H7N9 亞型流感病毒熒光定量RT-PCR 檢測方法的建立

雷宇平，圖門巴雅爾，張仲萍，王 錦，寧 艷，雷 沖，胡明明，孫 杰，王治維，趙 凱，張 昱，王仲兵

（山西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西太原 030027）

流感（influenza）是由流感病毒（influenza virus，IV）引起的人獸共患病，禽類和哺乳類動(dòng)物均易感。2013 年，上海市發(fā)現(xiàn)首例人感染H7N9亞型IV（IV-H7N9）病例。IV-H7N9 在之后4 年內(nèi)引起的感染人數(shù)與H5N1 亞型20 年內(nèi)引起的感染人數(shù)相似，提示其對人類健康的威脅性較高[1]。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部官網(wǎng)信息，2013 年至2017 年，我國已經(jīng)發(fā)生了5 次家禽IV-H7N9 疫情，流行范圍幾乎遍及全國[2]。

通常來說，H5 和H7 亞型IV 屬于高致病性病毒，可引起雞群中度或重度呼吸系統(tǒng)疾病，死亡率較高[3]。值得注意的是，與H5N1 亞型相比，H7N9 亞型在禽類中流行較隱蔽，引起的癥狀缺乏不易被發(fā)覺，從而導(dǎo)致養(yǎng)殖場遭受經(jīng)濟(jì)損失，并威脅公眾身體健康[1，4]。IV-H7N9 流行通常遵循季節(jié)規(guī)律，無患病人群年齡和性別分布差異[5]。

IV 致病性強(qiáng)弱受多種因素影響，對易感雞群來說，病毒毒力和雞群免疫水平都能影響其發(fā)病情況[6]。通常人感染IV-H7N9 是通過與患病禽類密切接觸引起的。感染者可發(fā)生嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難，同時(shí)伴有天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶和乳酸脫氫酶升高，患者也會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，包括急性呼吸系統(tǒng)衰竭、休克、急性腎損傷、淤血性心衰等。

目前，人類針對IV-H7N9 的群體免疫尚未建立，且該病毒還可在禽類以外的小鼠、貂及靈長類等動(dòng)物體內(nèi)高度復(fù)制，因此其具有大流行的可能性[7]。盡管IV-H7N9 可在活禽中被檢出，然而其在雞群中的致病性和傳播機(jī)制尚未完全明確[8]。2017年國家衛(wèi)健委組成聯(lián)合督導(dǎo)組，對流感疫情重點(diǎn)省份防控工作進(jìn)行督查，指出我國IV-H7N9 疫情表現(xiàn)出病例增多、分布地區(qū)廣、散發(fā)程度高等特點(diǎn)，但疫情總體特點(diǎn)未發(fā)生改變，接觸被感染禽類或暴露于活禽經(jīng)營市場是人感染的重要危險(xiǎn)因素[9]。

IV-H7N9 的免疫學(xué)檢測技術(shù)主要有免疫膠體金檢測和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。這兩種技術(shù)操作簡單，適用于病毒現(xiàn)場檢測。IV-H7N9 的分子生物學(xué)檢測方法包括RT-PCR、多重RT-PCR、基因芯片、液相芯片等。其中：多重RT-PCR 可同時(shí)檢測不同亞型病毒；基因芯片和液相芯片特異性高、檢測時(shí)間短，但對硬件要求高，成本相對較高；RT-PCR 具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，且可以對樣品進(jìn)行定量分析，是目前在監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)中使用最廣泛的方法。

加強(qiáng)源頭管控，早期檢出IV-H7N9，是減少農(nóng)場經(jīng)濟(jì)損失，降低公眾生命健康威脅的必要手段。本研究旨在構(gòu)建一種高效、準(zhǔn)確的熒光定量RT-PCR 方法，以快速檢出雞群中的IV-H7N9，為控制病毒擴(kuò)散提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 核酸樣品

第二代人感染IV-H7N9 核酸檢測試劑國家參考品，購自國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)站，貨號(hào) 370050；H1、H3、H5、H9 亞型禽流感（AIV）核酸樣品，購自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為AIV-H1 20200617P、AIV-H3 20200617P、AIV-H5 20200212P、AIV-H9 20200210P。

1.2 試劑和儀器

RNA 提取試劑盒，購自廣州維伯鑫生物科技股份有限公司；ddH2O，為美國Sigma 公司產(chǎn)品；dNTPs、5×buffer，購自上海生工生物工程有限公司；Hot-startTaq聚合酶、MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶，購自菲鵬生物股份有限公司；高速低溫離心機(jī)，購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；LightCycler480 熒光PCR 儀，為瑞士羅氏公司產(chǎn)品；小型瞬時(shí)離心機(jī)，為美國精騏公司產(chǎn)品；渦旋振蕩器、超微量紫外分析儀，為Quawell Technology 公司產(chǎn)品。

1.3 引物和探針設(shè)計(jì)

從GenBank 上下載序列（H7 序列登記號(hào)：MT498676.1、MG925503.1、MN170546.2、MN686727.1；N9 序列登記號(hào)：MG266066、MN700040、MH553128、KP416232），序列比對后，分別針對H7 和N9 片段使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)1對特異性引物和TaqMan 探針。引物和探針?biāo)蜕ど锕こ蹋ㄉ虾＃┕煞萦邢薰竞铣伞?/p>

1.4 熒光定量RT-PCR 擴(kuò)增

按照總RNA 提取試劑盒（柱提法）說明書要求提取第二代人感染IV-H7N9 核酸檢測試劑國家參考品中病毒總RNA，再使用超微量紫外分析儀，通過檢測樣本在260 nm 波長的吸光度來確定所提取RNA 濃度。以RNA 為模板，使用熒光PCR 儀進(jìn)行熒光定量RT-PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25.0 μL：RNA 模板4.0 μL、引物及探針（F1、R1、P1、F2、R2、P2，均為10 μmol/L）各0.5 μL、dNTPs

表1 引物和探針

（10 mmol/L）1.4 μL、5×buffer 5.0 μL、Hot-startTaqpolymerase（2 U/μL）1.0 μL、MMLV Reverse Transcriptase（25 U/μL）1.0 μL、ddH2O 9.6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃，20 min；95 ℃，10 min；94 ℃，15 s，55 ℃，30 s（收集熒光），共40 個(gè)循環(huán)。

1.5 最低檢測限試驗(yàn)

對第二代人感染IV-H7N9 核酸檢測試劑國家參考品中最低檢出限參考品按照產(chǎn)品說明書操作，加入0.5 mL 無RNA 酶去離子水復(fù)溶后（濃度為1.7×106copies/mL），分別用無RNA 酶去離子水進(jìn)行10-1～10-4（濃度為1.7×105～1.7×102copies/mL）4 個(gè)濃度梯度稀釋。用熒光RT-PCR 方法對待測樣品進(jìn)行檢測從而確定最低檢測限。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

對第二代人感染IV-H7N9 核酸檢測試劑國家參考品中重復(fù)性參考品按照產(chǎn)品說明書操作，加入無RNA 酶去離子水稀釋100 倍后，利用建立的熒光RT-PCR 反應(yīng)體系重復(fù)檢測H7 和N9 核酸參考品10 次，記錄每次反應(yīng)結(jié)果并分析。

1.7 敏感性和特異性試驗(yàn)

以第二代人感染IV-H7N9 核酸檢測試劑國家參考品作為陰性和陽性對照，參考品恢復(fù)至室溫后，按照產(chǎn)品說明書操作，將陰性、陽性參考品分別加入0.5 mL 無RNA 酶去離子水復(fù)溶，待液體完全澄清后作為待測樣品使用。陽性參考品用于敏感性檢測，陰性參考品用于特異性檢測；H1、H3、H5、H9 等核酸樣品，同樣用于特異性檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用IBM SPSS Statistics 21.0 軟件對重復(fù)性試驗(yàn)中的變異系數(shù)（coefficient of variance，CV）進(jìn)行計(jì)算，CV ≤5%，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低檢測限

對4 個(gè)濃度梯度的最低檢出限參考品，以本試驗(yàn)建立的熒光定量RT-PCR 方法分別對H7 和N9片段進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H7 和N9 核酸片段最低檢測限均為1.7×103copies/mL（圖1～2）。

圖1 H7 核酸片段最低檢測限結(jié)果

圖2 N9 核酸片段最低檢測限結(jié)果

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

為確認(rèn)所建立的熒光RT-PCR 方法能否穩(wěn)定檢出IV-H7N9，使用該方法分別重復(fù)檢測H7 和N9核酸參考品各10 次，檢測結(jié)果見圖3。經(jīng)計(jì)算，得出H7 和N9 核酸參考品CV 分別為0.25%和0.30%，二者均＜1%（表2），提示該方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

圖3 H7 和N9 核酸參考品重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 敏感性和特異性試驗(yàn)

利用第二代人感染IV-H7N9 核酸檢測試劑國家參考品作為陽性和陰性對照，檢測熒光定量RTPCR 方法的靈敏度。結(jié)果（圖4）顯示，與陽性對照相比，該方法檢測的10 個(gè)IV-H7N9 樣本全部為陽性，敏感性為100%（10/10）。

圖4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

利用陰性參考品檢測該方法特異性的結(jié)果（圖5）顯示：與陽性對照相比，該方法檢測的20 個(gè)陰性參考品樣本全部為陰性，特異性為100%（20/20）。同時(shí)使用H1、H3、H5、H9 等核酸樣品進(jìn)行擴(kuò)增檢測的結(jié)果也均為陰性（圖6）。綜上，該方法具有良好的特異性。

圖5 陰性標(biāo)準(zhǔn)品特異性檢測結(jié)果

圖6 H1、H3、H5、H9 等亞型AIV 檢測結(jié)果

3 討論

甲型IV 屬于正黏病毒科，是單股負(fù)鏈RNA病毒，含有8 個(gè)基因片段，其自然宿主主要是禽類。除蝙蝠流感病毒以外，水生禽類體內(nèi)都可檢測到血凝集素（hemagglutinin，HA）H1～16 和神經(jīng)酰胺酶（neuraminidase，NA）N1～9 亞型病毒。IV 從禽類傳染給哺乳類的情況時(shí)有發(fā)生，部分病毒能夠通過突變和重排在人群中形成傳播[8]。

2013 年首次報(bào)道人感染IV-H7N9，并引起了社會(huì)、學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注。測序分析[9]顯示，該病毒來源于野生鳥類，基因組發(fā)生了重排，其HA 片段來源于歐亞分支。盡管目前并沒有足夠流行病學(xué)證據(jù)表明IV-H7N9 可持續(xù)在人類中傳播，也不能完全排除局部發(fā)生人傳人現(xiàn)象[7]。據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心官方網(wǎng)站相關(guān)信息，2017 年發(fā)現(xiàn)H7N9病毒變異株，其HA 片段存在插入性突變，具有高致病性，值得引起高度警惕[10]。因此，早期診斷、快速檢測IV-H7N9，及時(shí)更新病毒檢測方法對于該病源頭防控具有重要意義。

熒光定量RT-PCR 是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，隨著反應(yīng)進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，從而能夠利用較少樣本檢測出準(zhǔn)確量化結(jié)果，是對原有PCR 技術(shù)的一大變革[11-12]。多重實(shí)時(shí)熒光PCR，是在一個(gè)PCR 管中用多個(gè)熒光探針來區(qū)分多個(gè)擴(kuò)增子，具有檢測效率高、內(nèi)控效果好的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)使用這一技術(shù)，設(shè)計(jì)針對H7 和N9 片段的特異性引物與探針，建立了能夠快速、高效檢測IV-H7N9 的熒光定量RT-PCR 方法。該方法特異性強(qiáng)、操作便捷，能夠?yàn)榭刂屏鞲幸咔闋幦r(shí)間。在實(shí)際操作過程中，熒光RT-PCR 方法中TaqMan 探針對于整個(gè)反應(yīng)體系至關(guān)重要。探針的雜交效率較高，但熒光淬滅難以徹底，探針?biāo)庖蕾囉赥aq酶的外切活性，定量時(shí)易受酶活性和試劑質(zhì)量影響[13-15]。本研究通過使用國家第二代人感染IV-H7N9 核酸檢測試劑國家參考品以及H1、H3、H5、H9 等核酸樣品檢測，證實(shí)該檢測方法的敏感性、特異性均為100%。

另外，禽類養(yǎng)殖場環(huán)境復(fù)雜以及取樣過程不能保證標(biāo)準(zhǔn)化操作等原因都可能造成結(jié)果偏差。同時(shí)，檢測過程中混入雜質(zhì)、其他病毒基因片段以及操作過程不穩(wěn)定等，也可能造成結(jié)果誤讀。本研究重復(fù)10 次檢測，發(fā)現(xiàn)H7 和N9 核酸參考品CV 均小于1%，提示本方法重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好。

綜上所述，本研究建立了一種熒光定量RTPCR 方法，能夠快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定檢測IV-H7N9，具有高度的靈敏性和特異性。