液體活檢技術(shù)在上尿路上皮癌精準(zhǔn)診治中的最新應(yīng)用研究進展

胥 勁，何 訸，黃亨建

（四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗醫(yī)學(xué)科，成都 610041）

腫瘤的發(fā)生通常由于調(diào)控細(xì)胞生長和增殖的基因不斷變化積累導(dǎo)致[1]。目前實體腫瘤的基因圖譜是通過組織樣本構(gòu)建的。然而基于組織活檢技術(shù)的結(jié)果會受到抽樣誤差和樣本采集難度的影響，只能反映腫瘤異質(zhì)性的特征，檢測結(jié)果往往不能重復(fù)[2-3]。人類體液樣本中的物質(zhì)包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）及RNA，細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物等。由于腫瘤細(xì)胞的快速代謝會導(dǎo)致腫瘤衍生的細(xì)胞、核酸和囊泡不斷釋放到血液循環(huán)中，因此檢測血液及其他體液中腫瘤來源的成分，能幫助臨床醫(yī)生重復(fù)性并且非侵入性地觀察癌癥患者疾病的動態(tài)演變過程，從而方便快捷地達(dá)到個體化診斷和治療的目的，這項技術(shù)稱之為液體活檢技術(shù)（liquid biopsy，LB）[4]。

上尿路上皮癌（upper tract urothelial carcinoma，UTUC）是一種惡性程度較高的腫瘤，發(fā)生于泌尿道尿路上皮，涉及腎盂到輸尿管末端整段，是一類由遺傳因素和環(huán)境因素共同致病的復(fù)雜疾病[5]。UTUC 占所有腎臟腫瘤的5%～7%，年發(fā)病率約為1/10 萬～2/10 萬，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[5-6]。與歐美國家相比，我國UTUC 發(fā)病率更高，約占所有尿道上皮腫瘤的20%～30%，且分級更高、分期更晚[7-8]。傳統(tǒng)UTUC 診斷主要依靠影像學(xué)、輸尿管鏡和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查，其敏感度和特異度有限，容易漏診。大多數(shù)UTUC 患者診斷時已為中晚期，生存率低、生活質(zhì)量差，社會負(fù)擔(dān)重[9]。因此，尋找敏感度高、特異度強的無創(chuàng)或微創(chuàng)便捷的方式，建立快速、簡便的早期診斷技術(shù)已成為UTUC 診治的研究重點。

基于此，本文對液體活檢技術(shù)在上尿路上皮癌精準(zhǔn)診治中的最新應(yīng)用研究進展進行了綜述。提示我們，若能通過無創(chuàng)或微創(chuàng)的方式對UTUC 高危人群進行有效早期診斷，建立高效精準(zhǔn)的早期診斷預(yù)警體系，對改進UTUC 診斷體系，實現(xiàn)早期診斷具有重大的意義，同時還能使治療窗口前移，極大地提高患者生存率及生存質(zhì)量。

1 UTUC 的標(biāo)志物和檢測技術(shù)

UTUC 的具體發(fā)病機制目前尚不明確，外部環(huán)境因素和內(nèi)在遺傳因素都可以影響其發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。遺傳性UTUC 占總體的10%～20%[6]，但導(dǎo)致UTUC 發(fā)生的相關(guān)遺傳因素目前尚不清楚。因此，從遺傳學(xué)角度尋找敏感度高、特異度強的分子標(biāo)志物，建立快速、簡便、無創(chuàng)的精準(zhǔn)診斷技術(shù)可為UTUC 的診治提供新的思路。近年來，隨著腫瘤生物學(xué)研究的深入、分子生物技術(shù)的發(fā)展及測序成本的大幅度降低，該方向的研究取得了一定進展，相關(guān)研究成果也不斷增加。

1.1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）CTCs 是原發(fā)腫瘤在形成和生長過程中釋放進入外周血或淋巴組織，以單個游離形式或聚集成團形式存在于血液淋巴循環(huán)系統(tǒng)，具有一定的靶向轉(zhuǎn)移潛能[10]。目前CTCs 主要用于腫瘤疾病療效監(jiān)測、預(yù)后判斷和復(fù)發(fā)風(fēng)險評估。SOAVE 等[11]對膀胱尿路上皮癌的CTCs 研究發(fā)現(xiàn)，在實施根治性手術(shù)前，CTCs 可以在不同組織類型中檢測到，檢出率具有差異性，并且其前瞻性研究同時證實CTCs 還是不良預(yù)后的獨立預(yù)測因子。ZHANG 等[12]的meta 分析認(rèn)為外周血中存在的CTCs 不僅可以用于疾病確診，還是尿路上皮癌患者不良預(yù)后的獨立預(yù)測指標(biāo)。CTCs 作為一種非侵入性的檢測方法在UTUC 預(yù)后判斷中發(fā)揮的作用具有潛在研究價值。

由于CTCs 在外周血中的含量存在較大差異，目前CTCs 檢測方法的特異度和敏感度較低，其臨床應(yīng)用仍面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[13]。STOTT 等[14]對115例轉(zhuǎn)移性肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌患者外周血中的CTCs 研究發(fā)現(xiàn)，每毫升血液中CTCs 的濃度為5～1 281 個。但總體而言大多數(shù)癌癥患者早期外周血中CTCs 每毫升血中含量僅為1～200 個[15]，因此很難在疾病早期對CTCs 進行定性和定量分析。目前關(guān)于CTCs 檢測技術(shù)的研究主要集中在樣本富集、富集后的分離純化及CTCs 離體培養(yǎng)方法[16]。單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展使得對單個細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、基因組、甲基化組和蛋白質(zhì)組進行分析成為可能[17-18]，讓CTCs 在腫瘤的診斷、治療選擇、藥物篩查和疾病監(jiān)測方面的潛力得到進一步釋放。盡管單細(xì)胞測序技術(shù)得到不斷改進，但仍然存在隨機性強、覆蓋率低、錯誤率高和細(xì)胞間異質(zhì)性等缺點[19]。

1.2 循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）ctDNA 主要是死亡的腫瘤細(xì)胞破裂后所釋放出來的片段化的基因組DNA。ctDNA 中能夠檢測到的遺傳變異信息非常豐富，從簡單的點突變到復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異，甚至到染色體拷貝數(shù)變異都能被檢測到。但是ctDNA 的檢出率高度依賴于腫瘤發(fā)展階段、腫瘤類型及檢測手段，ctDNA 在腫瘤早期或局限性腫瘤中含量較低[20]。目前ctDNA 可以作為癌癥早期診斷、微小殘留病灶監(jiān)測、化療效果評估、克隆性突變檢測及潛在的耐藥性評估的標(biāo)志物[21]。目前公布的ctDNA 檢測數(shù)據(jù)主要集中在發(fā)病率較高的癌種，例如肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等，而針對發(fā)病率偏低的癌癥類型其研究相對較少[22]。在一項針對ctDNA 的基因組圖譜的研究中，對75 例轉(zhuǎn)移性UTUC 的血液樣本通過二代測序評估其cfDNA水平，在71 例患者（95%）中發(fā)現(xiàn)了遺傳改變，包括單核苷酸變異、插入、融合和拷貝數(shù)擴增，其中抑癌基因TP53（51%）、PIK3CA（23%）和 ARID1A（20%）是最常見的3 種基因改變。ctDNA 在不同腫瘤及不同樣本中表達(dá)存在差異，和膀胱癌患者相比，F(xiàn)GFR 和HRAS 變異在UTUC中更常見。而在轉(zhuǎn)移性UTUC 患者中，ctDNA 的TP53 和FGFR3 二代測序結(jié)果和以往腫瘤組織相比，ctDNA 中TP53 和FGFR3 的基因改變分別顯著減少和增加[25]。由于ctDNA 含量占血液中循環(huán)游離DNA（circulating cell-free DNA，cfRNA）的0.1～10%[23]，因此在大量cfDNA 中對ctDNA 進行特異度鑒定是一項艱巨的任務(wù)。和CTCs 相比，在腫瘤形成早期血液中還沒有出現(xiàn)CTCs 時已經(jīng)存在ctDNA[24]。

目前檢測ctDNA 的方法主要分為基于PCR 的各種檢測技術(shù)和高通量測序[26]。通過對大于1 000例患者和850 例健康患者血液中循環(huán)蛋白和ctDNA突變來聯(lián)合檢測八種常見癌癥類型的研究中，聯(lián)合檢測具有69%～95%的敏感度（取決于癌癥類型）和 99%特異度[27]。高靈敏度的PCR 技術(shù)只能用于ctDNA 中特定的少位點突變，高通量測序雖然能解決PCR 的缺點，但同時容易受到非目標(biāo)cfDNA 干擾[28]。

1.3 RNA 血清、尿液或組織中游離的mRNA 作為腫瘤的診斷或治療靶點具有實用、有效、基因突變可高通量篩選等優(yōu)勢。LI 等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，SPP1 mRNA 在UTUC 細(xì)胞和組織中高表達(dá)，SPP1 mRNA 表達(dá)水平增高與晚期、高級別密切相關(guān)。一項對622 例UTUC 患者的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，mRNA結(jié)合蛋白族3（mRNA-binding protein Ⅲ，IMP3）表達(dá)與UTUC 復(fù)發(fā)、癌癥死亡率及全因死亡率獨立相關(guān)[30]。

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括微小RNA（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA（longnon-coding RNA, lncRNA）和假基因、環(huán)形RNA（circular RNA,circRNA）等。ncRNA 作為液體活檢中的生物標(biāo)記物對于泌尿腫瘤患者的診斷和隨訪具有重要的價值[31]。血清中全基因組miRNA 是一類具有高度保守性、時序性和組織特異度的小分子ncRNA。進展性和非進展性UTUC 患者之間存在不同的miRNA 表達(dá)模式，對UTUC 中特異度miRNA 進行分析，具有診斷和預(yù)測UTUC 患者預(yù)后的潛力[32-33]。TAO 等[34]對46 例UTUC 與30 例健康對照血清miRNA 進行分析，發(fā)現(xiàn)10 個具有區(qū)分UTUC 患者與健康對照潛力的miRNA，為miRNA 作為UTUC 診斷的潛在生物標(biāo)志物提供證據(jù)。KE 等[35]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-210 在UTUC 中高表達(dá)，與腫瘤進展相關(guān)。BRENDAN[36]對157 例UTUC 的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 有助于鑒定UTUC 分期并預(yù)測患者生存期和治療效果。雖然尚無文獻(xiàn)報道與UTUC 直接相關(guān)的circRNAs，但研究發(fā)現(xiàn)circRNA 可以miRNA的形式發(fā)揮功能，即circRNA 可以結(jié)合在miRNA上并對抗其抑制mRNA 的功能，這為circRNA 與UTUC 的關(guān)系提供研究思路[37-38]。

1.4 蛋白質(zhì)及代謝產(chǎn)物 蛋白質(zhì)及代謝產(chǎn)物可運用于腫瘤的診斷、治療和預(yù)后等多個方面。UTUC 患者術(shù)前纖維蛋白原水平升高是UTUC 高分期、高分級、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的顯著相關(guān)因素，同時也是預(yù)后不良的獨立危險因素[39]；血清細(xì)胞角蛋白19 片段水平的升高是UTUC 術(shù)后生存率的獨立影響因子，其水平越高，術(shù)后總體生存率也較高[40]；尿液中的P16蛋白在UTUC 中高表達(dá)，Ki-67 常作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，P16 聯(lián)合Ki-67 的雙標(biāo)記可作為預(yù)測高分級UTUC 或癌癥進展的獨立因素[41]。核基質(zhì)蛋白-22（nuclear matrix protein-22，NMP-22）和膀胱腫瘤抗原（bladder tumor antigen，BTA）是膀胱癌尿液檢查中最常用的兩種生物學(xué)標(biāo)志物。盡管UTUC 和膀胱癌基因改變相似，但NMP-22 卻不能用于上尿路移行細(xì)胞癌的診斷[27,42]。JOVANOVIC 等[43]對泌尿系統(tǒng)腫瘤患者尿液樣本研究發(fā)現(xiàn)，BTA 對上尿路腫瘤診斷的總體敏感度和特異度分別為82%和89%，而對UTUC 診斷的敏感度和特異度分別為48%和33%。

1.5 外泌體 外泌體是細(xì)胞內(nèi)多囊泡與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外的約50～150nm 的膜性囊泡，可攜帶蛋白、脂質(zhì)、DNA 和ncRNA 等多種內(nèi)容物，參與免疫應(yīng)答、抗原提呈和細(xì)胞間通訊等生理病理過程[44]。與循環(huán)系統(tǒng)中游離RNAs 相比，由外泌體所攜帶的RNAs 組織特異度及穩(wěn)定性更高[45]。LEE 等[46]納入9 例接受尿路膀胱上皮癌的手術(shù)患者，發(fā)現(xiàn)尿液中的cfDNA 和外泌體DNA 可直接反應(yīng)尿路上皮癌的體細(xì)胞突變和拷貝數(shù)變異。LIN 等[47]連續(xù)招募129 例泌尿系統(tǒng)腫瘤患者和62 例非泌尿系統(tǒng)腫瘤患者，運用MALDI-TOF 質(zhì)譜法進行外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并采用免疫組化的方法在另外122 例泌尿系統(tǒng)腫瘤和26 例非泌尿系統(tǒng)腫瘤進行驗證，最終認(rèn)為α1-抗胰蛋白酶和組蛋白H2B1K 可作為尿路上皮癌的診斷和預(yù)后生物標(biāo)記物。

2 LB 在早期診斷、靶向治療、預(yù)后監(jiān)測UTUC 中的運用前景

2.1 早期診斷 早期診斷UTUC 對提高患者生存時間和生活質(zhì)量具有重要意義。早期UTUC 行根治性切除手術(shù)，患者5年生存率可達(dá)90%；而高分期UTUC 患者伴局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5年生存率通常不足30%，伴發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移5年生存率不足10%[48]。因此以液體活檢技術(shù)（Liquid biopsy，LB）作為診斷工具，對血液、精液、尿液及唾液在內(nèi)多種體液進行監(jiān)測，可為疾病的早期診斷提供有效的信息和證據(jù)。

2.2 靶向治療 當(dāng)前治療非轉(zhuǎn)移性UTUC 的金標(biāo)準(zhǔn)是根治性腎-輸尿管-膀胱壁內(nèi)段切除術(shù)。對于早期或低度惡性 UTUC 患者，行根治手術(shù)可能存在過度治療風(fēng)險[49]。對于根治術(shù)后對側(cè)尿路系統(tǒng)復(fù)發(fā)的病人治療手段更有限，若保留尿路的治療效果欠佳。在綜合治療方面，已有多中心在開展以吉西他濱聯(lián)合順鉑為主的化療，進行UTUC 術(shù)后輔助化療研究，但因為化療藥物本身所具毒性，其療效仍存在爭議[50]。而其余治療方式（如內(nèi)鏡下切除等）療效也不確切，缺乏不同類型患者及疾病亞型的高質(zhì)量證據(jù)[51]。靶向分子標(biāo)志物可調(diào)節(jié)血管再生、信號傳導(dǎo)、免疫系統(tǒng)及細(xì)胞凋亡。目前，臨床上缺乏可用于UTUC 治療的靶點，無法實現(xiàn)個體化醫(yī)療，因此探尋相關(guān)分子標(biāo)志物和深入研究相關(guān)基因的致病機制將為篩選UTUC的精準(zhǔn)治療靶標(biāo)奠定堅實基礎(chǔ)。

2.3 預(yù)后監(jiān)測 由于UTUC 多呈患側(cè)多中心發(fā)展且很少累及對側(cè)的臨床特征，在行單純腎輸尿管切除術(shù)后，周圍殘存尿路上皮易再次復(fù)發(fā)腫瘤。UTUC 患者即便行根治術(shù)后，仍有較大可能出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[6-8,49]。亟需能精確評估患者復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移可能的監(jiān)測手段，以獲得更加實用的治療方案和隨訪策略。如能在尿液或外周血中找到高敏感度、高特異度的分子標(biāo)志物組合，將對UTUC 預(yù)后監(jiān)測意義重大。

3 LB 在UTUC 的局限

盡管目前已發(fā)現(xiàn)一些與UTUC 發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物，由于UTUC 發(fā)生發(fā)展中伴隨著不同基因變異，相關(guān)基因發(fā)揮生物學(xué)功能的過程及調(diào)控是由基因、調(diào)控因子和蛋白質(zhì)等多種生物分子途徑的相互作用形成，且既往研究結(jié)果還受研究設(shè)計、納入排除標(biāo)準(zhǔn)、樣本量大小、患者個體差異（遺傳異質(zhì)性、所處環(huán)境不同）、疾病分級分期不同等因素影響，所發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)志物種類不盡相同，因此評估疾病狀態(tài)可靠性較差，用于診斷時靈敏度和特異度不高，難以應(yīng)用于臨床實踐。鑒于現(xiàn)有UTUC 分子標(biāo)志物研究層面單一、種類稀少、重復(fù)性差，僅依靠單因子的預(yù)測模型無法完全滿足臨床診療需求，必須運用系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)的理論和技術(shù)，將LB 聯(lián)合患者病歷信息，建立多指標(biāo)聯(lián)用的診斷模型，以提高診斷的靈敏度及特異度，對改進UTUC 診斷體系、實現(xiàn)早期診斷、靶向治療、預(yù)后監(jiān)測具有重要的意義。

4 結(jié)語

LB 可應(yīng)用于癌癥診治的所有階段，實現(xiàn)無創(chuàng)便捷監(jiān)測疾病發(fā)展，可為UTUC 的診療提供新的思路。隨著LB 的不斷成熟和發(fā)展，有望對UTUC 患者實施精準(zhǔn)診治，實現(xiàn)真正意義上的個體化治療。