HPLC同步檢測四味穿心蓮散中綠原酸和蘆丁的含量

姜煜倩， 姚 丹， 王宏軍*， 譚 婷， 李佳佳，單文琪， 張 達， 蔣 紅， 胡昭偉

（1.錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧錦州121001；2.錦州市北山農(nóng)墾有限責任公司，遼寧錦州121000）

四味穿心蓮散由穿心蓮、辣蓼、大青葉、葫蘆茶四味中草藥組成，具有清熱解毒、除濕化滯的功能，主治雞瀉痢、積滯。陶松若等（2020）研究表明，四味穿心蓮散水煎液體外對沙門氏菌有抗菌活性；陳建蓉等（2009）、王林等（2017）、班燕桃等（2020）均用薄層色譜法（TLC）對四味穿心蓮散中大青葉相關成分進行了檢測分析；王艷秋等（2013）、包愛情（2016）用高效液相色譜法（HPLC）對四味穿心蓮散中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯進行了檢測，鮮見對該組方中其他成分的HPLC檢測。鑒于此，本實驗以甲醇為提取溶劑，旨在建立HPLC同步測定四味穿心蓮散中綠原酸與蘆丁的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 高效液相色譜儀：L-7420（日本日立公司），配四聯(lián)泵、脫氣泵、紫外檢測器和柱溫箱；色譜柱：島津InertSustian C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）（天津市尚亞科技發(fā)展有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-5203型（上海亞榮生化儀器廠）；超聲波清洗器：KQ-300B（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要試劑 甲醇（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；乙腈（色譜純，天津市津東天正精細化學試劑廠）；磷酸（分析純，天津南開大學精細化工股份有限公司）；穿心蓮、辣蓼、大青葉、葫蘆茶購自遼西國藥店；綠原酸、蘆丁對照品購自成都曼思特生物科技有限公司。

1.3 色譜條件 流動相：乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫，有機相洗脫梯度為0～20 min，12%～18%乙腈；20～30 min，18%～19%乙腈；30～36 min，19%～20%乙腈；36～43 min，20%～25%乙腈；43～48 min，25%～12%乙腈。流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：355 nm；進樣量：10 μL。

1.4 樣品處理 將穿心蓮、辣蓼、大青葉、葫蘆茶4味中草藥按照《中國獸藥典》收載處方配比粉碎，稱取復方中草藥粉末5.0 g。按1:20料液比加入40%甲醇，浸泡1 h，超聲處理30 min后，離心取上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干。用1 mL甲醇溶解，即為待測樣品。

1.5 實驗方法

1.5.1 線性考察 將綠原酸、蘆丁用甲醇稀釋成0.1～0.9 mg/L系列工作標準液，進行液相色譜分析。每個濃度點重復測定3次，取平均值繪制色譜峰面積-濃度標準曲線。

1.5.2 加樣回收率 稱取6份已測定了綠原酸和蘆丁含量的復方中草藥提取物樣品0.1 g，按1.4中的方法制備供試溶液，加入適量混合標準液，在1.3中色譜條件下檢測，重復6次，分析樣品回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離 由圖1可知，在色譜條件下，綠原酸、蘆丁得以良好的分離，且綠原酸、蘆丁2種化合物的保留時間分別為12.832、33.165 min。

圖1 樣品和對照品HPLC色譜圖

2.2 標準曲線 將對照品系列濃度分別進樣檢測，以色譜峰面積（S）和對照品濃度（C，mg/L）作線性回歸。在濃度為0.1～0.9 mg/L內(nèi)，綠原酸的標準曲線為S=5×107C+5171，R2=0.9994，蘆丁的標準曲線為S=1×108C-2187，R2=0.9992。

2.3 加樣回收率 由表1可知，綠原酸的平均回收率為98.41%，RSD為0.62%；蘆丁的平均回收率為98.12%，RSD為0.54%。

表1 加樣回收率

2.4 精密度與重現(xiàn)性實驗 應用上述建立的方法測定了在12 h內(nèi)不同時間段樣品中綠原酸、蘆丁的含量，每個時間段重復進樣5次，6個時間段中綠原酸的平均含量為（4.90±0.10）mg/g，RSD為2.04%；蘆丁的平均含量為（5.47±0.06）mg/g，RSD為1.10%。結(jié)果表明本方法具有很好的精密度和重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

本實驗以乙腈-0.1%磷酸水為流動相進行梯度洗脫，在檢測波長為355 nm條件下，利用HPLC同步檢測四味穿心蓮散中草藥提取物中綠原酸、蘆丁的方法基線穩(wěn)定，重復性理想，相對標準偏差＜1%，線性關系良好，兩種組分分離理想，回收率高，能夠滿足檢測需求。從樣品HPLC圖譜中可以發(fā)現(xiàn)，在該條件下還可以分離檢測到其他成分，這些成分的鑒定、確認有待進一步研究，但是在該條件下未能檢測到穿心蓮內(nèi)酯，這與設定的檢測波長有直接關系。由此可見，利用高效液相分離、紫外檢測器同步檢測復方中草藥提取物多種、多類成分有一定局限性，利用高效液相色譜法與質(zhì)譜法應該可以加快該領域的研究，能夠更加準確評價復方中草藥制劑中的成分組成。所以本方法僅可以作為HPLC同步檢測四味穿心蓮散中綠原酸、蘆丁的一種比較理想的方法。