草果酚酸的提取工藝優(yōu)化

沈華 管紅梅 鐘燕 唐藝玲 胥鑫 代敏 蒲忠慧

中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）14-1698-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.06

摘 要 目的：優(yōu)化草果酚酸的提取工藝。方法：以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間為考察因素，原兒茶酚酸和香草酸的總含量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)曲面法優(yōu)化草果酚酸的提取工藝并驗(yàn)證。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，液料比4 ∶ 1（mL/g），提取時(shí)間2.5 h。經(jīng)3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，原兒茶酚酸和香草酸的平均總含量為12.32 mg/g（RSD=0.26%，n=3），與預(yù)測(cè)值（12.63 mg/g）的平均相對(duì)誤差為2.45%。結(jié)論：優(yōu)化所得工藝穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞 草果酚酸;提取工藝優(yōu)化;Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)曲面法;原兒茶酚酸;香草酸

Optimization of the Extraction Technology of Phenolic Acid from Amomum tsaoko

SHEN Hua1，GUAN Hongmei1，ZHONG Yan1，TANG Yiling1，XU Xin1，DAI Min1，2，PU Zhonghui1，2，3（1. School of Laboratory Medicine， Chengdu Medical College， Chengdu 610500， China; 2. Sichuan Engineering Laboratory for Prevention and Control of Veterinary Drug Residues in Animal Derived Food， Chengdu Medical College， Chengdu 610500， China; 3. Sichuan Key Laboratory of Development and Regeneration， Chengdu Medical College， Chengdu 610500， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To optimize the extraction technology of phenolic acid from Amomum tsaoko. METHODS： The extraction technology of phenolic acid from A. tsaoko was optimized by using Box-Behnken design-response surface methodology with ethanol volume fraction， liquid-solid ratio and extraction time as factors， using the total contents of protocatechuic acid and vanillic acid as response value. The optimizd extraction technology was vlidated. RESULTS： The optimal extraction technology was as follows： ethanol volume fraction 65%， liquid-solid ratio 4 ∶ 1 （mL/g）， extraction time 2.5 h. After 3 times of validation tests， average total content of protocatechuic acid and vanillic acid were 12.32 mg/g （RSD=0.26 %， n=3）， average relative error of which with predicted value （12.63 mg/g） was 2.45%. CONCLUSIONS： The optimal technology is stable and feasible.

KEYWORDS? ?Phenolic acid from Amomum tsaoko; Extraction technology optimization; Box-Behnken design-response surface methodology; Protocatecholic acid; Vanillic acid

草果又名草果仁、草果子、老寇，始載于《寶慶本草折衷》[1]，為姜科豆蔻屬多年生草本植物草果Amomum tsaoko Crevost et Lemaire的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)于我國(guó)廣西、云南、四川、貴州等地。2020年版《中國(guó)藥典》（一部）記載，該藥氣香濃，味辛性溫，歸脾經(jīng)和胃經(jīng)，具有燥濕溫中、截瘧除痰的功效，可用于治療寒濕內(nèi)阻、痞滿嘔吐、瘧疾寒熱、瘟疫發(fā)熱等癥[2]。草果作為藥食同源的大宗藥材，亦作為調(diào)味香料被廣泛用于食品行業(yè)[3]。

現(xiàn)代藥理研究表明，草果主要含有揮發(fā)油、黃酮類、酚酸類、甾體類、萜類和二苯庚烷類等成分[4-6]，具有抗菌、抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)和防治疫病等作用[7-10]。但現(xiàn)有草果化學(xué)成分研究主要集中于揮發(fā)油部分[6]，而對(duì)于非揮發(fā)性成分的研究較少，質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)也尚未建立。有研究表明，草果中的草果酚酸類成分具有抗氧化、抗自由基的活性[10-11]，且該類成分中的原兒茶酚酸還具有抑菌、抗炎、抗氧化和保肝作用[12-13]，香草酸具有抑制酪氨酸酶活性、抗氧化應(yīng)激等作用[14-15]。目前，對(duì)草果中原兒茶酚酸、香草酸的研究較少，其含量測(cè)定方法亦未見(jiàn)報(bào)道。為了更全面地評(píng)價(jià)草果的質(zhì)量并充分開(kāi)發(fā)利用草果藥材資源，有必要對(duì)原兒茶酚酸和香草酸進(jìn)行研究，旨在為草果非揮發(fā)性成分的深入研究提供依據(jù)。

Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)曲面法能直觀反映各影響因素之間的交互關(guān)系，快速獲取最優(yōu)工藝各因素的水平，已被廣泛用于中藥提取工藝的優(yōu)化[16-18]。目前，尚未見(jiàn)采用該法優(yōu)化草果酚酸提取工藝的報(bào)道?；诖?，在前期研究的基礎(chǔ)上[19-20]，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定草果提取物中原兒茶酚酸、香草酸的含量;同時(shí)以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間為考察因素，原兒茶酚酸和香草酸的總含量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)曲面法優(yōu)化草果酚酸的提取工藝，旨在為草果的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善及其后續(xù)的系統(tǒng)開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括Agilent Infinity Ⅱ 1260型HPLC系統(tǒng)及配備的G7111A型高壓四元泵帶真空脫氣機(jī)、G7129A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G7114A 1260 VWD型檢測(cè)器、LC-1260型2.4.0.628色譜工作站（美國(guó)Agilent公司），BI-800A型拜杰多功能粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司），ME204型萬(wàn)分之一分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，IKA HB10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海萬(wàn)捷科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

原兒茶酚酸對(duì)照品（批號(hào)DST191102-081，純度≥98%）、香草酸對(duì)照品（批號(hào)DST190706-088，純度≥98%）均購(gòu)自成都德斯特生物技術(shù)有限公司，甲醇（美國(guó)Sigma公司）為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

草果藥材（批號(hào)20190920）購(gòu)自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李羿教授鑒定為姜科豆蔻屬多年生草本植物草果A. tsaoko Crevost et Lemaire的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 草果酚酸的提取

取草果藥材粉碎（過(guò)二號(hào)篩），精密稱取粉末10 g，置于圓底燒瓶中，按一定的液料比（5 ∶ 1，mL/g）加入65%乙醇，加熱回流提取2次，每次1.5～2.5 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮蒸干得浸膏;浸膏加濃氨水充分溶解后濾過(guò)，濾液用濃鹽酸（36%～38%）調(diào)pH至2～3，再用乙酸乙酯萃取2次，每次120 mL，合并兩次乙酸乙酯萃取液，濃縮蒸干，即得草果酚酸粗品（每克粗品相當(dāng)于草果生藥102.60 g）。

2.2 原兒茶酚酸和香草酸的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 以Eclipse Plus C18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）為色譜柱，以甲醇-0.1%磷酸溶液（13 ∶ 87，V/V）為流動(dòng)相;流速為1.0 mL/min;柱溫為40 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為272 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取原兒茶酚酸、香草酸對(duì)照品各適量，分別置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度均為0.8 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。量取上述各單一對(duì)照品溶液適量至同一棕色量瓶中，加甲醇稀釋，搖勻，制得原兒茶酚酸、香草酸質(zhì)量濃度分別為0.096、0.128 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下草果酚酸粗品適量，置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按“2.1”項(xiàng)下方法制備不含草果藥材的陰性樣品，并按“2.2.3”項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，在該色譜條件下，原兒茶酚酸、香草酸的保留時(shí)間分別約為5.1、11.9 min，分離度分別為10.00、2.53，理論板數(shù)分別為1 919、4 636;陰性對(duì)照對(duì)待測(cè)成分的測(cè)定無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1。

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下各單一對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得相應(yīng)質(zhì)量濃度的系列對(duì)照品溶液。取上述系列對(duì)照品溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以各待測(cè)成分的進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，原兒茶酚酸的回歸方程為Y=1 483.3X-81.705（r=0.999 5），香草酸的回歸方程為Y=3 182.3X-84.938（r=0.999 4）。表明，原兒茶酚酸和香草酸檢測(cè)進(jìn)樣量的線性范圍均為0.16～1.60 μg。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下各單一對(duì)照品溶液0.5 mL，用甲醇稀釋40倍，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，原兒茶酚酸、香草酸峰面積的RSD分別為0.43%、0.35%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下草果酚酸粗品適量，共6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中原兒茶酚酸和香草酸的含量。結(jié)果，原兒茶酚酸、香草酸含量的RSD分別為0.92%、0.41%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、24 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，原兒茶酚酸、香草酸峰面積的RSD分別為0.42%、1.42%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的草果酚酸粗品1 g，共9份，分別按已知量的50%、100%、150%加入質(zhì)量濃度均為0.032 mg/mL的原兒茶酚酸、香草酸單一對(duì)照品溶液（按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備），按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.11 樣品含量測(cè)定 精密稱取草果酚酸粗品粉末200 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中原兒茶酚酸、香草酸的含量，每樣品平行操作3次。

2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)曲面法優(yōu)化草果酚酸的提取工藝

2.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理較困難，結(jié)合實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)，故確定提取次數(shù)為2次。而乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間對(duì)原兒茶酚酸、香草酸總含量的影響較明顯，故以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A，%）、液料比（B，mL/g）、提取時(shí)間（C，h）為考察因素，兩種成分的總含量為響應(yīng)值，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果每因素設(shè)3個(gè)水平，共設(shè)計(jì)17次實(shí)驗(yàn)（其中12次為析因?qū)嶒?yàn)，5次為中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)）。草果酚酸提取工藝優(yōu)化的因素與水平見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.2 模型建立與方差分析 采用Design Expert 11.0軟件對(duì)表3中的總含量數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得二次多項(xiàng)回歸方程為Y=8.92+1.80A+0.33B+0.79C+1.37AB+0.075AC-0.88BC-2.76A 2+1.40B 2+0.98C 2。方差分析結(jié)果顯示，本模型的決定系數(shù)（R 2）為0.907 0，表明兩種成分總含量的變化有90.70%來(lái)源于所選的變量;整體模型差異性顯著（P=0.019 1<0.05），表明該模型用于草果酚酸提取工藝的優(yōu)化合理;本模型的失擬項(xiàng)不顯著（P=0.147 9>0.05），誤差導(dǎo)致模型擬合程度不佳的可能性較小，表明本模型可以對(duì)不同條件下的草果酚酸兩種成分總含量進(jìn)行預(yù)測(cè)。各因素影響顯著性的順序?yàn)锳>C>B;因素AB、AC、BC的影響不顯著（P>0.05），因素A 2的影響顯著（P<0.05），而因素B 2、C 2的影響不顯著（P>0.05），詳見(jiàn)表4。

2.3.3 響應(yīng)曲面分析 為分析各影響因素之間的交互作用，快速得到最優(yōu)工藝各因素的具體水平，本研究采用Design Expert 11.0軟件繪制不同變量間交互作用的等高線圖和響應(yīng)曲面圖。結(jié)果，因素A與因素B、因素A與因素C、因素B與因素C的交互作用均不顯著，與方差分析結(jié)果一致，詳見(jiàn)圖2。

2.3.4 最優(yōu)提取工藝的確定及驗(yàn)證 采用Design Expert 11.0軟件得到最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)65.37%，液料比4 ∶ 1（mL/g），提取時(shí)間2.5 h。考慮到實(shí)際操作，最終確定最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，液料比4 ∶ 1（mL/g），提取時(shí)間2.5 h。在此最優(yōu)提取工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，兩種成分的平均總含量為12.32 mg/g（RSD=0.26%，n=3），與預(yù)測(cè)值（12.63 mg/g）的平均相對(duì)誤差為2.45%，詳見(jiàn)表5。

3 討論

本課題組在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，較梯度洗脫，等度洗脫每次運(yùn)行時(shí)的流動(dòng)相比例相同，當(dāng)檢測(cè)多個(gè)樣品時(shí)不需要設(shè)置平衡時(shí)間來(lái)讓系統(tǒng)恢復(fù)到所需的初始流動(dòng)相比例[21]，故在結(jié)合分離效果的基礎(chǔ)上選擇等度洗脫。在此基礎(chǔ)上，本課題組結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[22]，分別對(duì)定量HPLC法的流動(dòng)相組成及比例、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、流速進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在“2.2.1”項(xiàng)的色譜條件下，各成分的分離效果較好，該HPLC法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均符合2020年版《中國(guó)藥典》（四部）要求[23]。含量測(cè)定結(jié)果顯示，草果提取物中原兒茶酚酸含量遠(yuǎn)高于香草酸，前者約是后者的3～5倍，其原因有待進(jìn)一步研究。

植物酚酸常用的提取方法有超臨界流體萃取、微波萃取和傳統(tǒng)溶劑提取等[24]。其中，超臨界流體萃取條件穩(wěn)定，無(wú)溶劑殘留，安全環(huán)保，但提取率較低、設(shè)備成本高;微波萃取提取率雖高，但生產(chǎn)成本相對(duì)較高;而傳統(tǒng)溶劑提取對(duì)設(shè)備要求低，且操作簡(jiǎn)單、提取率穩(wěn)定，已被廣泛用于科研和實(shí)際生產(chǎn)中[25]。同時(shí)，由于酚酸類成分在植物體內(nèi)通常會(huì)與蛋白質(zhì)或多糖形成穩(wěn)定的復(fù)合物，因此有機(jī)溶劑和水的混合體系最適宜于酚酸類成分的提取，故本研究選擇乙醇為提取溶劑[26]。

本研究采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)曲面法優(yōu)化草果酚酸的提取工藝，進(jìn)行多元二次模型擬合，對(duì)各因素響應(yīng)曲面進(jìn)行三維、二維圖譜分析，以直觀反映各因素對(duì)原兒茶酚酸、香草酸含量的影響;同時(shí)，本研究充分考慮乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間之間的交互作用，以充分尋求優(yōu)勢(shì)區(qū)間范圍;最后，結(jié)合實(shí)際操作，最終確定最優(yōu)提取工藝是以4倍量（mL/g）的65%乙醇加熱回流提取2次，每次2.5 h。經(jīng)3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，所得提取物中原兒茶酚酸和香草酸的平均總含量為12.32 mg/g（RSD為0.26%），與預(yù)測(cè)值12.63 mg/g的平均相對(duì)誤差為2.45%，提示該方法穩(wěn)定、可行，模型預(yù)測(cè)性較好。

本研究采用HPLC法同時(shí)測(cè)定了草果酚酸中原兒茶酚酸和香草酸的含量，該方法專屬性好、準(zhǔn)確度高;Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)曲面法優(yōu)化所得的草果酚酸提取工藝穩(wěn)定、可行，可為該藥質(zhì)量控制方法的建立及活性部位的提取分離提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。本課題組后期將進(jìn)一步對(duì)草果酚酸進(jìn)行更深入的研究，探究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，以推動(dòng)草果資源及其制劑的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

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（收稿日期：2021-02-24 修回日期：2021-06-14）

（編輯：陳 宏）