蛋白變性劑對酵母蔗糖酶及其修飾酶的催化活性影響及其作用分子機(jī)制

黎春怡，王丹菊，黃卓烈

1.茂名職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 茂名525000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州510642

蔗糖酶（又稱轉(zhuǎn)化酶，invertase）廣泛存在于真菌、細(xì)菌和植物體中，可將蔗糖水解為葡萄糖和果糖。蔗糖酶對生物體的糖類代謝和生長發(fā)育都具有重要的意義，直接參與植物的生長、器官建成、糖分運(yùn)輸?shù)龋?］，并間接參與細(xì)胞分化和植物發(fā)育的調(diào)控［2］。蔗糖酶屬于糖苷水解酶GH32家族［3］，在酵母細(xì)胞中以高度糖基化的胞外蔗糖酶和低糖基化（＜3%）的胞內(nèi)蔗糖酶兩種形式存在［4］。食品工業(yè)上，蔗糖酶主要用于由蔗糖生產(chǎn)糖漿和人造蜂蜜，也可用來作杏仁糖果和桃仁糖果的軟化劑，還用以分解蜂蜜中的蔗糖作為工業(yè)酒精生產(chǎn)的碳源［5］。在工業(yè)上具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。

酶是在生物細(xì)胞內(nèi)合成的，大多數(shù)是在細(xì)胞內(nèi)使用。而當(dāng)將這些酶提取出來用于工業(yè)或醫(yī)學(xué)時，一般酶的活性都很低，酶學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定。若對酶進(jìn)行化學(xué)修飾可以改善和提高酶在工業(yè)應(yīng)用過程中的一些不良性質(zhì)，提高酶的穩(wěn)定性和抵抗蛋白質(zhì)變性劑的能力，并賦予某些優(yōu)良性質(zhì)。這就可拓寬酶的工業(yè)應(yīng)用范圍。目前發(fā)現(xiàn)，殼寡糖（chitooligosaccharides，COS）是一種優(yōu)良的修飾劑。

殼寡糖是殼聚糖部分降解產(chǎn)物，是由乙酰氨基葡萄糖或氨基葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵連接起來的水溶性低聚糖。小分子量（MW1×103～1×105）的COS與高聚殼聚糖相比，其晶體結(jié)構(gòu)的緊密性顯著降低，溶解性大大增強(qiáng)，生物活性、配位能力明顯提高，具有許多高聚殼聚糖所不具備的生理活性和功能性質(zhì)。

本文在利用殼寡糖修飾酵母蔗糖酶后，探討兩種蛋白質(zhì)變性劑對酵母蔗糖酶及其修飾酶的活性影響，并通過對酶的催化動力學(xué)參數(shù)變化、紫外吸收光譜、紫外差示光譜、熒光光譜等光譜分析，探討在兩種變性劑作用下酵母蔗糖酶及其修飾酶活性變化與其分子構(gòu)型和構(gòu)象之間的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

酵 母 蔗 糖 酶（yeast invertase，YInv）（EC 3.2.1.26）的純酶（美國Sigma公司），生化試劑考馬斯亮藍(lán)G-250（Fluka公司），殼寡糖（chitooligosaccharides，COS，MW5000）為國產(chǎn)食品級生物制劑，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

主要儀器設(shè)備包括凝膠成像系統(tǒng)（珠海黑馬公司），TFD5503凍干機(jī)（韓國ilShin Lab公司），F(xiàn)4500熒光光譜儀和UV3010紫外光譜儀（日本日立公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蔗糖酶的修飾、純化和鑒定 殼寡糖修飾蔗 糖 酶（chitooligosaccharides-modified-invertase，COS-Inv）由本實(shí)驗(yàn)室按照此前的方法［6］進(jìn)行制備、純化和鑒定。修飾方法如下：用平均分子量為5 000的殼寡糖（COS）修飾YInv。25 mg YInv純酶溶于5 mL NaAc-HAc緩沖液（0.1 mol·L?1，pH 4.0）中，加入5 mL 0.1 mol·L?1NaIO4溶液，混勻，再加入0.5 g蔗糖，攪拌30 min后加入400μL乙二醇終止反應(yīng)。將此溶液在2 L NaAc-HAc緩沖液中進(jìn)行透析。透析管截留分子量為10 kD。重復(fù)透析3次，每次4 h。透析后在溶液中加入0.5 g蔗糖和40 mg COS，攪拌反應(yīng)4 h后，加入1 mol·L?1的NaBH4溶液1 mL。繼續(xù)攪拌4 h后，然后將溶液在2 L NaAc-HAc緩沖液中透析4 h，得到了修飾酶粗酶（粗COS-Inv）。以上步驟均在4℃暗室中進(jìn)行。將此粗COS-Inv溶液在DEAE-52陰離子交換柱中層析純化，用0.05 mol·L?1pH 6.0磷酸緩沖液洗脫。收集各分部洗脫液進(jìn)行蛋白質(zhì)和酶活性鑒定。COS-Inv達(dá)到電泳純的純度后才能用于本研究的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 YInv與COS-Inv的活性測定 酶液（YInv或COS-Inv，以pH 5.0的0.1 mol·L?1NaAc-HAc緩沖液配制為濃度約1 g·L?1）分別于30℃恒溫水浴中保溫10 min。2 mL蔗糖溶液（溶于0.1 mol·L?1NaAc-HAc緩沖液中，pH 5.0）于50℃恒溫水浴中保溫10 min，加入0.1 mL酶液（YInv或COS-Inv），50℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后，加入2 mol·L?1的NaOH溶液0.1 mL終止反應(yīng)，然后測定溶液中還原糖的生成量。還原糖含量的測定采用文獻(xiàn)［7］方法，以葡萄糖和果糖（質(zhì)量比1∶1）作為標(biāo)準(zhǔn)物。蛋白質(zhì)含量的測定參照Bradford［8］的方法，采用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物。

YInv或COS-Inv在50℃ 、pH 5.0的條件下，每毫克蛋白質(zhì)在1 min內(nèi)催化蔗糖水解產(chǎn)生1μg還原糖定義為1個酶活性單位（U）。

1.2.3 YInv與COS-Inv在蛋白變性劑中的活性測定 在50℃、pH 5.0下分別測定YInv與COS-Inv在不同濃度的尿素和鹽酸胍中的活性變化情況。其中，酶液和蔗糖溶液均用含變性劑的緩沖液配制；酶液于30℃預(yù)保溫30 min。YInv與COS-Inv的活性測定方法參照1.2.2進(jìn)行。

1.2.4 在蛋白變性劑中YInv與COS-Inv的動力學(xué)參數(shù)測定 以不同濃度的蔗糖溶液為底物，在50℃、pH 5.0下分別測定YInv與COS-Inv的Linweaver-Burk曲線，求出其Km值和vmax值并進(jìn)行比較。其中，尿素與鹽酸胍分別用緩沖液配制為0.2 mol·L-1溶液；酶液與蔗糖溶液均以變性劑溶液進(jìn)行配制；酶液預(yù)保溫溫度為30℃，酶活性測定方法參照1.2.2進(jìn)行。

1.2.5 YInv與COS-Inv在變性劑中的光譜測定以緩沖液為空白，分別測定YInv與COS-Inv在0.2 mol·L-1尿素和0.2 mol·L-1鹽酸胍中的紫外吸收光譜；以緩沖液中YInv作空白，分別測定YInv在0.2 mol·L-1尿素和0.2 mol·L-1鹽酸胍中的紫外差示光譜；以緩沖液中COS-Inv作空白，分別測定COS-Inv在0.2 mol·L-1尿素和0.2 mol·L-1鹽酸胍中的紫外差示光譜；以緩沖液為空白，分別測定YInv與COS-Inv在0.2 mol·L-1尿素和0.2 mol·L-1鹽酸胍中的熒光發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 變性劑對YInv與COS-Inv的活性的影響

從圖1（a）中尿素濃度為0時的酶活性可知，修飾酶COS-Inv的活性約是天然酶YInv的2.5倍，尿素對YInv和COS-Inv活性的影響不一樣。YInv在一系列濃度尿素中，其活力是受連續(xù)抑制的，酶活性抑制程度隨著尿素濃度的增加而增大。然而，低濃度（＜0.3 mol·L-1）的尿素對COS-Inv有一定的激活作用。當(dāng)尿素濃度為0.2 mol·L?1時，COS-Inv的酶活性比對照（尿素濃度為0 mol·L?1時）提高了10.54%。當(dāng)尿素濃度大于0.3 mol·L?1時，COS-Inv的活性開始下降。比較YInv與COS-Inv在尿素中的穩(wěn)定性，盡管二者酶活性下降趨勢大致相同，由于修飾后COS-Inv的活性是YInv的活性約2.5倍，在經(jīng)4 mol·L?1尿素處理30 min后，COS-Inv的活性仍保持較高，為YInv未經(jīng)尿素處理時的96.63%。

由圖1（b）可見，在不同濃度的鹽酸胍溶液中YInv和COS-Inv的活性是連續(xù)受到抑制的，二者的活性變化趨勢大體一致，其程度隨著鹽酸胍濃度的增加而增大。而且COS-Inv活性下降趨勢比YInv明顯，經(jīng)0.1 mol·L?1鹽酸胍處理后，YInv保留82.74%的活性，COS-Inv保留79.79%的活性。經(jīng)1 mol·L?1鹽 酸 胍 處 理 后 ，YInv殘 留 活 性 為30.99%，COS-Inv為28.94%。

圖1 變性劑對YInv和COS-Inv的活性影響：（a）不同濃度尿素中的酶活性，（b）不同濃度鹽酸胍中的酶活性Fig.1 Effect of protein denaturants on activity of YInv and COS-Inv：（a）enzyme activity in different concentrations of urea solutions，（b）enzyme activity in different concentrations of GuHCl solutions

尿素和鹽酸胍常用于蛋白質(zhì)的變性研究，以探討蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系研究。大量研究表明，極低濃度的尿素和鹽酸胍對多種酶［9-13］有激活作用。在本研究中，鹽酸胍和尿素對YInv和COS-Inv的影響是不同的。鹽酸胍對YInv和COS-Inv的活性影響大體一致，YInv和COS-Inv在鹽酸胍中是受到明顯抑制的。可能是由于鹽酸胍是電解質(zhì)，可以通過正離子（胍離子）效應(yīng)減弱維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的靜電作用，同時還可通過氯離子和胍離子與蛋白質(zhì)相應(yīng)帶電基團(tuán)的相互作用產(chǎn)生的靜電效應(yīng)［14］，破壞了酶分子的整體構(gòu)象，導(dǎo)致YInv和COS-Inv在鹽酸胍中迅速失活。尿素則對YInv和COS-Inv的活性表現(xiàn)出不同的影響。YInv在尿素中的活性受到抑制，而低濃度的尿素（＜0.3 mol·L-1）對COS-Inv卻有激活作用?？赡苁怯捎赮Inv肽鏈與尿素結(jié)合形成雙氫鍵，二級結(jié)構(gòu)受到破壞，整體構(gòu)象改變而失活；而COS的引入對尿素與酶分子肽鏈的結(jié)合起了一定的保護(hù)作用。同時低濃度的尿素微擾了COS-Inv活性部位的局部構(gòu)象，使其柔性增加，表現(xiàn)為酶活性的提高。

2.2 動力學(xué)分析

以蔗糖為底物研究了50℃、pH 5.0條件下，YInv和COS-Inv在尿素和鹽酸胍溶液中的催化動力學(xué)（圖2）。用雙倒數(shù)作圖法分別計算出YInv和COS-Inv在0.2 mol·L?1尿素和0.2 mol·L?1鹽酸胍中動力學(xué)參數(shù)（表1）。由圖2（a）可知，與在緩沖液中相比，YInv在0.2 mol·L?1尿素中的Km和vmax均明顯增大，說明尿素的存在改變了YInv催化位點(diǎn)構(gòu)象，使其vmax增大，但同時又破壞了結(jié)合位點(diǎn)，致使酶結(jié)合底物的能力大大降低，最終導(dǎo)致表觀酶活性下降；而COS-Inv在尿素中的Km和vmax均有所下降，可見在低濃度下尿素對COS-Inv的激活作用是通過提高COS-Inv與底物的親和力來實(shí)現(xiàn)的，可以推斷，尿素通過改變了酶的活性中心的構(gòu)象，使酶與底物的結(jié)合位點(diǎn)向有利于與底物結(jié)合的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，酶分子與底物的親和力增加，從而提高酶的活性。

YInv在0.2 mol·L?1鹽酸胍中的Km和vmax均小于緩沖液中［見圖2（b）和表1］，可知YInv和底物的結(jié)合能力增加但最大反應(yīng)速度下降，說明鹽酸胍改變了酶分子的構(gòu)象。雖然酶結(jié)合位點(diǎn)的柔性增加，酶與底物結(jié)合力增大，但同時又破壞了催化位點(diǎn)的構(gòu)象，最大反應(yīng)速度降低，其反應(yīng)機(jī)理類似于反競爭性抑制。而COS-Inv在0.2 mol·L?1鹽酸胍的Km大于緩沖液中，vmax則略有增加，可以推斷鹽酸胍對COS-Inv的抑制是通過降低酶與底物的親和力來實(shí)現(xiàn)的，類似于競爭性抑制。

圖2 YInv和COS-Inv的催化動力學(xué)分析：（a）YInv與COS-Inv在緩沖液和0.2 mol·L-1尿素中的Lineweaver-Burk曲線，（b）YInv與COS-Inv在緩沖液和0.2 mol·L-1鹽酸胍中的Lineweaver-Burk曲線Fig.2 Catalytic kinetic analysis of YInv and COS-Inv：（a）Lineweaver-Burk curves of YInv and COS-Inv in buffer and in 0.2 mol·L-1 urea solution，（b）Lineweaver-Burk curvesof YInv and COS-Inv in buffer and in 0.2 mol·L-1 GuHCl solution

表1 YInv和COS-Inv在尿素和鹽酸胍溶液中的催化動力學(xué)參數(shù)Tab.1 Catalytic kinetic parameters of YInv and Cos-Inv in urea and guanidine hydrochloride solutions

2.3 變性劑對YInv和COS-Inv紫外吸收光譜的影響

大多數(shù)蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜在280～290 nm及200～235 nm處各有一個吸收峰，一般認(rèn)為230 nm波長以下的紫外吸收峰的變化主要反映酶蛋白主鏈構(gòu)型的變化；當(dāng)肽鏈骨架由無規(guī)則卷曲變成α-螺旋時，吸收明顯下降［15］。本文通過研究變性劑對YInv和COS-Inv的紫外吸收光譜（圖3），探討變性劑對YInv與COS-Inv催化活性的影響和分子構(gòu)型構(gòu)象變化之間的關(guān)系。

圖3 變性劑對YInv和COS-Inv紫外吸收光譜的影響：（a）0.2 mol·L?1尿素，（b）0.2 mol·L?1鹽酸胍Fig.3 Effect of denaturing agents on ultraviolet absorption spectra of YInv and Cos-Inv：（a）0.2 mol·L?1 urea solution，（b）0.2 mol·L?1 GuHCl solution

由圖3（a）可知，與在緩沖液中的結(jié)果比較，經(jīng)0.2 mol·L-1尿素處理的YInv的紫外吸收光譜峰型基本保持不變，在217 nm和273 nm附近的2個特征吸收峰波長不變但峰值有所下降；COS-Inv的紫外吸收譜峰型也基本保持不變，但在219 nm和276 nm附近的兩個特征吸收峰也未發(fā)生改變但峰值有所下降。由圖4（b）可知，經(jīng)0.2 mol·L-1鹽酸胍處理的YInv的紫外吸收譜峰型基本保持不變，217 nm和273 nm附近的兩個特征吸收峰峰值有所下降；COS-Inv的紫外吸收譜峰型也基本保持不變，在219 nm附近的特征吸收峰峰值有所下降。

有機(jī)分子的紫外吸收光譜與其分子結(jié)構(gòu)有緊密的聯(lián)系［16-17］，如果有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)改變，其紫外吸收光譜也就改變。經(jīng)0.2 mol·L?1鹽酸胍和0.2 mol·L?1尿素處理后的YInv和COS-Inv的紫外吸收光譜沒有太大的變化，特征吸收峰均未發(fā)生明顯位移，僅是吸光強(qiáng)度有所降低，這說明鹽酸胍和尿素并未改變二者的構(gòu)型，但卻引起了肽鏈的構(gòu)象變化［15，18-19］。

2.4 變性劑對YInv和COS-Inv紫外差示光譜的影響

紫外差示光譜的變化能進(jìn)一步反映酶在有機(jī)溶劑中與Tyr及Trp殘基有關(guān)的構(gòu)象變化。220 nm和236 nm的差吸收與酶分子主鏈去折疊有關(guān)，232 nm的紫外差示吸收峰與主鏈的構(gòu)象變化有關(guān)，蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)的變化可能和236 nm差吸收的變化直接相關(guān)，260、285和292 nm差示吸收峰主要與Phe、Tyr和Trp有關(guān)［20］。

從圖4（a）可見，YInv和COS-Inv在0.2 mol·L?1尿素中紫外差示光譜出現(xiàn)負(fù)吸收峰（190～340 nm），分別在214 nm和213 nm處有最大負(fù)吸收值。YInv的紫外差示光譜在214 nm有最大負(fù)吸收峰，及在大于220 nm的波段存在持續(xù)的負(fù)吸收，說明在此濃度下的尿素影響酶分子中的Trp、Tyr、Phe的微環(huán)境。COS-Inv在0.2 mol·L?1尿素中的紫外差光譜與YInv相似，但負(fù)吸收峰的位置則發(fā)生輕微紅移，吸光值更小。由此推測，低濃度的尿素微擾了COS-Inv活性部位的構(gòu)象，Trp和Tyr殘基由極性環(huán)境轉(zhuǎn)變成非極性環(huán)境，使解離狀態(tài)的Tyr轉(zhuǎn)變?yōu)榉墙怆x狀態(tài)，導(dǎo)致紫外光吸收的減少，而Trp微環(huán)境的非極性化也使紫外光吸收減少。說明YInv和COS-Inv兩者在尿素中二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象都發(fā)生了變化［20-22］。

圖4（b）的結(jié)果說明，在0.2 mol·L?1鹽酸胍中YInv的紫外差示光譜出現(xiàn)了明顯的負(fù)吸收峰和明顯的正吸收，COS-Inv的紫外差示光譜也出現(xiàn)了明顯的負(fù)吸收峰和輕微的正吸收。因而，YInv在209～227 nm有明顯的負(fù)吸收峰，可能與酶分子主鏈的去折疊有關(guān)；而YInv和COS-Inv在190～208 nm以及COS-Inv大于227nm波段出現(xiàn)持續(xù)的正吸收，則可能與鹽酸胍使肽鏈構(gòu)象趨向松散，Trp和Tyr暴露有關(guān)。這說明，與在緩沖液中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，在鹽酸胍中YInv和COS-Inv的二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象都有變［20-22］。

圖4 變性劑對YInv和COS-Inv紫外差示光譜的影響：（a）0.2 mol·L?1尿素，（b）0.2 mol·L?1鹽酸胍Fig.4 Effect of denaturing agents on ultraviolet differential spectra of YInv and COS-Inv：（a）0.2 mol·L?1 urea solution，（b）0.2 mol·L?1 GuHCl solution

2.5 變性劑對YInv和COS-Inv的熒光光譜的影響

蛋白質(zhì)在270～300 nm的熒光吸收主要是來自Trp、Tyr和Phe，當(dāng)用280 nm波長激發(fā)時，蛋白質(zhì)的熒光光譜的最大值在313 nm和350 nm范圍內(nèi)，恰與Tyr熒光特征發(fā)射峰一致，后者恰與Trp一致［23］。溶劑和介質(zhì)、生色基團(tuán)的微環(huán)境、空間配置關(guān)系所引起的能量轉(zhuǎn)移以及其解離的狀態(tài)等因素都可以引起熒光發(fā)射光譜的變化［15］。

由圖5可見，與在緩沖液中相比，YInv和COS-Inv在0.2 mol·L?1尿素及0.2 mol·L-1鹽酸胍中的熒光發(fā)射峰的峰型及位置基本未出現(xiàn)變化，λmax為338～339 nm，說明YInv和COS-Inv在0.2 mol·L?1尿素及0.2 mol·L?1鹽酸胍中的構(gòu)型基本沒有改變。但無論YInv還是COS-Inv，在兩種變性劑中的熒光強(qiáng)度都出現(xiàn)不同程度的減弱。在變性劑中熒光強(qiáng)度的變化說明酶分子的構(gòu)象已經(jīng)發(fā)生了明顯變化［14，18，21-22］。

圖5 變性劑對YInv和COS-Inv熒光光譜的影響：（a）0.2 mol·L?1尿素，（b）0.2 mol·L?1鹽酸胍Fig.5 Effect of denaturing agents on fluorescence spectra of YInv and Cos-Inv：（a）0.2 mol·L?1 urea solution，（b）0.2 mol·L?1 GuHCl solution

在0.2 mol·L-1鹽酸胍中，胍可能通過靜電效應(yīng)（由氯離子和胍離子與蛋白質(zhì)相應(yīng)帶電基團(tuán)的相互作用引起）激活蛋白質(zhì)部分折疊中間態(tài)，誘導(dǎo)酶蛋白肽鏈伸展，改變了Trp殘基微環(huán)境的空間結(jié)構(gòu)，從而使得熒光有所淬滅。YInv和COS-Inv在0.2 mol·L-1尿素中的熒光發(fā)射峰值降低可能是由于尿素與酶蛋白分子表面Tyr殘基形成更穩(wěn)定的氫鍵［24］造成熒光淬滅；也可能是由于被激發(fā)分子向周圍分子轉(zhuǎn)移能量所至［25］。

3 結(jié) 論

綜合上述YInv和COS-Inv在兩種變性劑中的活性變化以及光譜分析，可見酶的活性變化與酶的分子構(gòu)象（特別是活性部位的構(gòu)象）密切相關(guān)。酶分子構(gòu)象無論是趨向于伸展還是部分伸展、部分螺旋、折疊，都對酶分子活性中心產(chǎn)生很大影響［26］。氯乙醇之類的有機(jī)溶劑對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響與有機(jī)溶劑的濃度有密切關(guān)系。有機(jī)溶劑濃度低時，變性蛋白呈現(xiàn)易聚集的伸展構(gòu)象；當(dāng)濃度提高時，又逐漸變成了α-螺旋；有時，其螺旋含量超過天然狀態(tài)的螺旋含量。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，變性蛋白質(zhì)的構(gòu)象也可以是緊密的構(gòu)象［27］。當(dāng)變性劑濃度達(dá)到一定程度后才發(fā)生導(dǎo)致活性喪失的紊亂構(gòu)象或緊密構(gòu)象等深度變化，使酶活性呈直線下降。從本實(shí)驗(yàn)來看，COS的引入以及在0.2 mol·L-1尿素中有利于YInv或COS-Inv的構(gòu)象得到一定程度伸展。此構(gòu)象的存在有利于酶與底物的結(jié)合和催化反應(yīng)的進(jìn)行，因而使酶激活。而鹽酸胍使YInv或COS-Inv的構(gòu)象變化劇烈，可能會使體系中的極性和介電常數(shù)減少，酶分子的靜電斥力增大，多肽鏈會高度伸展，則不利于酶催化活力的構(gòu)象的形成，造成酶變性失活。酶分子活性部位的相對柔性或運(yùn)動性可能為酶的催化活力所必需，對于酶活性部位的功能基團(tuán)的正確空間集合關(guān)系的任何細(xì)微變化都將影響酶的活力［22］。

變性劑可通過改變酶的空間構(gòu)象而使酶激活，反過來也可以引起酶的失活。焦銘等［28］用“四態(tài)模型”來描述蛋白質(zhì)在鹽酸胍和尿素中的變性過程，即蛋白從天然態(tài)依次轉(zhuǎn)變?yōu)榕钏傻乃木垠w和部分折疊的無活性二聚體，并最終轉(zhuǎn)變?yōu)槿フ郫B態(tài)，也就是形成了變性中間態(tài)。本研究中，低濃度（＜0.3 mol·L-1）的尿素促使COS-Inv活力升高。我們認(rèn)為，COS-Inv在尿素變性過程中也形成了變性中間態(tài)——部分折疊的激活二聚體，此狀態(tài)下的酶分子肽鏈部分伸展，形成一種開放式的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)有利于酶的催化作用。在鹽酸胍的作用下，YInv和COS-Inv雖然也形成了變性中間態(tài)，但該結(jié)構(gòu)卻不利于酶的催化作用。此外，對于不同的酶，在同一種變性劑中所表現(xiàn)出來的作用效果也是不盡相同的。即使是同一種酶，由于研究手段以及變性劑的不同，也有可能得到不同的結(jié)果。在同樣濃度的尿素作用下，COS-Inv表現(xiàn)為激活而YInv表現(xiàn)為抑制。這可能與酶分子的活性中心所處的位置以及變性劑的性質(zhì)兩者相互作用的結(jié)果有關(guān)。