基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析丹參在骨關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制

袁長深，容偉明，盧智賢，梅其杰，郭錦榮，段 戡

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 5 30023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 5 30000）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種伴隨結(jié)構(gòu)改變的關(guān)節(jié)疼痛綜合征，是最常見的關(guān)節(jié)疾病。隨著OA發(fā)病率升高［1］，關(guān)節(jié)疼痛和殘疾問題較為突出，這不僅影響患者的生活質(zhì)量，而且對全球醫(yī)療體系造成實質(zhì)性的負(fù)擔(dān)。然而，目前使用止痛療法效果不佳，具有明顯的副作用，尚缺乏有效的緩解OA病情的藥物［2］。近年來，通過研究OA的發(fā)病機(jī)制來提高藥物治療的效果，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個熱點［3］。

丹參具有活血調(diào)經(jīng)、涼血消癰、安神的功效。丹參作為活血化瘀之要藥，常用于治療OA，但其化學(xué)成分較多，治療OA的分子機(jī)制亦不明確。因此，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析丹參有效成分治療OA的潛在機(jī)制，為后期的研發(fā)與治療OA提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 丹參有效成分及作用靶點

TCMSP是獨特的中草藥系統(tǒng)藥理平臺，它由在中國藥典中注冊的所有499味中草藥組成，包含29 384個成分、3 311個靶標(biāo)和837種相關(guān)疾病，針對每個化合物成分提供了較為全面的人體吸收、分布、代謝、排泄（ADME）過程的評估數(shù)據(jù)，通過此數(shù)據(jù)庫可獲取藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//Tcmspw.com/tcmsp.php）檢索“丹參”，并下載滿足條件“口服生物利用度OB（%）＞30”、“類藥性DL＞0.18”的有效成分，同時查找有效成分的作用靶點。

1.2 疾病相關(guān)基因的篩選

GeneCards是人類基因綜合數(shù)據(jù)庫，可提供簡明基因組、蛋白質(zhì)組、遺傳和功能上已知和預(yù)測的人類基因。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫（http：//www.Genecards.org/）、人類孟德爾遺傳病OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）篩選“OA”基因，以獲得相對完善的基因數(shù)據(jù)。

1.3 篩選靶基因

使用R語言軟件“VennDiagram”包，將OA相關(guān)基因和丹參作用靶點相交集，獲得丹參作用于OA的靶基因，并做出韋恩圖。

1.4 丹參有效成分與靶基因的關(guān)系

通過自編程的Perl腳本選出與靶基因相關(guān)的有效成分；利用Cytoscape軟件構(gòu)建丹參有效成分與OA靶基因關(guān)系圖；采用“cytoHubba”插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，選出節(jié)點的度（Degree）最多的前十個有效成分。

1.5 關(guān)鍵基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

String數(shù)據(jù)庫是一個可以檢索已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫，為了更好地了解靶基因表達(dá)蛋白之間的關(guān)系，使用String數(shù)據(jù)庫在滿足綜合得分≥0.4的條件下建立PPI網(wǎng)絡(luò)。再利用R語言軟件根據(jù)節(jié)點之間的關(guān)系程度選出PPI網(wǎng)絡(luò)中前30位靶基因，以更好地了解丹參通過靶基因作用治療OA。

1.6 GO批注和KEGG途徑富集分析

采用基因本體論（GO）和途徑富集來分析靶基因，可揭示其所參與的細(xì)胞成分、分子功能、生物過程及信號通路，便于理解中藥有效成分作用于疾病的潛在機(jī)制。Bioconductor是一個基于R語言的、面向基因組信息分析的應(yīng)用軟件集合，可針對DNA微陣列或基因芯片數(shù)據(jù)處理、分析、注釋等。利用Bioconductor中 的“clusterProfiler”、“DOSE”和“pathview”三個包對靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，GO分析包括3類：生物過程（BP），細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）。

2 結(jié)果

2.1 丹參的有效成分及其作用靶點

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，篩選出丹參的65個有效成分，獲得2 566個作用靶點，通過自編程的Perl腳本將作用靶點轉(zhuǎn)換為基因文本，獲得108個有效、獨立的靶基因。

2.2 疾病相關(guān)基因及靶基因

通過GeneCards和OMIM兩個數(shù)據(jù)庫共獲得2 613個與OA相關(guān)、獨立有效的基因。利用R語言軟件“VennDiagram”包將2 613個與OA相關(guān)基因與108個丹參作用的靶點做交集，共獲得65個靶基因，即為丹參治療OA的靶基因。見圖1。

圖1 OA相關(guān)基因與丹參作用靶點的交集Fig 1 The intersection of OA-related genes and the target of Danshen

2.3 有效成分與靶基因的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

利用Perl軟件從丹參的65個有效成分中篩選出可直接作用于靶基因的57個有效成分，通過cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建有效成分-靶基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，淺藍(lán)色八邊形代表OA疾病，與之相連接的綠色圓形代表65個靶基因，紫色正方形代表丹參，與之相連接的橙色倒三角代表57個有效成分，見圖2。最后，通過拓?fù)鋵W(xué)分析發(fā)現(xiàn)木犀草素、丹參酮IIA、隱丹參酮、二氫丹參內(nèi)酯等10個有效成分發(fā)揮主要作用，見表1。

圖2 丹參作用于OA的有效成分-靶基因的關(guān)系Fig 2 The relationship between the effective ingredients of Danshen on OA and target genes

表1 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中有效成分節(jié)點的拓?fù)鋵W(xué)分析Tab 1 Topological analysis of effective component nodes in relational network

2.4 靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

采用String數(shù)據(jù)庫建立靶基因的PPI互作網(wǎng)絡(luò)圖，使用R語言軟件篩選出IL-6、AKT 1、VEGFA、EGFR、STAT 3、MAPK 1、MYC等30個重要的靶基因，即為丹參治療OA的重要作用靶點，見圖3、4。

圖3 靶基因的PPI互作網(wǎng)絡(luò)Fig 3 PPI interaction network of target genes

圖4 關(guān)系較為密切的前30靶基因Fig 4 Top 30 closely r elated tar get genes

2.5 GO和KEGG富集分析

通過Bioconductor對靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)靶基因的GO主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA聚合酶II特異等，見圖5；KEGG信號通路主要富集在PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹 病 毒 感 染 等，見 圖6；通 路 中PI3K-Akt、IL-17、JAK-STAT、MAPK及NF-kappa B等信號通路較為重要，見表2。

表2 靶基因的重要通路Tab 2 Important pathways of target genes

圖5 GO富集分析Fig 5 Go enrichment analysis

圖6 KEGG富集分析Fig 6 KEGG enrichment analysis

3 討論

OA是一種伴隨結(jié)構(gòu)變化的關(guān)節(jié)疼痛綜合征，輕則關(guān)節(jié)疼痛，重則導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形［4，5］。目前OA發(fā)病機(jī)制不明確，尚無有效阻止該病進(jìn)程的手段或方法，OA診療指南（2018版）主張個性化、階梯化治療［6］。藥物治療常使用止痛藥治療OA，但其副作用多［2］，因而在OA診療指南（2018版）中推薦可使用中成藥治療，并認(rèn)為中藥可通過多種途徑減輕OA疼痛，延緩發(fā)病進(jìn)程［6］，因而明確中藥作用OA機(jī)制，對篩選或開發(fā)中成藥制劑就顯得尤為重要。

OA屬于中醫(yī)“骨痹、膝痹、鶴膝風(fēng)”等范疇，本病病機(jī)雖屬“本虛標(biāo)實”，但田雨教授認(rèn)為OA早期即有瘀，瘀在痹前。當(dāng)代醫(yī)家蘭健教授認(rèn)為瘀血是OA的病理產(chǎn)物，亦是OA產(chǎn)生的關(guān)鍵，OA治療必先祛瘀。張志芳等［7］認(rèn)為痹證多瘀血，瘀貫穿OA疾病始終，治療先活血化瘀止痛，后辨證論治求本，亦符合中醫(yī)“通則不痛”、“急則治其標(biāo)”原則。

丹參作為活血化瘀之要藥，常用于治療OA。丹參不僅可通過抗氧化應(yīng)激作用來預(yù)防OA軟骨退變［8］，而且可減輕OA軟骨損傷，達(dá)到治療OA的目的。丹參有效成分-靶基因的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)顯示丹參治療OA通過多成分、多途徑、多靶點發(fā)揮作用［9，10］，這可能與丹參中含有木犀草素、丹參酮ⅡA和隱丹參酮等多種有效成分密切相關(guān)；同時，OA涉及靶基因結(jié)果也顯示對OA治療也存在多靶點。因此，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)明確丹參有效成分作用OA的靶基因、途徑就顯得尤為重要。

通過將丹參有效成分作用靶點與OA相關(guān)基因合并，共篩選出靶基因65個，再利用String數(shù)據(jù)庫建立靶基因的PPI互作網(wǎng)絡(luò)圖，獲得IL-6、AKT1、VEGFA、EGFR、STAT3、MAPK 1、MYC等重要靶基因，這些基因可能是丹參治療OA的關(guān)鍵作用靶點。基因GO功能分析顯示，這些靶基因主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA聚合酶II特異等。細(xì)胞因子包括白介素、趨化因子以及其他信號分子，可通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合以激活信號傳導(dǎo)并調(diào)節(jié)多方面的生物學(xué)作用［11］，例如細(xì)胞因子IL-1與受體IL-1R1結(jié)合，可誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶（MAP）激酶磷酸化進(jìn)一步激活調(diào)節(jié) 激 酶（ERK）、蛋 白38（p38）和c-Jun N端 激 酶（JNK），導(dǎo)致軟骨細(xì)胞中MMP基因表達(dá)增加，Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖基質(zhì)成分合成減少，表明細(xì)胞因子在軟骨合成與降解中起重要作用［12］。在真核細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶Ⅱ可形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體，共同參與轉(zhuǎn)錄起始過程，從而對基因表達(dá)起抑制或增強(qiáng)作用。

OA發(fā)生、發(fā)展與信號通路密切相關(guān)。靶基因富集分析結(jié)果也顯示，KEGG通路主要涉及PI3K-Akt、IL-17、JAK-STAT、MAPK及NF-kappa B等重要信號通路。PI3K-Akt作為重要的抗凋亡通路，PI3K的激活可使Akt磷酸化并激活［13］，進(jìn)而使TSC1、TSC2二聚體解聚，解除其對Rheb的抑制作用，激活mTOR及下游轉(zhuǎn)錄因子eIF4E，影響凋亡相關(guān)基因表達(dá)［14］；同時，PI3K-AKT作為調(diào)節(jié)自噬的經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路，可激活細(xì)胞自噬來改善膝關(guān)節(jié)軟骨損傷。IL-17是關(guān)鍵炎癥細(xì)胞因子，在組織炎癥和自身免疫性疾病中起關(guān)鍵作用［15］，可激活軟骨細(xì)胞合成MMP-1和MMP-13膠原酶來加速軟骨分解；亦可通過膠原碎片和軟骨蛋白多糖的分泌來增強(qiáng)基質(zhì)降解作用，因而有效阻斷IL-17信號通路可以預(yù)防及治療OA［16］。JAK-STAT通路始于細(xì)胞因子刺激JAK激酶，活化的JAK激酶使胞質(zhì)中的STAT磷酸化，2個磷酸化的STAT在核內(nèi)與靶基因啟動子中特異DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等［17］。絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路包括ERK1/2、JNK和p38 MAPK，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等［18］；在細(xì)胞因子作用下，ERK 1/2、p38和JNK MAPK磷酸化，引發(fā)炎癥或凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞增殖，觸發(fā)軟骨細(xì)胞凋亡，加重關(guān)節(jié)軟骨損害［19］。而NF-kappa B作為一個經(jīng)典的激活因子，由兩個Rel蛋白單體組成的二聚物轉(zhuǎn)錄因子，可迅速激活NF-kappaB途徑引起基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）增加，導(dǎo)致軟骨分解；同時通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與凋亡［20，21］。

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析丹參對OA的作用機(jī)制，為研究丹參有效成分對OA的作用提供理論依據(jù)。然而，本文僅是利用在線數(shù)據(jù)庫篩選丹參有效成分作用于OA的靶基因、通路，但仍需通過實驗研究加以驗證。