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    黃連解毒湯“異病同治”冠心病和2型糖尿病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機(jī)制研究

    2021-08-08 02:00:04范吉林朱婷婷田曉玲薛振宇任雯慶郭經(jīng)奇張世亮
    關(guān)鍵詞:異病同治網(wǎng)絡(luò)圖黃連

    范吉林,朱婷婷,田曉玲,薛振宇,任雯慶,郭經(jīng)奇,張世亮

    (1.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 2 50355;2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,山東濱州 3 71600;3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,山東濟(jì)南 2 50011)

    冠心病(coronary heart disease,CHD)是由于冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)粥樣硬化,從而導(dǎo)致患者心臟出現(xiàn)缺血、缺氧、壞死等現(xiàn)象,嚴(yán)重影響患者的心功能[1]。2型糖尿?。╰ypeⅡdiabetes,T 2DM)是一種以血糖升高為綜合表現(xiàn)的代謝性疾病,其可以誘發(fā)心臟、血管等病變,是CHD病發(fā)的重要誘因之一[2],冠心病合并2型糖尿病可致多種系統(tǒng)功能改變,病發(fā)心、腦、腎等組織器官功能衰退[3]。近年來(lái),隨著人們生活方式的改變和生活水平的提高,冠心病和糖尿病的患病率呈逐年上升的趨勢(shì)。有研究指出,冠心病合并T 2DM患者預(yù)后情況較單純冠心病預(yù)后患者差,并且T 2DM患者罹患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)高于健康人群2~4倍[4]。由此可見(jiàn),冠心病和T 2DM互為影響,同時(shí)加重各自疾病的發(fā)展[5]。因此在臨床中及早發(fā)現(xiàn)和治療能夠有效預(yù)防和延緩冠心病合并糖尿病患者的壽命[6]。目前臨床中多采用西藥治療,雖能有效緩解患者癥狀,但預(yù)后較差[7];隨著中醫(yī)藥的發(fā)展,中醫(yī)藥在治療冠心病和T 2DM中療效確切,并且能夠有效改善患者的臨床癥狀和預(yù)后情況。

    黃連解毒湯出自葛洪《肘后備急方》,方名首見(jiàn)于《外臺(tái)秘要》,具有瀉火解毒的功效,用于治療三焦火毒之證,主要由黃連、黃芩、黃柏和梔子等4味藥組成,黃連入上焦而瀉心火,黃芩、黃柏清瀉中焦和下焦之火,梔子清瀉三焦火熱,黃連解毒湯是治療三焦火盛的經(jīng)典方劑[8]。研究證明,黃連解毒湯具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、降糖、調(diào)脂、降壓、改善胰島素抵抗和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等作用[9],在臨床中廣泛應(yīng)用于冠心病、高血壓、糖尿病、高脂血癥等疾病的治療,不僅療效確切,而且安全性較高[9]。黃連解毒湯雖在臨床中廣泛用用,但其作用機(jī)制尚不明確,本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究黃連解毒湯治療冠心病合并T 2DM的作用機(jī)制,以期為黃連解毒湯在臨床中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的綜合調(diào)控特征的中藥機(jī)理研究方法,在中藥機(jī)理研究中的應(yīng)用已成為發(fā)展中藥必不可少的方法[10]。這種用于探索“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”之間相互作用關(guān)系的方法與中醫(yī)的整體觀念相契合。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新的研究思路,可以用于解釋中藥復(fù)方的配伍規(guī)律及為中藥尋找新的適應(yīng)證[11]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討黃連解毒湯“異病同治”冠心病和T 2DM的作用機(jī)制,為黃連解毒湯在臨床中應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

    1 資料與方法

    1.1 黃連解毒湯藥物活性成分篩選

    借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)以方中藥物黃連、黃芩、黃柏、梔子為關(guān)鍵詞檢索收集黃連解毒湯的活性成分,以口服生物利用度(OB)≥30%,類(lèi)藥性(DL)≥為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,并通過(guò)該數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)得到黃連解毒湯的潛在作用靶點(diǎn),然后將得到的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因的標(biāo)準(zhǔn)化處理。

    1.2 藥物靶點(diǎn)獲取

    在OMIM(http://www.omim.org/)和Gene-Cards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)以“coronary heart disease”“typeⅡdiabetes”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,得到冠心病和T 2DM的潛在靶點(diǎn)

    1.3 黃連解毒湯治療冠心病與T 2DM靶點(diǎn)獲取

    運(yùn)用Venn(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線平臺(tái)將化合物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集,得到黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM的潛在作用靶點(diǎn)。

    1.4 藥物?成分?靶點(diǎn)?疾病網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

    將黃連解毒湯中單味藥及活性成分,藥物-疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7,2軟件中,構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖,利用“Network Analyzer”功能進(jìn)行分析,其中節(jié)點(diǎn)代表藥物、成分、疾病、靶點(diǎn),邊代表藥物與成分、成分與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與疾病之間的相互作用關(guān)系。

    1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)篩選

    將藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入至STING(http://string-db.org)數(shù)據(jù)庫(kù),將物種限制為“人”(Homo sapiens),構(gòu)建藥物-疾病蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將STING數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到的數(shù)據(jù),以“tsv”格式導(dǎo)入至Cytoscape3.7.2軟件中,根據(jù)度值大于平均值為條件篩選出核心靶點(diǎn),并構(gòu)建核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

    1.6 GO生物過(guò)程與KEGG通路富集分析

    將得到的藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入至DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái),選擇“OFFICE_GENE_SYMBOL”,將物種限定為“人”(Homo sapiens),以P≤0.05為條件篩選得到黃連解毒湯治療冠心病合糖尿病的生物過(guò)程;以P≤0.05篩選得到黃連解毒湯治療冠心病合糖尿病的相關(guān)通路,選取前20條繪制表格。

    2 結(jié)果

    2.1 黃連解毒湯活性成分篩選

    以O(shè)B≥30%,DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn),在TCMSP共檢索得到黃連解毒湯活性成分103個(gè),其中黃芩36個(gè),黃連14個(gè),黃柏38個(gè),梔子15個(gè),刪除重復(fù)項(xiàng)最終得到黃連解毒湯活性成分86個(gè),并通過(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)得到藥物潛在作用靶點(diǎn)140個(gè)。見(jiàn)表1。

    表1 黃連解毒湯活性成分篩選Tab 1 Active components of Huanglian Jiedu Decoction

    2.2 藥物與疾病交集靶點(diǎn)Venn圖

    通過(guò)OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索得到冠心病相關(guān)靶點(diǎn)5 342個(gè)、T 2DM相關(guān)靶點(diǎn)114個(gè),運(yùn)用Venn圖將黃連解毒湯活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與冠心病和T 2DM疾病靶點(diǎn)取交集,得到黃連解毒湯治療冠心病和糖尿病的14個(gè)靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

    圖1 黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM的靶點(diǎn)Venn圖Fig 1 Venn diagram of Huanglian Jiedu Decoction in tr eating cor onar y hear t disease and T 2DM

    2.3 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

    利用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,其中網(wǎng)絡(luò)中共有91個(gè)節(jié)點(diǎn)(其中黃連解毒湯1個(gè),疾病2個(gè),靶點(diǎn)14個(gè),活性化合物74個(gè)),黃色代表黃芩活性成分,綠色代表黃柏活性成分,粉色代表黃連活性成分,紅色代表?xiàng)d子活性成分,藍(lán)色代表藥物-疾病交集靶點(diǎn),“六邊形”代表黃連解毒湯,“矩形”代表疾病冠心病和T 2DM。其中槲皮素(MOL 000098)、β-谷甾醇(MOL 000358)、豆甾醇(MOL000449)、黃連素(MOL001454)、小檗堿(MOL 002894)、Worenine(MOL 002668)等活性成分節(jié)點(diǎn)的度值較高,提示這些活性化合物在黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM中發(fā)揮重要作用。見(jiàn)圖2。

    圖2 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Network diagram of medicine-ingredient-disease-target

    2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

    將藥物-疾病相映射得到的14個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STING在線平臺(tái)進(jìn)行蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析,圖中共包括14個(gè)節(jié)點(diǎn),45條邊,平均節(jié)點(diǎn)度為6.43,節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)蛋白,邊代表蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系,見(jiàn)圖3。將STING數(shù)據(jù)庫(kù)得到的文件以“tsv”格式導(dǎo)入至Cytoscape3.7.2軟件中,以Degree值大于6為篩選標(biāo)準(zhǔn),篩選得到藥物-疾病核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,其中白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子2(CCL 2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)節(jié)點(diǎn)的度值分別為12、11、9、10,說(shuō)明這些靶點(diǎn)是黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM的核心靶點(diǎn),見(jiàn)圖4。

    圖3 黃連解毒湯與冠心病和T 2DM蛋白互作分析圖Fig 3 Proteins interaction between Huanglian Jiedu Decoction and coronary heart disease and T2DM

    圖4 藥物-疾病核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Network diagram of core target of drug-disease

    2.5 GO功能結(jié)果分析

    將上述得到的14個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入至DAVID在線數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)進(jìn)行GO功能富集分析,得到生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞成分(CC)、分子功能(MF)條目98個(gè),以P≤0.05為篩選條件,分別選取前10條繪制成氣泡圖,主要涉及基因表達(dá)的正調(diào)控、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、胞外空間、細(xì)胞因子活性、類(lèi)固醇激素受體活性等生物過(guò)程。見(jiàn)圖5~7。

    圖5 GO生物過(guò)程分析Fig 5 GO biological process analysis

    2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果

    KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)14個(gè)交集靶點(diǎn)主要富集在20條信號(hào)通路上(P≤0.05),見(jiàn)表2,其中涉及瘧疾、癌癥信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、胰島素抵抗等通路,其中HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路與冠心病和T 2DM關(guān)系密切,提示黃連解毒湯可能通過(guò)以上通路參與治療冠心病T 2DM。

    表2 KEGG通路信息表Tab 2 KEGG pathway results

    圖6 GO細(xì)胞組分分析Fig 6 GO Cell components analysis

    圖7 GO分子功能分析Fig 7 GO M olecular function analysis

    3 討論

    冠心病歸屬于中醫(yī)“胸痹”范疇,其病機(jī)多為本虛標(biāo)實(shí),多由于氣滯、血瘀、痰凝等病理產(chǎn)物導(dǎo)致熱毒內(nèi)蘊(yùn)、灼傷脈絡(luò),致絡(luò)脈拘攣不同[9];T 2DM屬于“消渴病”范疇,病機(jī)多為陰虛為本,燥熱為標(biāo),多由于飲食炙煿厚味,致脾胃蘊(yùn)化失常,蘊(yùn)積化熱,濕熱蘊(yùn)結(jié)化火,火熱易蘊(yùn)結(jié)生毒,熱毒易傷機(jī)體之氣陰[12];二者病理基礎(chǔ)具有相似之處,多由于“熱毒”致病,可以概括為“熱毒熾盛”[12],因此,臨床中治療應(yīng)以“清熱解毒”為主。黃連解毒湯作為清熱解毒的經(jīng)典方劑,在臨床中廣泛應(yīng)用于T 2DM、冠心病、老年性癡呆、頸動(dòng)脈斑塊、缺血性中風(fēng)等疾病的治療[13]。路春茹[14]將100例T 2DM合冠心病患者隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組,對(duì)照組采用常規(guī)西藥治療,觀察組以黃連解毒湯治療,治療結(jié)果顯示黃連解毒湯具有良好的效果,不僅可以降低患者的血糖水平,而且還可以改變冠心病患者的臨床癥狀。進(jìn)一步證實(shí)黃連解毒湯“異病同治”冠心病和T 2DM的具有良好的臨床療效,但由于其成分較復(fù)雜,作用機(jī)制尚不明確,因此,本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討黃連解毒湯“異病同治”冠心病和T 2DM的作用機(jī)制,為黃連解毒湯在臨床中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法共篩選出黃連解毒湯活性成分103個(gè)和相對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)140個(gè)。其中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、黃連素、小檗堿等活性成分作用最強(qiáng)。研究證明,槲皮素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善心功能、降血脂、抗血栓、抑制心肌肥厚等作用,并且還具有降血糖、減輕胰島素抵抗的作用[15]。小檗堿能夠通過(guò)下調(diào)p38MAPK介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路來(lái)降低炎性細(xì)胞因子的表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡[16];小檗堿具有抗糖尿病作用,能夠可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/FOXO1/Bim信號(hào)通路改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[17]。β-谷甾醇是黃連、黃柏、梔子三味藥共有的活性成分,具有抗動(dòng)脈硬化、抗炎、抗氧化、抗高血脂、抗癌、抑制血小板聚集等作用[18],還可以通過(guò)增加脂肪組織中胰島素受體和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的激活來(lái)增強(qiáng)血糖控制[19]。以上說(shuō)明黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM具有多成分的特點(diǎn)。

    黃連解毒湯治療冠心病與T 2DM涉及多靶點(diǎn),通過(guò)藥物-疾病核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖篩選,得到IL 6、TNF、CCL2、VEGFA、AR等9個(gè)核心靶點(diǎn)。脂肪組織分泌的炎性細(xì)胞因子,例如IL 6和TNF,可能發(fā)揮內(nèi)分泌作用,通過(guò)干擾胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)促進(jìn)胰島素抵抗,從而導(dǎo)致胰島素抵抗的臨床表現(xiàn)[20];TNF及IL-6炎性因子在血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)度表達(dá),能夠能加血管內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞的數(shù)量,使血管內(nèi)皮增厚,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化[21],因此抑制炎癥因子的激活能夠改善胰島素抵抗和延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)包含4個(gè)成 員,包 括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D[22],通常所說(shuō)的VEGF指的是VEGF-A,VEGF-A能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管新生及維持血管、改善胰島素抵抗等作用[23],在冠心病、炎癥性病變、糖尿病組織再生等病理生理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[24]。進(jìn)一步證實(shí)黃連解毒湯是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)治療冠心病和T 2DM。

    黃連解毒湯“異病同治”冠心病和T 2DM的靶點(diǎn)GO生物過(guò)程涉及基因表達(dá)的正調(diào)控、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、胞外空間、細(xì)胞因子活性、類(lèi)固醇激素受體活性等生物過(guò)程,這些生物在黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM中起關(guān)鍵作用。通過(guò)KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),靶點(diǎn)主要富集在瘧疾、癌癥信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、胰島素抵抗等信號(hào)通路。HIF-1由亞基HIF-α和組成性亞基HIF-β組成的異二聚體結(jié)構(gòu)[25],HIF-1信號(hào)通路在生物發(fā)育、代謝、貧血、損傷等病理生理過(guò)程發(fā)揮重要作用[26],缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)是缺氧性損傷中發(fā)揮重要的核轉(zhuǎn)錄因子,其下游靶基因涉及血管控制、血管新生、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞增殖和存活等過(guò)程[27],能夠減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷;HIF-1α能夠調(diào)控下游功能基因的表達(dá)水平,介導(dǎo)器官和組織對(duì)微循環(huán)缺氧的應(yīng)答,從而參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[28]。研究表明[29],PI3K-Akt信號(hào)通路的激活參與心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié);也有研究證明,PI3K/AKT信號(hào)通路參與了許多細(xì)胞進(jìn)程的調(diào)控,包括細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞增殖及糖代謝等過(guò)程,其信號(hào)分子異??梢砸鸸谛牟 ⑻悄虿〖鞍┌Y等疾?。?0]。蘇莉等[31]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)活性對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠具有保護(hù)作用。PI3K/Akt信號(hào)通路同時(shí)也是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要通路之一,正常生理情況下,與受體結(jié)合后可以維持血糖平衡和脂類(lèi)代謝[32],胰島素分泌不足時(shí),PI3K/Akt信號(hào)通路受到抑制,會(huì)促使胰島素抵抗,進(jìn)一步導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生[33],因此激活PI3K/Akt信號(hào)通路可能有效緩解血糖、血脂和胰島素抵抗。提示PI3K/Akt信號(hào)通路可以雙向調(diào)控冠心病和糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。TNF信號(hào)通路可促使炎性細(xì)胞因子和TNF-α本身等基因的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[34],TNF-α與胰島素抵抗有密切關(guān)系,機(jī)制可能與TNF-α通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路,抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)[35]。以上說(shuō)明黃連解毒湯“異病同治”冠心病和T 2DM的通路不是單一的,可以通過(guò)多通路、多途徑治療冠心病和T 2DM。

    “異病同治”作為中醫(yī)基礎(chǔ)理論重要的指導(dǎo)原則,至今仍在臨床中廣泛應(yīng)用,但作用機(jī)制尚不明確[36]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新的研究策略和方法,為中藥復(fù)方“異病同治”的作用機(jī)制提供了新的思路。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)冠心病和T 2DM的共有信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)和糖脂代謝密切相關(guān),這與目前冠心病與T 2DM的機(jī)制具有一致性。進(jìn)一步證實(shí)黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn),為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路提供了理論基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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