虎杖苷通過(guò)調(diào)控HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)膿毒癥急性肺損傷的保護(hù)作用

孫鵬 陳敏 張細(xì)六 許愛(ài)軍

1.湖北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院 武漢 430068 2.武漢市第九醫(yī)院 3.武漢市第五醫(yī)院 4.武漢同濟(jì)醫(yī)院

膿毒癥是一種因感染反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的、危及生命的器官功能障礙綜合征，是重癥加強(qiáng)護(hù)理病房（intensive care unit，ICU）住院患者最常見(jiàn)的死亡原因之一[1]。在膿毒癥患者中，約30%可發(fā)展為多器官功能障礙綜合征，其中肺部是最易受感染的器官之一，約40%的膿毒癥患者出現(xiàn)急性肺損傷（acute lung injury，ALI），并可進(jìn)一步發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrme，ARDS）[2]。 目前治療ALI的藥物和方法有限，主要包括高流量鼻導(dǎo)管吸氧、無(wú)創(chuàng)通氣、俯臥位吸氧、體外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）、抗炎治療及相應(yīng)的支持療法等，降低患者病死率的作用不明顯，因此尋找新的治療藥物是臨床治療膿毒癥相關(guān)ALI亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題[3]。近年來(lái)，中藥及其活性成分在治療膿毒癥相關(guān)ALI方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，有較好的應(yīng)用前景[4]?；⒄溶眨╬olydatin，PD）是中藥虎杖的提取物，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、降血脂、鎮(zhèn)咳、抗休克等藥理作用[5]。研究表明，PD對(duì)多種原因誘導(dǎo)的肺損傷具有保護(hù)和治療作用，但其作用機(jī)制尚不清楚[6-7]。高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）/Toll樣 受體4（Toll like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路是重要的炎癥相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，Sun等[8]研究證明，抑制HMGB1、TLR4、NF-κB等基因及其他細(xì)胞因子的表達(dá)水平可減輕敗血癥中重要器官的損傷。本研究通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備大鼠膿毒癥ALI模型，以HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探究PD對(duì)膿毒癥ALI的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)SD大鼠50只，6～8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量180～220g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（豫）2017-0001]，飼養(yǎng)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立動(dòng)物房[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)碼：SYXK（豫）2016-0002]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l件》要求。飼養(yǎng)條件：室溫（22±1）℃，濕度（50±10）%，每天定時(shí)換氣，12h光暗照明，食水不限。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循替代 （replacement）、減少（reduction）、優(yōu)化（refinement）的3R原則，給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷。本研究的主體部分主要在湖北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院完成，武漢市第九醫(yī)院、武漢市第五醫(yī)院、武漢同濟(jì)醫(yī)院共同參與完成了實(shí)驗(yàn)樣本的檢測(cè)工作。研究方案獲湖北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理委員會(huì)審批號(hào)碼：HBGYDXYY20200225）。

1.2 主要試劑與儀器 PD購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司（批號(hào)：C10020672），使用時(shí)以0.5%羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose sodium，CMC-Na）溶解，并混合均勻；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所有限公司（批號(hào)：A001-3-2、A003-1-2）； 腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、 白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司（批號(hào)：E-EL-M0049c、E-EL-M0037c、E-EL-M0044c）；HMGB1、TLR4、NF-κB p65、 甘 油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔源單克隆抗體和羊抗兔二抗均購(gòu)于美國(guó)CST公司（批號(hào)：6893、14358S、8242、5174、7074）；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司（批號(hào)：K1622）；引物購(gòu)于日本Takara公司（批號(hào)：RR420A）。DYCZ-24KS雙板垂直電泳儀購(gòu)于北京六一儀器廠；7500聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀為美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品；IX53顯微鏡購(gòu)于日本奧林巴斯公司；G:BOX多功能凝膠成像系統(tǒng)為英國(guó)Syngene公司產(chǎn)品；Multiskan MK3酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；TGL16MB高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模 將50只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和PD高、中、低劑量組，每組10只。模型組和PD高、中、低劑量組大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備膿毒癥ALI模型，具體操作參考文獻(xiàn)[9]的方法。大鼠提前禁食12h，腹腔注射2%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，腹部備皮、消毒，右下腹部作一2cm的切口，分離盲腸，在盲腸末端距離回盲部5mm處結(jié)扎，然后以20號(hào)針頭穿刺盲腸，每隔4cm穿刺1次，共3次，使盲腸形成創(chuàng)口，輕壓盲腸擠出少量腸內(nèi)容物，最后回納盲腸，縫合腹腔。假手術(shù)組開(kāi)腹后僅翻動(dòng)盲腸后關(guān)腹，不進(jìn)行結(jié)扎和穿刺。若造模后3～24h內(nèi)大鼠出現(xiàn)豎毛、少尿、腹瀉、直腸溫度下降和眼角血性分泌物，則表明造模成功。經(jīng)觀察，各組大鼠均造模成功，未出現(xiàn)死亡大鼠。

1.3.2 給藥方法 造模第2天開(kāi)始給藥。PD高、中、低劑量組大鼠分別予以100、50、25mg·kg-1PD灌胃，藥物以濃度為0.5%的CMC-Na混合均勻；假手術(shù)組和模型組以等體積的CMC-Na灌胃，1次/d，連續(xù)7d。

1.3.3 ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平 末次給藥后2h，大鼠腹主動(dòng)脈穿刺取血，4℃靜置2h，3 000r/min離心10min，離心半徑為12.5cm，分離血清，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.3.4 各組大鼠肺組織濕干重比 （wet-to-dry weight ratio，W/D）檢測(cè) 末次給藥后2h，處死大鼠，分離右上肺葉，用于W/D檢測(cè)，其余肺組織一部分以4%多聚甲醛固定，用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色；另一部分-80℃凍存，用于MDA水平和SOD活力檢測(cè)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）及Western blot檢測(cè)。以吸水紙擦干肺組織表面水分后稱重，記為濕重（wet，W），隨后將肺組織放入80℃恒溫干燥箱烘干，24h后稱重，記為干重（dry，D），并計(jì)算W/D。

1.3.5 各組大鼠肺組織MDA水平及SOD活力檢測(cè)取-80℃凍存的大鼠肺組織，加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS），冰上研磨勻漿，10 000r/min離心10min，離心半徑為12.5cm，取上清液-80℃保存。

1.3.5.1 SOD活力檢測(cè) 取待測(cè)樣品20μL，依次加入SOD檢測(cè)緩沖液、WST-8工作液和反應(yīng)啟動(dòng)工作液，37℃孵育30min，450nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度（absorbance，A）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的SOD活力。

1.3.5.2 MDA水平檢測(cè) 取待測(cè)樣品100μL，加入工作液和蒸餾水，100℃水浴中孵育60min，冰浴冷卻，4 000r/min常溫離心10min，吸取200μL上清液加入玻璃比色皿中，分別檢測(cè)各樣品在波長(zhǎng)450、532和600nm處的A值，ΔA450=A450測(cè)定-A450空白，ΔA532=A532測(cè)定-A532空白，ΔA600=A600測(cè)定-A600空白，MDA含量（nmol·mg-1）=5×[12.9×（ΔA532-ΔA600）-2.58×ΔA450]。

1.3.6 HE染色觀察大鼠肺組織病變 肺組織以4%多聚甲醛固定48h后，蒸餾水清洗，脫水、透明后4μm切片，脫蠟、復(fù)水后HE染色，400倍光鏡下觀察大鼠肺組織病理變化。

1.3.7 Real-time qPCR檢測(cè)肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平 取-80℃凍存的大鼠肺組織，冰上研磨，加入Trizol裂解液提取組織總RNA，使用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 反應(yīng)體系：dNTPs 0.5μL+5×Buffer 5μL+Taq 酶0.3μL+MgCl21.5μL+cDNA模板2μL+上下游引物各1μL，加去離子水至總體積25μL。反應(yīng)條件：95℃5min，95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 30s，40個(gè)循 環(huán) ，72℃延伸10min，4℃ 5min終止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-△△CT的方法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的變化。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.8 Western blot檢測(cè)肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平 取-80℃凍存的大鼠肺組織，冰上研磨，離心取沉淀，加入裂解液提取肺組織蛋白，以二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠 電 泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2h，加入HMGB1、TLR4和NF-κB p65兔源一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，次日以含Tween的Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）清洗后加入羊抗兔二抗（稀釋比例為1∶2 000），37℃孵育2h，洗膜，滴加發(fā)光液，置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。以GAPDH為內(nèi)參照，采用Image J軟件分析各個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多樣本間比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模后3～24h內(nèi)，模型組和PD高、中、低劑量組大鼠均出現(xiàn)豎毛、少尿、腹瀉、直腸溫度下降現(xiàn)象，皮毛雜亂無(wú)光澤，眼角出現(xiàn)血性分泌物，表明造模成功。經(jīng)過(guò)PD治療后，PD高、中劑量組大鼠豎毛、少尿、腹瀉情況明顯改善，皮毛恢復(fù)光澤，直腸溫度恢復(fù)正常，眼角血性分泌物減少；而PD低劑量組大鼠仍存在皮毛雜亂無(wú)光澤、少尿、腹瀉、直腸溫度低等體征，眼角仍可見(jiàn)明顯的血性分泌物。

2.2 各組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 各組間總體比較，血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、PD各劑量組大鼠血清上述炎癥因子水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，PD高、中劑量組大鼠上述血清炎癥因子水平降低（P＜0.05），PD低劑量組炎癥因子水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與PD高劑量組比較，PD中、低劑量組炎癥因子水平均升高（P＜0.05）；與PD中劑量組比較，PD低劑量組炎癥因子水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（±s，pg·mL-1）Tab.2 Comparison of the serum levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in each group（±s，pg·mL-1）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（±s，pg·mL-1）Tab.2 Comparison of the serum levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in each group（±s，pg·mL-1）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與PD高劑量組比較，▲P＜0.05；與PD中劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with sham operation group，#P＜0.05;compared with model group，*P＜0.05;compared with PD high-dose group，▲P＜0.05;compared with PD medium-dose group，△P＜0.05

組別 n TNF-α IL-1β IL-6假手術(shù)組 10 66.85±19.24 62.38±20.98 58.69±18.58模型組 10 320.14±23.96# 411.87±23.99# 398.76±20.57#PD 高劑量組 10 150.24±21.65#* 180.26±22.17#* 168.37±19.38#*PD 中劑量組 10 196.37±22.87#*▲ 208.39±21.56#*▲ 238.22±21.66#*▲PD 低劑量組 10 315.29±22.44#▲△ 400.65±23.54#▲△ 394.59±20.87#▲△F值 108.65 145.62 89.54 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 各組大鼠肺組織W/D值比較 各組間總體比較，肺組織W/D值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、PD各劑量組大鼠W/D值均升高（P＜0.05）。與模型組比較，PD高、中劑量組W/D值降低（P＜0.05），而PD低劑量組W/D值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與PD高劑量組比較，PD中、低劑量組W/D值升高（P＜0.05）；與PD中劑量組比較，PD低劑量組W/D值升高（P＜0.05）。 見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠肺組織W/D值比較（±s）Tab.3 Comparison of W/D value of lung tissues in each group（±s）

表3 各組大鼠肺組織W/D值比較（±s）Tab.3 Comparison of W/D value of lung tissues in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與PD高劑量組比較，▲P＜0.05；與PD中劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with sham operation group，#P＜0.05;compared with model group，*P＜0.05;compared with PD high-dose group，▲P＜0.05;compared with PD medium-dose group，△P＜0.05

組別n W/D假手術(shù)組 10 4.11±0.31模型組 10 6.40±0.52#PD高劑量組 10 4.79±0.38#*PD 中劑量組 10 5.35±0.42#*▲PD 低劑量組 10 6.28±0.49#▲△F值 28.94 P值 ＜0.01

2.4 各組大鼠肺組織MDA水平及SOD活力比較 各組間總體比較，肺組織MDA水平及SOD活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 與假手術(shù)組比較，模型組、PD各劑量組MDA水平升高，SOD活力降低（P＜0.05）。 與模型組比較，PD高、中劑量組MDA水平降低，SOD活力升高（P＜0.05），而PD低劑量組MDA水平和SOD活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；與PD高劑量組比較，PD中、低劑量組MDA水平升高，SOD活力降低（P＜0.05）；與PD中劑量組比較，PD低劑量組MDA水平升高，SOD活力降低（P＜0.05）。 見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠肺組織MDA水平和SOD活力比較（±s）Tab.4 Comparison of level of MDA and SOD activity of lung tissues in each group（±s）

表4 各組大鼠肺組織MDA水平和SOD活力比較（±s）Tab.4 Comparison of level of MDA and SOD activity of lung tissues in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與PD高劑量組比較，▲P＜0.05；與PD中劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with sham operation group，#P＜0.05;compared with model group，*P＜0.05;compared with PD high-dose group，▲P＜0.05;compared with PD medium-dose group，△P＜0.05

組別 n MDA（nmol·mg-1） SOD（U·mg-1）假手術(shù)組 10 12.44±2.01 53.89±4.58模型組 10 35.61±3.11# 24.28±3.69#PD 高劑量組 10 16.42±2.57#* 45.97±5.87#*PD 中劑量組 10 22.50±2.36#*▲ 38.59±3.86#*▲PD 低劑量組 10 34.87±2.98#▲△ 25.12±3.22#▲△F值 45.74 26.33 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.5 各組大鼠肺組織病理變化比較 HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，肺泡腔結(jié)構(gòu)正常，無(wú)滲液，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁光滑。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁明顯增厚，失去正常形態(tài)，肺間質(zhì)水腫充血，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，PD高、中劑量組大鼠肺組織損傷情況得到一定程度改善，肺泡結(jié)構(gòu)基本清晰，水腫和充血程度減輕，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但PD低劑量組肺組織病理切片仍顯示有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增厚、充血。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化比較（HE染色，400×）Fig.1 Comparison of pathological changes of lung tissues in each group（HE staining，400×）

2.6 各組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較 各組間總體比較，肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、PD各劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)增高（P＜0.05）。 與模型組比較，PD高、中劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而PD低劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與PD高劑量組比較，PD中、低劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)增高（P＜0.05）； 與PD中劑量組比較，PD低劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)增高（P＜0.05）。 見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠肺組織中HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of HMGB1，TLR4 and NF-κB p65 mRNA expression of lung tissues in each group（±s）

表5 各組大鼠肺組織中HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of HMGB1，TLR4 and NF-κB p65 mRNA expression of lung tissues in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與PD高劑量組比較，▲P＜0.05；與PD中劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with sham operation group，#P＜0.05;compared with model group，*P＜0.05;compared with PD high-dose group，▲P＜0.05;compared with PD medium-dose group，△P＜0.05

組別 n HMGB1 TLR4 NF-κB p65假手術(shù)組 10 1.05±0.13 1.02±0.09 0.99±0.10模型組 10 2.65±0.18# 1.95±0.16# 2.78±0.19#PD 高劑量組 10 1.35±0.15#* 1.40±0.13#* 1.38±0.12#*PD 中劑量組 10 1.96±0.16#*▲ 1.72±0.15#*▲ 1.81±0.16#*▲PD 低劑量組 10 2.58±0.20#▲△ 1.98±0.18#▲△ 2.45±0.17#▲△F值 54.11 28.47 36.58 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.7 各組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)比較 各組間總體比較，肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、PD各劑量組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）。 與模型組比較，PD高、中劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而PD低劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與PD高劑量組比較，PD中、低劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）；與PD中劑量組比較，PD低劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表6。

表6 各組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.6 Comparison of HMGB1，TLR4 and NF-κB p65 protein expression of lung tissues in each group（±s）

表6 各組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.6 Comparison of HMGB1，TLR4 and NF-κB p65 protein expression of lung tissues in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與PD高劑量組比較，▲P＜0.05；與PD中劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with sham operation group，#P＜0.05;compared with model group，*P＜0.05;compared with PD high-dose group，▲P＜0.05;compared with PD medium-dose group，△P＜0.05

組別 n HMGB1 TLR4 NF-κB p65假手術(shù)組 10 0.25±0.02 0.18±0.02 0.23±0.03模型組 10 1.03±0.09# 1.01±0.08# 0.99±0.08#PD 高劑量組 10 0.35±0.04#* 0.30±0.02#* 0.33±0.05#*PD 中劑量組 10 0.54±0.06#*▲ 0.42±0.03#*▲ 0.49±0.06#*▲PD 低劑量組 10 0.98±0.08#▲△ 0.94±0.09#▲△ 0.97±0.08#▲△F值 34.87 49.21 29.44 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖2 Western blot檢測(cè)各組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expression of HMGB1，TLR4 and NF-κB p65 in lung tissues in each group detected with Western blot

3 討論

膿毒癥是繼發(fā)于感染的致命性急性器官功能障礙，其病理生理反應(yīng)極為復(fù)雜，包括促炎途徑和先天性免疫途徑的激活、適應(yīng)性免疫途徑的改變等過(guò)程，其發(fā)生同時(shí)也取決于宿主和病原體的特征，以及患者所經(jīng)歷的醫(yī)療事件（如手術(shù)和其他感染）和治療方法[10-11]。肺部是膿毒癥病程中最易受到影響的器官，ALI則是膿毒癥誘發(fā)的常見(jiàn)炎性疾病，嚴(yán)重者可發(fā)展為ARDS[12]。臨床研究顯示，中藥對(duì)于膿毒癥相關(guān)ALI和ARDS具有較好的治療效果，可作為ARDS的臨床輔助治療[13]。PD是中藥虎杖的主要活性成分，Cao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PD可通過(guò)抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程減輕小鼠放射性肺損傷，從而有效抑制肺炎和肺纖維化的發(fā)展。Fu等[15]研究表明，PD可緩解百草枯引起的人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5損傷，其機(jī)制與抑制炎癥反應(yīng)、提高抗氧化能力及抑制核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor pyrin domain 3，NLRP3）炎癥小體活化有關(guān)。雖然已有研究證明，PD對(duì)多種肺損傷性疾病具有治療作用，但其對(duì)膿毒癥相關(guān)ALI的影響尚不清楚。

本研究構(gòu)建了大鼠膿毒癥ALI模型，造模后大鼠均出現(xiàn)豎毛、少尿、腹瀉、直腸溫度下降現(xiàn)象，皮毛雜亂無(wú)光澤，眼角出現(xiàn)血性分泌物，表明造模成功。PD治療后，PD高、中劑量組大鼠豎毛、少尿、腹瀉情況明顯改善，皮毛恢復(fù)光澤，眼角分泌物減少，表明一定劑量PD可改善膿毒癥ALI模型大鼠的體征。在膿毒癥相關(guān)ALI發(fā)病過(guò)程中，炎癥反應(yīng)的迅速發(fā)展和氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致機(jī)體多器官損害的重要原因，多種細(xì)胞因子共同參與了這一過(guò)程[16-17]。TNF-α是ARDS發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵因子，能夠刺激其他炎癥因子的分泌和釋放，并逐級(jí)擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，加重肺損傷[18]。在這一過(guò)程中，IL-1β和IL-6等炎癥因子大量表達(dá)，募集炎性細(xì)胞，誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可迅速加重病情，甚至導(dǎo)致患者死亡[19]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高；與模型組比較，PD高、中劑量組大鼠血清炎癥因子水平均降低，但低劑量PD干預(yù)未達(dá)到降低血清炎癥因子水平的效果。模型組大鼠肺組織W/D值顯著升高，與模型組比較，PD高、中劑量組W/D值顯著降低，而PD低劑量組W/D值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，初步證明一定劑量的PD能夠抑制肺損傷大鼠炎癥反應(yīng)，減輕膿毒癥誘發(fā)的肺損傷。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是肺損傷的基本病理生理過(guò)程，MDA水平高低能夠直接反映機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)弱；而SOD則可清除有害氧自由基，抑制氧化應(yīng)激損傷[20]。本研究中，模型組大鼠肺組織MDA水平顯著高于假手術(shù)組，而SOD活力低于假手術(shù)組；與模型組比較，PD高、中劑量組MDA水平降低，SOD活力升高，而PD低劑量組MDA水平和SOD活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明一定劑量PD能夠抑制膿毒癥相關(guān)肺損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)。進(jìn)一步采用HE染色觀察各組大鼠肺組織病變，結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁明顯增厚，失去正常形態(tài)，肺間質(zhì)水腫充血，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而PD高、中劑量組大鼠肺組織損傷得到一定程度緩解，肺泡結(jié)構(gòu)基本清晰，水腫和充血程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，表明PD能夠顯著減輕膿毒癥誘發(fā)的肺組織損傷。

目前雖然膿毒癥相關(guān)肺損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但已有研究證明，HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路在多種原因所致的肺損傷中發(fā)揮了重要調(diào)控作用[8]。HMGB1是高度保守的核蛋白，在受到脂多糖、TNF-α或IL-1刺激后，由單核巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞釋放，也可由受損和壞死的組織細(xì)胞被動(dòng)釋放，進(jìn)一步促進(jìn)多種炎癥因子的分泌，參與膿毒癥、敗血癥、肺炎和關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)展過(guò)程[21]。TLR4是HMGB1誘導(dǎo)炎癥的必需受體，HMGB1可激活TLR2和TLR4，進(jìn)而靶向作用于NF-κB并啟動(dòng)下游炎癥反應(yīng)[22]。Wang等[23]研究證明，抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活，能夠減輕敗血癥引起的ALI。張建峰等[24]研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定能夠通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減輕炎癥反應(yīng)，緩解大鼠膿毒癥肺損傷。本研究結(jié)果提示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增高；與模型組比較，PD高、 中劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，而PD低劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明PD可能通過(guò)抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮對(duì)膿毒癥相關(guān)ALI的治療作用。

綜上所述，PD對(duì)大鼠膿毒癥相關(guān)ALI具有治療作用，能夠減輕大鼠肺組織病理變化，緩解炎癥和氧化應(yīng)激損傷，其作用機(jī)制與抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活化有關(guān)。但本研究?jī)H在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行了初步探討，更詳細(xì)的分子機(jī)制仍需結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。