Geno-type MTBDRplus分子線性探針雜交技術(shù)在結(jié)核病診斷與耐藥性檢測中的應用價值

李 津,李昌錦,楊 潔,黃 婷,樊金燕

（聯(lián)勤保障部隊第900 醫(yī)院a.結(jié)核科;b 檢驗科,福州350003）

結(jié)核菌耐藥是結(jié)核病治療過程中面臨的主要問題，其療程長、藥物副反應多且嚴重、患者預后差，已受到越來越多的關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計我國每年新發(fā)結(jié)核病例中，5.7%為多重耐藥結(jié)核患者，其中又有8%為泛耐藥結(jié)核分枝桿菌感染[1]。因而結(jié)核菌耐藥性檢測極為重要。目前臨床上多采用BD 960 液體培養(yǎng)法進行結(jié)核分枝桿菌的鑒定及耐藥性的檢測，該方法敏感度低、耗時較長，往往導致診斷及針對性治療的延誤。隨著結(jié)核菌耐藥機制的不斷進展，Geno-type MTBDRplus 分子線性探針雜交技術(shù)逐步得到重視。這種方法應用生物素標記的引物進行靶序列的擴增，并與固定的寡核苷酸探針雜交，最后通過酶聯(lián)免疫法顯示結(jié)果[2]。該技術(shù)不僅可對結(jié)核分枝桿菌復合群保守序列進行鑒定，還可根據(jù)相關(guān)基因突變對異煙肼和利福平的耐藥表型進行檢測。本研究應用線性探針法對結(jié)核菌樣本進行檢測，并與BD 960 液體培養(yǎng)法的檢測結(jié)果及其藥敏結(jié)果進行比較，對兩種方法的檢測效果進行評價，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2016年1月～2019年12月在本院門診及住院的臨床確診結(jié)核病患者的送檢標本413 例，其中男性315 例（76.27%），女性98 例（23.73%）。年齡8～89 歲。

1.2 儀器與試劑 BACTEC MGIT 960 及相關(guān)試劑（美國BD 公司）；GT-Blot 48 及相關(guān)試劑（德國Hain Lifescience 公司） ；結(jié)核分枝桿菌抗原試劑盒（杭州創(chuàng)新生物公司）；抗酸染色液（珠海貝索公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 BD 960 液體培養(yǎng)法檢測結(jié)核分枝桿菌及異煙肼、利福平耐藥性 :嚴格按儀器使用說明書操作，培養(yǎng)陽性標本經(jīng)抗酸染色鏡檢并用結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒鑒定為結(jié)核分枝桿菌。

1.3.2 線性探針雜交法檢測結(jié)核分枝桿菌及異煙肼、利福平耐藥性:嚴格按儀器使用說明書操作，將PCR 擴增、反向雜交、膜顯色技術(shù)合為一體，通過引物擴增目的片段，擴增產(chǎn)物與膜上固定的特異性探針雜交，雜交物通過酶顯色反應判斷結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，兩種檢驗方式一致性分析采用Kappa 值檢驗。Kappa 值0.0～0.20 代表極低的一致性，0.21～0.40 代表一般的一致性，0.41～0.60 代表中等的一致性，0.61～0.80 代表高度的一致性，0.81～1 代表幾乎完全一致。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法對結(jié)核分枝桿菌檢出率的比較 413例臨床確診病例的樣本，經(jīng)BD960 液體培養(yǎng)法檢測呈陽性為376 例（91.04%），經(jīng)抗酸染色鏡檢及凱必利鑒定均為結(jié)核分枝桿菌。上述樣本經(jīng)雜交酶顯色法檢測呈陽性為358 例（86.68%）。兩種檢測方法的結(jié)果相符349 例，符合率為84.5%（349/413），檢測結(jié)果高度一致。

2.2 兩種方法對異煙肼、利福平藥敏檢測結(jié)果的比較 用BD960 液體培養(yǎng)法和雜交酶顯色法對108株結(jié)核分枝桿菌進行異煙肼、利福平藥敏檢測。兩種檢測方法均測定異煙肼敏感有83 例，符合率為76.85%（83/108），Kappa 值=0.731，兩者具有高度一致性 ；兩種檢測方法均測定利福平敏感者有94例，符合率為87.04%（94/108），Kappa 值=0.793，兩者結(jié)果亦高度一致。

3 討論

據(jù)2020年10月14日，世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布了《2020年全球結(jié)核病報告》中估算，全球結(jié)核病潛伏感染人群接近20 億，2019年全球新發(fā)結(jié)核病患者約996 萬，發(fā)病率為130/10 萬，新發(fā)的結(jié)核病患者中約有3.3%的新患者和18%的復治患者對利福平耐藥。估算利福平耐藥結(jié)核病患者約46.5萬，其中耐多藥結(jié)核病約占78%。因此，結(jié)核菌耐藥株是我國結(jié)核病防治所面臨的主要挑戰(zhàn)，其治療療程長、藥物副反應多且難以耐受、患者預后差，尋找一種快速檢測且同時檢測利福平耐藥的技術(shù)已受到越來越多的關(guān)注。近年來，線性探針法已被WHO推薦用于結(jié)核分枝桿菌耐藥株的快速檢測[3]。

本研究顯示，BD960 液體培養(yǎng)法和雜交酶顯色法檢測結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果高度一致。由于本研究是回顧性觀察分析，部分患者未做藥敏及耐藥檢測，所以藥敏檢測菌株例數(shù)較少。在藥敏檢測結(jié)果上與之前相關(guān)報道略有不同[4-5]，其原因有待于今后進一步分析。但有研究認為，在細菌量級別為“極低”時，存在無法確定是否對利福平耐藥及對利福平耐藥檢測結(jié)果的假陽性例數(shù)明顯偏高[6]。

由于異煙肼和利福平是治療結(jié)核病的一線藥物，其產(chǎn)生耐藥是治療失敗的主要原因之一，而傳統(tǒng)藥敏實驗采用羅氏固體培養(yǎng)基或BD 960 液體培養(yǎng)法檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥耗時長（42 天），嚴重影響臨床對患者的及時診治。與之相比，雜交酶顯色法具有操作快速、且直接檢測臨床標本的優(yōu)點，不必等待結(jié)核菌的培養(yǎng)結(jié)果，從而顯著縮短了檢測周期。另外，雜交酶顯色法與GeneXpert 等快速分子診斷技術(shù)不同，它不僅檢測利福平的耐藥情況，而且同時進行異煙肼的耐藥性檢測，對于臨床快速診斷、并檢測藥物的耐藥情況，進行準確評估、制定、實施有針對性的個體治療提供重要診斷依據(jù)。近來研究表明，PCR 線性雜交酶顯色法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法具有較高的一致性，并可明顯縮短肺外結(jié)核的病原菌耐藥性分析的等待時間[7-8]。另外，有研究者指出，初治患者使用分子生物學快速檢測技術(shù)做出利福平耐藥或耐多藥結(jié)核病的診斷特別注意要進行二次確認，以減少錯誤的診斷和治療[9]。本研究因經(jīng)費原因，所有菌株并未進行測序及耐藥突變基因的檢測進行確認。

研究表明，PCR 線性雜交酶顯色法是一種經(jīng)濟、快捷的結(jié)核病實驗診斷技術(shù)[10]，它與其他檢驗方法聯(lián)合應用可進一步提高結(jié)核病的診斷效率[11-12]。輔以其他促進排痰的方法，檢測陽性率將進一步提高[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，PCR 線性雜交酶顯色法是一種快速、可靠的檢測方法，能在24 h 內(nèi)判斷出是否存在結(jié)核分枝桿菌感染。因此，我們推測，在經(jīng)過BD 960 液體培養(yǎng)法培養(yǎng)后，可以不需要42 天的培養(yǎng)，在培養(yǎng)周期中優(yōu)化選擇出一個比較好的時間節(jié)點培養(yǎng)出數(shù)量級別的桿菌后，再使用PCR 線性雜交酶顯色法，可以清楚直觀地顯示INH 和RIF 的耐藥情況，增加結(jié)果的準確性。