應(yīng)用TLC-CMS 技術(shù)檢測(cè)核桃青皮中多酚類化合物

杜京旗，李雪芬，楊衛(wèi)民

（呂梁林果植物化學(xué)省市共建山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，山西省特色植物功能成分工程研究中心，呂梁學(xué)院，山西呂梁 033001）

核桃（Juglans regin L.） 系胡桃科核桃屬植物[1]。核桃青皮富含胡桃醌、多酚、黃酮、色素、多糖等多種生物活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌、消炎等多種保健功能[2]。

水解類植物單寧結(jié)構(gòu)式見圖1，縮合類植物單寧結(jié)構(gòu)式見圖2。

圖1 水解類植物單寧結(jié)構(gòu)式

圖2 縮合類植物單寧結(jié)構(gòu)式

植物多酚是一類廣泛存在于植物皮、木、根、葉及果實(shí)中的多羥基酚類化合物，是指分子結(jié)構(gòu)中有若干個(gè)酚性羥基的植物成分的總稱，包括水解單寧（Hydrolytictannin，HT，酸酯類多酚） 和縮合單寧（Condensedtannin，CT，黃烷醇類多酚或原花色素），其酚羥基結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu)，消耗環(huán)境中的氧，同時(shí)對(duì)活性氧等自由基具有很強(qiáng)的捕捉能力，這使多酚具有較強(qiáng)的抗氧化性和清除自由基的能力[3-4]。大量研究表明，植物多酚具有抗菌、抗氧化、抗癌和抗心血管疾病等療效，目前在食品、藥品和化妝品等行業(yè)普遍應(yīng)用[5-7]。近年來，核桃多酚對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用引起了人們極大的興趣，使其逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其機(jī)制可能涉及抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞因子的產(chǎn)生等，目前研究主要集中在核桃仁、核桃殼及核桃青皮多酚的抗腫瘤效應(yīng)[8-10]。核桃仁和核桃葉多酚能有效降低血糖，在降血糖天然藥物成分的研發(fā)中具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)核桃仁乙醇提取物具有較好的α - 葡萄糖苷酶抑制活性，對(duì)糖尿病有一定的防治作用[8]。核桃青皮中含有豐富的 5 - 羥基-1,4- 萘醌、山奈酚、槲皮素等酚類物質(zhì)，其抗菌及抗腫瘤效果顯著。

目前植物多酚的提取方法有萃取法[11]、超臨界流體萃?。⊿CF） 法[12]、超聲波浸提法[13]、微波浸提法[14]等。分離純化的方法主要采用沉淀分離、超濾和層析分離法等[15]。植物多酚作為一類儲(chǔ)量十分豐富、具有較強(qiáng)生物活性的天然化合物，對(duì)人類的健康起著重要的作用。進(jìn)行植物多酚提取分離及檢測(cè)方法的研究，開發(fā)安全、高效的天然抗氧化劑，以及能防治腫瘤、心腦血管等疾病的多酚保健食品，可以創(chuàng)造出較高的經(jīng)濟(jì)效益。試驗(yàn)以75%的甲醇為提取劑，多級(jí)萃取法結(jié)合微波超聲波組合萃取儀輔助處理后從核桃青皮中獲得多酚類化合物提取物，用TLC-CMS 等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和表征。應(yīng)用Plate ExpressTM 技術(shù)可直接從TLC 薄層板上獲取質(zhì)譜圖，其優(yōu)點(diǎn)是不經(jīng)過樣品前處理，可快速?gòu)膹?fù)雜混合物中獲得目標(biāo)物分子質(zhì)量信息，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及主要儀器

材料：核桃青皮、葉、枝條，采集于呂梁當(dāng)?shù)亍?/p>

試劑：甲醇、石油醚、氯仿、苯、甲苯、丙酮、甲酸、冰乙酸、乙酸乙酯、鹽酸、山奈酚、環(huán)己烷。

主要儀器：ALB-224 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；XH-300B 型微波-超聲波組合合成/萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；KH-3000Plus 型薄層色譜儀，上海科哲生化科技有限公司產(chǎn)品；Expressions 質(zhì)譜儀和Plate ExpressTLC-質(zhì)譜接口，美國(guó)Advion 公司產(chǎn)品；Tensor-11 型傅里葉紅外光譜儀，德國(guó)布魯克公司產(chǎn)品。

1.2 核桃青皮中多酚類化合物提取

按料液比1∶30 進(jìn)行浸提（加75%甲醇），用超聲波微波萃取儀分3 個(gè)階段提取，每階段10 min，共30 min。在超聲波恒定的條件下，設(shè)置溫度為45，50，55 ℃；超聲功率為800，850，900 W；微波功率為100，200，300 MHz；超聲頻率為50 kHz，模式15∶10，電機(jī)轉(zhuǎn)速900 r/min。

提取液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，3 次，合并上清液，在65 ℃下濃縮至1/4 體積時(shí)為止。2%鹽酸調(diào)pH 值至2~3，用等量的石油醚除雜，3 次，再用等量的氯仿萃取3 次，濃縮后用色譜醇定容至10 mL。

1.3 薄層色譜分離純化

用內(nèi)徑<1 mm 的管口平整的毛細(xì)管在活化硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，展開劑濕潤(rùn)展開缸20 min 左右，將已點(diǎn)樣的薄層板放入展開缸中，當(dāng)展開劑上升到薄層板的前沿（離前端5~10 mm） 時(shí)取出，將薄層板平放晾干后于薄層成像系統(tǒng)中觀察[16]。并計(jì)算Rf 值。

1.4 紅外光譜檢測(cè)

將儀器和軟件打開使其處于工作狀態(tài)，測(cè)量單通道背景光譜，然后將樣品用毛細(xì)管點(diǎn)樣至光學(xué)臺(tái)的金剛石上，再進(jìn)行單通道樣品光譜的測(cè)量。然后將檢測(cè)出來的光譜轉(zhuǎn)換成倒峰，選擇單峰檢索標(biāo)出每一個(gè)特征峰，分析并保存圖譜[17]。每一個(gè)樣品測(cè)量后，都需要進(jìn)行譜圖處理，如進(jìn)行氣氛補(bǔ)償，可消除 CO2、H2O 的干擾。

1.5 質(zhì)譜分析

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜檢測(cè)

用色譜甲醇和超純水作為流動(dòng)相。將儀器和軟件打開使其處于工作狀態(tài)，用微量進(jìn)樣器吸取10 μL的山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液插入到進(jìn)樣口處，打到load 檔開始進(jìn)樣，進(jìn)完樣后打回到inject 檔。點(diǎn)開界面對(duì)譜圖進(jìn)行分析，并保存。

1.5.2 待測(cè)液的質(zhì)譜檢測(cè)

流動(dòng)相與待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的流動(dòng)相相同。將儀器和軟件處于工作狀態(tài)，把待測(cè)品薄層板置于TLC-質(zhì)譜接口上，使激光對(duì)準(zhǔn)圈出的山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)中心處。用軟件操作進(jìn)行取樣，30 s 后獲得質(zhì)譜圖，通過界面對(duì)譜圖進(jìn)行分析，并保存。

1.6 熔點(diǎn)、旋光度分析

物質(zhì)的熔點(diǎn)（melting point），即在一定壓力下，純物質(zhì)的固態(tài)和液態(tài)呈平衡時(shí)的溫度。用熔點(diǎn)儀對(duì)提取的物質(zhì)熔點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。使用熔點(diǎn)儀時(shí)，首先將提取的樣液放入蒸發(fā)皿中，在電熱板上蒸發(fā)結(jié)晶成為固體，然后將固體放入一端封口的毛細(xì)管中，插入熔點(diǎn)儀中，按照下圖調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)碾妷簛砩郎?，?dāng)固體變?yōu)楣桃浩胶獾臓顟B(tài)時(shí)溫度計(jì)顯示的溫度即為該物質(zhì)的熔點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃青皮提取率

核桃青皮多酚類和醌類的總提取率見表1。

表1 核桃青皮多酚類和醌類的總提取率

2.2 薄層色譜分離純化

核桃青皮氯仿相TLC 成像圖見圖3，核桃青皮、嫩葉、陳葉和嫩枝氯仿相TLC 成像圖見圖4，核桃不同部位氯仿相與標(biāo)準(zhǔn)品的TLC 成像圖見圖5。

圖3 核桃青皮氯仿相TLC 成像圖

圖4 核桃青皮、嫩葉、陳葉和嫩枝氯仿相TLC 成像圖

圖5 核桃不同部位氯仿相與標(biāo)準(zhǔn)品的TLC 成像圖

由圖4 可以看出，在甲醇，氯仿，苯，石油醚（1∶10∶1∶3，V/V） 下，核桃青皮氯仿相展開效果良好，色譜斑點(diǎn)圖像清晰，斑點(diǎn)之間距離適中，無拖尾現(xiàn)象發(fā)生。查閱文獻(xiàn)分析可知，核桃青皮氯仿相中有酚類物質(zhì)和醌類物質(zhì)。

從圖5 可以看出，在甲醇、氯仿、苯、石油醚（1∶10∶1∶3，V/V） 下，核桃不同部位氯仿相全部展開。通過對(duì)比可知，核桃青皮和新葉中酚類和醌類物質(zhì)比較豐富，舊葉和嫩枝中成分較少。

核桃陳葉和嫩葉氯仿相顯色前TLC 成像圖見圖6，核桃陳葉和嫩葉氯仿相顯色后TLC 成像圖見圖7。

圖6 核桃陳葉和嫩葉氯仿相顯色前TLC 成像圖

圖7 核桃陳葉和嫩葉氯仿相顯色后TLC 成像圖

從圖6 可以看出，以甲苯∶丙酮（5∶1，V/V）為展開劑，核桃不同部位氯仿相完全展開，效果各異，但色譜斑點(diǎn)較為清晰?？沙醪酱_定核桃嫩枝、青皮、嫩葉、氯仿相中含有與山奈酚、橘皮素和柚皮素極性大致相同的物質(zhì)。

從圖7 和圖8 可以看出，核桃陳葉、嫩葉和熊果酸在甲苯∶丙酮（5∶1，V/V） 下完全展開、色譜斑點(diǎn)較為清晰，但顯色前未見熊果酸的色譜斑點(diǎn)，用10%硫酸乙醇顯色后各部分色譜斑點(diǎn)清晰。樣液與熊果酸相同的位置有條帶，可初步斷定核桃葉中含有與熊果酸極性大致相同的物質(zhì)。

從圖6、圖7 和圖8 可以看出，核桃不同部位含有與山萘酚、橘皮素、柚皮素和熊果酸極性相近的物質(zhì)，但要獲得準(zhǔn)確結(jié)果需要通過對(duì)其質(zhì)譜圖和紅外光譜圖進(jìn)行分析。

下面以山萘酚對(duì)照品為例進(jìn)行分析。

2.3 核桃青皮中多酚類物質(zhì)的質(zhì)譜檢測(cè)與分析

將所提取的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照看是否有相同的碎片，若有相同碎片，即可初步斷定所提取的物質(zhì)為多酚類物質(zhì)。

山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖見圖8。

圖8 山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖

從圖8 可以看出，山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品的荷質(zhì)比為229，有55，129，143，這幾個(gè)碎片。與相關(guān)文獻(xiàn)山奈酚的質(zhì)譜圖有相同的碎片峰，不同的是山奈酚的相對(duì)分子質(zhì)量為286。原因可能是，質(zhì)譜分析中會(huì)出現(xiàn)碎片丟失現(xiàn)象，標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，含有羥基較多，打碎片的過程中很有可能出現(xiàn)羥基丟失。而多酚類化合物也含有羥基，羥基丟失造成相對(duì)分子質(zhì)量減少。

核桃青皮色譜斑點(diǎn)A 的質(zhì)譜圖見圖9。

摳取圖5 中色譜斑點(diǎn)A，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。從圖9可以看出，色譜斑點(diǎn)A 質(zhì)荷比為229，與山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品都有55，129，143 碎片峰，基本可以斷定斑點(diǎn)A 是山奈酚。

圖9 核桃青皮色譜斑點(diǎn)A 的質(zhì)譜圖

核桃青皮色譜斑點(diǎn)B 的質(zhì)譜圖見圖10。

摳取圖5 中色譜斑點(diǎn)B，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。從圖10 可以看出，色譜斑點(diǎn)B 質(zhì)荷比為333，與山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品均出現(xiàn)129，143，229 的碎片峰，與山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)荷比229 相差4，可以基本得出斑點(diǎn)B 也為多酚類物質(zhì)。

圖10 核桃青皮色譜斑點(diǎn)B 的質(zhì)譜圖

核桃青皮色譜斑點(diǎn)A 和B 均具有多酚類物質(zhì)的分子離子峰，且碎片峰也基本一致。

2.4 核桃青皮中多酚類物質(zhì)的紅外光譜檢測(cè)與分析

經(jīng)查閱文獻(xiàn)可知，“酚醇羥基易締合，3 300 cm-1處有強(qiáng)峰”。苯環(huán)在1 500~1 800 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，羥基（O-H） 在3 000~3 800 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，羰基(-C=O-)在1 000~1 600 cm-1處會(huì)出現(xiàn)峰。因此，多酚類化合物的紅外出峰的位置在3 000~3 600 cm-1，1 000~1 800 cm-1之間會(huì)出峰。

山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品紅外光譜圖（固態(tài)） 見圖11。

圖11 山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品紅外光譜圖（固態(tài)）

從圖11 可以看出，山奈酚對(duì)照品固體紅外光譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在3 127 cm-1和1 175 cm-1兩處出現(xiàn)了強(qiáng)峰，這之間還出現(xiàn)了一些小峰，與文獻(xiàn)查閱結(jié)果一致。

山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品紅外光譜圖（液態(tài)） 見圖12。

圖12 山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品紅外光譜圖（液態(tài)）

從圖12 可以看出，山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品（1 mg/mL）紅外檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在3 301，2 326，2 326，1 636，1 604 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)峰，在查閱文獻(xiàn)的范圍內(nèi)，由于標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑是色譜醇。因此，羥基峰更為明顯一些。

核桃青皮斑點(diǎn)A 紅外光譜圖見圖13。

圖13 核桃青皮斑點(diǎn)A 紅外光譜圖

將從薄層板上刮下斑點(diǎn)A 用色譜醇溶解、過濾、定容到3 mL。

從圖13 可以看出，與山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，斑點(diǎn)A 的光譜圖幾乎相同的位置出現(xiàn)強(qiáng)峰，說明與山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品所含官能團(tuán)一致，初步斷定該物質(zhì)是山奈酚。

核桃青皮斑點(diǎn)B 紅外光譜圖見圖14。

圖14 核桃青皮斑點(diǎn)B 紅外光譜圖

將從薄層板上刮下斑點(diǎn)B 用色譜醇溶解、過濾、定容到3 mL。

從圖14 可以看出，斑點(diǎn)B 與山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)強(qiáng)峰的位置基本相同，說明與山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品所含官能團(tuán)基本一致，可初步斷定斑點(diǎn)B 是與山奈酚結(jié)構(gòu)相似的多酚類化合物。

綜上所述，核桃青皮氯仿相中含有苯環(huán)、羥基、羰基等多酚類化合物含有的官能團(tuán)，結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，可以確定提取的物質(zhì)為多酚類化合物。

2.5 核桃青皮中多酚類物質(zhì)含量測(cè)定

山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品光譜掃描圖見圖15。

圖15 山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品光譜掃描圖

從圖15 可以看出，在0.02 mg/mL 下對(duì)山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行光譜掃描，于波長(zhǎng)360 nm 處出現(xiàn)了最大吸收峰。

配制0.01 mg/mL 山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋為質(zhì)量濃度梯度為 0.02，0.025，0.03，0.035，0.04 mg/mL，根據(jù)其吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量見圖16。

圖16 山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量

圖16 為山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，即Abs=113.12c+0.019 （R=0.999 4）。

將核桃青皮色譜斑點(diǎn)A 和B 溶解、過濾，用色譜醇定容到3 mL 后進(jìn)行濃度的測(cè)量，結(jié)果顯示，從7.2 g 核桃青皮中提取該物質(zhì)0.06 mg。

核桃青皮中山奈酚含量見表2。

表2 核桃青皮中山奈酚含量

2.6 熔點(diǎn)、旋光度結(jié)果分析

經(jīng)薄層分析后，確定出多酚類物質(zhì)的熒光斑點(diǎn)，用色譜醇溶解后成為樣液，將樣液進(jìn)入全自動(dòng)旋光儀中進(jìn)行旋光度和比旋光度的測(cè)定。將樣液蒸發(fā)結(jié)晶，再進(jìn)入熔點(diǎn)儀測(cè)熔點(diǎn)。

核桃青皮中山奈酚的熔點(diǎn)見表3，核桃青皮中山奈酚的旋光度見表4。

表3 核桃青皮中山奈酚的熔點(diǎn) ℃

表4 核桃青皮中山奈酚的旋光度

3 結(jié)論

以75%甲醇作提取劑，料液比1∶30，用超聲波微波萃取儀分3 個(gè)階段提取，每階段10 min，共30 min。在超聲波恒定的條件下，設(shè)置溫度為45，50，55 ℃；超聲功率為800，850，900 W；微波功率為100，200，300 MHz；超聲波頻率為50 kHz，模式15∶10，電機(jī)轉(zhuǎn)速900 r/min。多級(jí)萃取后獲得氯仿相，多酚類和醌類總提取率為6.48%。

在甲醇∶氯仿∶苯∶石油醚 （1∶10∶1∶3，V/V)下，核桃青皮、嫩葉、陳葉和嫩枝展開效果良好，色譜斑點(diǎn)圖像清晰，無拖尾現(xiàn)象發(fā)生。與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)發(fā)現(xiàn)，核桃不同部位中含有與山萘酚、橘皮素、柚皮素和熊果酸極性相近的物質(zhì)。

質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，核桃青皮色譜斑點(diǎn)A 和B 的質(zhì)譜圖與山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品的圖形幾乎一致，分子離子峰基本相同，且出現(xiàn)的離子碎片峰很接近；斑點(diǎn)A 和B 的紅外光譜圖與山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品幾乎在相同的位置出現(xiàn)強(qiáng)峰，說明核桃青皮氯仿相中含有苯環(huán)、羥基、羰基等多酚類化合物的官能團(tuán)；斑點(diǎn)A 和B 的熔點(diǎn)（282 ℃；296 ℃） 在山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品的276~278 ℃范圍內(nèi)或附近，旋光度和比旋度分別為-0.53 和-59；-41.59 和 -59.00 范圍內(nèi)。

經(jīng)多次嘗試，確定核桃葉和枝最合適的展開劑為：乙酸乙酯∶甲苯∶甲酸=10∶8∶1（0.5 mL 冰乙酸可在一定程度上防止拖尾）。

TLC 對(duì)不同物化特性的溶劑體系和多樣性的操作條件，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，為從復(fù)雜的天然產(chǎn)物粗制品中提取不同特性（如不同極性） 的有效成分提供了有利條件。TLC 在核桃青皮生物活性物質(zhì)分離純化中具有操作簡(jiǎn)便、容易掌握、回收率高、重現(xiàn)性好、分離效率高、分離量較大等特點(diǎn)，且能夠獲得較高的提取率[18-19]。因此，TLC 有望在標(biāo)準(zhǔn)品的制備、天然產(chǎn)物化學(xué)成分研究及新藥研發(fā)等領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。

TLC 從核桃青皮中制備多酚類物質(zhì)需要做進(jìn)一步的表征分析。傅里葉紅外光譜儀可以準(zhǔn)確分析有機(jī)物中的官能團(tuán)，多酚類物質(zhì)的酚羥基在3 000~3 500 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，提取物含有酚羥基，是多酚類化合物。質(zhì)譜儀可以直接檢測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量，與標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖進(jìn)行比對(duì)，可確定提取物為多酚類化合物。試驗(yàn)過程中，紅外檢測(cè)出現(xiàn)的問題比較多。例如，樣品中出現(xiàn)了和甲醇相似的特征峰，分析其原因可能是由于定容時(shí)甲醇的量過大；樣品中所提物質(zhì)的含量較少等原因。

如果不是純的物質(zhì)，熔點(diǎn)差異就會(huì)比較大。核桃青皮中含有豐富的多酚類化合物，所以與單一標(biāo)準(zhǔn)品的熔點(diǎn)差異比較大；同類物質(zhì)雖然含有相同的官能團(tuán)，但是由于結(jié)構(gòu)有較大的差異，其旋光度也會(huì)有所不同。

Plate ExpressTM 技術(shù)可直接從TLC 薄層板上獲取質(zhì)譜圖，其優(yōu)點(diǎn)是不經(jīng)過樣品前處理，可快速?gòu)膹?fù)雜混合物中獲得目標(biāo)物分子質(zhì)量信息，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。