2018～2020年西安地區(qū)兒童食源性腹瀉病病原菌分布特征和耐藥性及鼠傷寒沙門菌聚類分析

王 維，王 林

(1.西安市兒童醫(yī)院檢驗科，西安710003；2.西安市第一醫(yī)院檢驗科，西安710002）

食源性疾病(foodborne diseases)是攝入有病原體的食品后導致的中毒性或感染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告顯示，每年全球兒童食品源性腹瀉病達上億例，約200 萬兒童因不能及時救治而死亡[1-2]。近年來，我國對兒童食品安全高度重視，兒童腹瀉1/3 病例為食源性腹瀉，特別是學齡前兒童發(fā)病率較高[3-4]。致瀉性細菌（沙門菌、志賀菌、弧菌等）是引起兒童胃腸炎最常見的食源性病原菌，其血清型多達千余種，且不同種類致病力存在差異。此類細菌多具有傳染性，食用污染的肉、蛋、奶或接觸感染的患者均可致病，臨床癥狀可表現(xiàn)為腹瀉、腸熱癥(傷寒或副傷寒)、敗血癥等類型。嬰幼兒由于其年齡小、免疫力低、接觸乳制品多、流行病學史模糊等，常易誤診漏診[5,6]。隨著現(xiàn)代社會信息化發(fā)展，我國已建立食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)絡[7]，從不同地區(qū)、不同年份，不同人群來分析食源性腹瀉病原體檢出的差異性。我院作為國家兒童區(qū)域醫(yī)療中心，是首批承擔兒童食源性疾病哨點醫(yī)院監(jiān)測工作單位。本研究通過對門診及住院送檢的食源性病例標本進行細菌培養(yǎng)，分離致病菌以了解兒童食源性腹瀉病流行病學特點、病原菌分布及耐藥情況，為臨床疾病預防和診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2018年8月～2020年8月在西安市兒童醫(yī)院門診及住院以急性腹瀉為主訴，排便次數(shù)≥3 次/ 天，有可疑食品暴露史，被臨床納入食源性疾病范疇的患兒為研究對象。去除重復病例標本，收集臨床病例及患兒異常糞便（黏液便、水樣便、膿血便）1 435 份。

1.2 儀器與試劑 基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀（德國布魯克公司）；藥敏板卡ASTGN13（法國梅里埃生物制品有限公司）；培養(yǎng)基（廣州迪景微生物科技有限公司）；診斷血清（寧波天潤生物藥業(yè)有限公司）；全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK2 Compact（法國梅里埃生物制品有限公司）；細菌培養(yǎng)箱（日本索尼公司）。

1.3 方法

1.3.1 分離培養(yǎng)及細菌鑒定：將食源性糞便培養(yǎng)標本，接種于SS 瓊脂平板、麥康凱平板、弧菌平板、沙門菌增菌液中培養(yǎng) 18～24 h，操作嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行，得到的單個菌落采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀進行鑒定。

1.3.2 血清學試驗及藥敏試驗：分離的沙門菌及志賀菌使用血清凝集試劑(寧波天潤生物藥業(yè)有限公司)對其進行凝集試驗，依據(jù)說明書確定分離菌的血清型別。法國梅里埃 Vitek 2-Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進行藥敏MIC法試驗，藥敏結(jié)果采用 CLSI2019 標準進行判斷，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.3.3 同源性分析：利用MALDI-Biotyper 數(shù)據(jù)庫軟件初步對鼠傷寒沙門菌的同源性進行聚類分析。

1.4 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用 SPSS 20.0 進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兒童食源性腹瀉病病原菌檢出率及沙門菌血清學分布情況 見表1。本研究對臨床診斷為食源性腹瀉病患兒1 435 例糞便標本進行分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)致病菌陽性標本117 份，陽性分離率為8.15%。其中檢出較多的是沙門菌占90.60%（106/117），鼠傷寒沙門菌50.43%（59/117），腸炎沙門菌27.35%（32/117），明顯高于其他致病菌；其他致病菌如嗜水氣單胞菌、志賀菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、副溶血弧菌等檢出率較低。

表1 兒童食源性腹瀉病糞培養(yǎng)病原菌分布及構成比(n=117)

2.2 兒童食源性腹瀉病患兒病原菌檢出年齡分布及季節(jié)性流行情況 食源性腹瀉病患兒致病菌檢出年齡主要集中在3～6 歲學齡前期，檢出率為12.35%（61/494），其次為0～2 歲幼兒期，檢出率為5.92%（29/490），6～12 歲學齡期6.12%（20/327）及13～17 歲青春期5.65%（7/124）檢出率較低，3～6歲學齡前期較其他年齡階段兒童致病菌分離率高，差異有統(tǒng)計學意義(χ2= 17.730，P＜0.05)。致病菌因季節(jié)不同，檢出率差異較大，研究結(jié)果顯示各季節(jié)致病菌檢出率分別為春季8.31%（32/385）、冬季3.92%（6/153）、秋季5.01%（24/479）、夏季13.16%（55/418），夏季食源性腹瀉患兒致病菌檢出率最高，較其他季節(jié)致病菌檢出率差異有統(tǒng)計學意義(χ2= 23.970，P＜0.05)。

2.3 兒童食源性腹瀉標本沙門菌耐藥情況分析見表2。對兒童食源性腹瀉標本分離的106 株沙門菌耐藥情況進行分析，氨芐西林及氨芐西林/舒巴坦耐藥率較高，分別為88.6%和79.2%；沙門菌對三、四代頭孢敏感性較好，耐藥率均小于25.0%；喹諾酮類抗生素中左氧氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥率均小于10.0%，但中介率較高（81.1%和83.0%），該類藥物有敏感率普遍降低的趨勢；磺胺類抗生素耐藥率也較高，復方新諾明耐藥率達38.6%；碳青霉烯類抗生素敏感性較好，僅發(fā)現(xiàn)1 例耐碳青霉烯類抗生素的鼠傷寒沙門菌。

表2 兒童食源性腹瀉標本中106株沙門菌耐藥情況分析（%）

2.4 兒童食源性腹瀉標本中鼠傷寒沙門菌聚類分析見圖1。MALDI-TOF MS 方法對 59 株鼠傷寒沙門菌進行聚類分析，結(jié)果所示，樹枝狀圖分為2 大簇(Ⅰ型32 株，Ⅱ型27 株)，Ⅰ型中有2 個亞小簇出現(xiàn)(Ⅰa 14 株，Ⅰb 13 株)，Ⅱ型有1 個聚集性小簇(Ⅱa 15 株)。說明本地區(qū)的鼠傷寒沙門菌的同源性較低，親緣關系相對分散。

圖1 59 株鼠傷寒沙門菌MALDI-TOF MS 蛋白質(zhì)系統(tǒng)同源性分析圖

3 討論

食源性腹瀉病是通過污染的食品和水源，引起人類感染，已發(fā)展為一個全球性的公共衛(wèi)生問題。我國每年約有4 萬例兒童發(fā)生腹瀉，因其免疫功能低下，發(fā)病后可迅速引發(fā)電解質(zhì)紊亂、脫水、休克，進而造成全身急性感染[8]。了解兒童食源性腹瀉病的流行病學特征、病原菌分布及耐藥情況，可及時實施針對性治療干預措施，避免延誤治療最佳時機。

該研究通過對西安市兒童醫(yī)院2018～2020年門診及住院收治的食源性腹瀉病患兒糞便標本進行分離培養(yǎng)、質(zhì)譜鑒定、血清學分型、藥物敏感性檢測等試驗，以了解西安地區(qū)兒童食源性腹瀉病流行病學特征、病原菌分布及耐藥情況。結(jié)果顯示，沙門菌是引起兒童食源性腹瀉病最常見病原菌，其中鼠傷寒沙門菌及腸炎沙門菌分離率遠高于其他細菌（志賀菌、氣單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、副溶血弧菌），此結(jié)果與國內(nèi)成人食源性腹瀉報道一致[9-10]，沙門菌已成為食源性腹瀉病致病菌的重點監(jiān)控細菌。結(jié)合病例綜合分析兒童食源性標本病原菌檢出情況，結(jié)果顯示3～6 歲學齡前期的兒童，陽性檢出率高達12.35%，較其他年齡段明顯增高（P<0.05），此與其他地區(qū)研究結(jié)果一致[3]，區(qū)別于成人患者外出就餐較為頻繁，感染暴露機會較多，學齡前期（3～6 歲）兒童陽性率高可能與其免疫力低、胃腸道抵抗力弱，良好攝食衛(wèi)生習慣未完全養(yǎng)成且處于幼托階段，初步開始集體生活有關。此外，0～2 歲幼兒期，致病菌檢出率也較高（5.92%），處于本年齡段兒童胃腸道脆弱且處于母乳奶粉交替及母乳輔食交替階段，因此較易出現(xiàn)病原菌感染。發(fā)病季節(jié)差異性統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)夏季較其他季節(jié)病原菌陽性分離率高，差異顯著，與其他報道一致[11]。該研究結(jié)果提示兒童食源性感染與季節(jié)關系密切，夏季（6～8月）氣溫高，有利于腸道致病菌繁殖，同時夏季易食用涼拌食物會增加病原菌感染的機會。

兒童食源性腹瀉標本分離的沙門菌對常用抗生素氨芐西林耐藥率高達89%，因兒童食源性腹瀉標本鼠傷寒沙門菌分離率最高，該結(jié)果與報道的鼠傷寒沙門菌對氨芐西林耐藥率達90%以上結(jié)果一致；沙門菌對三、四代頭孢耐藥率均小于25%，眾所周知，頭孢類抗生素目前仍為兒童沙門菌治療首選，但其耐藥也給臨床醫(yī)生經(jīng)驗治療重癥感染帶來一定的挑戰(zhàn)性[12-13]；環(huán)丙沙星最低抑菌濃度（MIC）試驗是評估沙門菌對氟喹諾酮敏感性的首選藥物，該研究發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星耐藥率均小于10%，但中介率高達81%，說明該類藥物有敏感率普遍降低的趨勢，與成人耐藥情況一致[14-15]；碳青霉烯類抗生素敏感性較好，本研究已檢出1 株耐碳青霉烯類藥物的鼠傷寒沙門菌，應引起臨床高度警惕。MALDI-TOF MS 技術是近幾年發(fā)展起來的一種全新的用于微生物鑒定和分型的方法，具有操作簡便、快速、高通量等特點，且檢測成本低，已越來越多地用于微生物的檢測、分類及耐藥表型的研究。此方法可快速對沙門菌進行種屬水平鑒定[16-18]，且通過聚類分析可以對鑒定菌株進行比較，查看一致性，這對傳染病的監(jiān)測、追蹤及調(diào)查有非常重要的意義。本研究采用MALDI-TOF MS 方法對 59 株鼠傷寒沙門菌進行聚類分析，結(jié)果本院食源性腹瀉標本分離的鼠傷寒沙門菌的同源性較低，親緣關系相對分散，此現(xiàn)象可能與本院作為國家區(qū)域中心醫(yī)院，收治患兒范圍較廣有關。

綜上所述，兒童食源性腹瀉病致病菌以沙門氏菌感染為主，發(fā)病年齡多集中于3～6 歲學齡前期兒童，且以夏季為主要暴發(fā)季節(jié)。對于兒童沙門菌感染抗生素的耐藥趨勢臨床醫(yī)生應高度警惕，鑒于兒童使用的局限性，食源性腹瀉病應以預防為主，同時需加強飲食，注意環(huán)境衛(wèi)生以切斷傳播途徑。兒童食源性腹瀉病監(jiān)測對流行因素、菌群菌型變遷動態(tài)及抗生素耐藥趨勢進行全面掌握，為臨床治療提供了有利證據(jù)。