟）