豬德爾塔冠狀病毒熒光RT-RAA快速檢測方法的建立及初步應(yīng)用

趙 平，秦毅斌，何 穎，盧冰霞，劉 芳，陳 櫻，韋祖樟，黃偉堅，趙 武，歐陽康

（1.廣西大學，廣西南寧 530005；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西南寧 530001）

豬德爾塔冠狀病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV），又名豬丁型冠狀病毒，屬尼多目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒亞科（Coronavirinae）冠狀病毒屬成員，是一種有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，基因組全長約25.4 kb[1]。PDCoV 引發(fā)的豬腸道疾病，在臨床癥狀上與豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）及傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起的癥狀相似，可引起仔豬水樣腹瀉、嘔吐等癥狀，嚴重的可導致仔豬死亡，也可引起母豬嘔吐、水樣腹瀉、食欲下降等癥狀[2-3]。

2012 年Woo 等[4]從我國香港地區(qū)豬腹瀉樣品中首次檢測到PDCoV；2013—2014 年，Dong 等[5]從國內(nèi)部分省市養(yǎng)豬場搜集糞便樣本進行PDCoV檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率達14.3%，證實我國內(nèi)地存在PDCoV；2012—2015 年Song 等[6]在江西省采集的356 份臨床樣本中，檢測發(fā)現(xiàn)PDCoV 陽性率高達33.71%。2014 年初，由PDCoV 感染所引起的豬腹瀉病在美國俄亥俄州豬場暴發(fā)，其致病毒株與我國香港地區(qū)發(fā)現(xiàn)的PDCoV 基因組序列相似度高達99%[7]。隨后美國、加拿大、泰國和韓國等國家也相繼從臨床樣本中檢測到PDCoV[8-10]。

針對PDCoV 導致的腸道性疾病，目前尚無預防疫苗和特效治療藥物。因此，建立特異性的檢測方法進行準確、快速診斷，完善監(jiān)測體系，對PDCoV 感染的防控具有重要意義[11]。

目前用于檢測PDCoV 的RT-PCR、免疫組織化學分析和間接ELISA 等方法均已建立，但這些方法操作繁瑣，耗時長，工作量較大，容易造成污染。本研究建立的熒光RT-RAA 方法具有敏感、特異、耗時短、操作簡便等優(yōu)點，適合臨床快速檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

PDCoV、PEDV、TGEV 等病毒的陽性樣品，由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所病毒室采集并保存；RNA 提取試劑盒，購于深圳真瑞生物科技有限公司；Plasmid Mini Kit 質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收DNA 純化試劑盒，購于廣州飛揚生物工程有限公司；pMD18-T 載體，購于寶生物工程（大連）有限公司；DH5α 感受態(tài)細胞，購自北京全式金生物有限公司；眾測RT-RAA 核酸擴增試劑（熒光型）試劑盒，購于杭州眾測生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 探針和引物設(shè)計 根據(jù)PDCoV（GenBank登錄號MN025260）N基因保守序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物（表1）。

表1 用于擴增PDCoV 基因組的引物

1.2.2 病毒基因組核酸提取 病毒RNA 提取按照試劑盒說明書操作。從臨床樣本中提取RNA，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 重組質(zhì)粒標準品構(gòu)建與鑒定 以提取的病毒RNA 為模板，使用引物進行RT-PCR 擴增，將擴增的目的片段純化后連接pMD18-T 載體；重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定，序列正確后，作為熒光RT-RAA的質(zhì)粒標準品。

1.2.4 反應(yīng)體系建立 按照RT-RAA 熒光反應(yīng)試劑盒使用說明操作。在反應(yīng)管中加入反應(yīng)緩沖液25.0 μL，正向和反向引物（10 μmol/L）各2.1 μL，探針（10 μmol/L）0.6 μL，模板1.0 μL，加雙蒸水16.7 μL 至47.5 μL，混合均勻；向每個反應(yīng)單元的管蓋內(nèi)側(cè)，加入2.5 μL 乙酸鎂溶液并混勻；將上述反應(yīng)管放置于QuantStudio 5 儀器中。反應(yīng)條件：39 ℃，30 min，每隔15 s 采集1 次熒光信號。

1.2.5 引物篩選 用設(shè)計的引物和探針，分別對PDCoV-N基因核酸進行熒光RT-RAA 擴增，以確定最佳引物。

1.2.6 反應(yīng)條件優(yōu)化 采用篩選的引物和探針，將其濃度依次配置為1、5、10、20、50 μmol/L。選取質(zhì)粒標準品為模板，在引物、探針不同濃度條件下進行熒光RT-RAA 擴增，以確定引物和探針的最佳反應(yīng)濃度。確定引物和探針的最佳濃度后，選取質(zhì)粒標準品作為模板，在不同溫度（37、39、41 ℃）條件下進行熒光RT-RAA 擴增，以確定最佳反應(yīng)溫度。

1.2.7 特異性試驗 按照核酸提取試劑盒說明，提取豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬輪狀病毒（PROV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）、豬圓環(huán)病毒（PCV2、PCV3）、豬瘟病毒（CSFV）、豬捷申病毒（PTV）以及TGEV、PEDV 等豬源病毒核酸，選取PDCoV 質(zhì)粒標準品作為陽性對照，對提取的核酸用建立的PDCoV 熒光RT-RAA 方法進行擴增，設(shè)ddH2O 為陰性對照，評估該方法的特異性。

1.2.8 敏感性試驗 以構(gòu)建的質(zhì)粒標準品為模板，按10 倍梯度依次稀釋為1010～101copies/μL 后，將其作為陽性標準品備用；以不同拷貝數(shù)的陽性質(zhì)粒分別作為模板，用建立的PDCoV 熒光RT-RAA 方法進行擴增，設(shè)ddH2O 為陰性對照，確定該方法的敏感性。

1.2.9 臨床樣品檢測 利用廣西獸醫(yī)研究所的68份豬源病毒樣品進行臨床應(yīng)用評價。使用RNA 提取試劑盒提取臨床樣本RNA，采用熒光RT-RAA方法和RT-PCR 方法對每份樣本核酸進行同步檢測，比較兩種檢測方法的敏感性。其中，RT-PCR方法反應(yīng)體系：ddH2O 8.5 μL，2×Bench TopTMTaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板3.0 μL?；旌想x心后放入PCR 儀中，并設(shè)置反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃50 s，40 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。用建立的PDCoV熒光RT-RAA 方法對臨床樣本進行擴增，根據(jù)眾測生物科技有限公司RT-RAA 核酸擴增試劑結(jié)果判定方法，Ct ≤30 判定為陽性，Ct ＞30 判定為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

引物篩選結(jié)果（圖1）顯示：第2 組引物探針（F1R2）在擴增時最先檢測到熒光信號，且熒光信號強，擴增時間短，擴增效果最好，因此選擇第2 組F1R2 引物、探針用于后續(xù)試驗。

圖1 熒光RT-RAA 不同PDCoV 引物擴增結(jié)果

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

當引物和探針濃度均為10 μmol/L 時，熒光信號最強，擴增曲線出現(xiàn)得最早，因此將其確定為最佳工作濃度（圖2）。當反應(yīng)溫度為39 ℃時，最早檢測到熒光信號，且反應(yīng)時間最短，因此將其設(shè)為最佳反應(yīng)溫度（圖3）。

圖2 熒光RT-RAA 不同引物濃度擴增結(jié)果

圖3 熒光RT-RAA 在不同溫度下的擴增PDCoV 結(jié)果

2.3 特異性試驗

試驗結(jié)果（圖4）顯示，只有PDCoV 質(zhì)粒DNA 出現(xiàn)擴增曲線，為陽性結(jié)果，其他樣本及陰性對照均沒有明顯擴增，均為陰性，表明本研究建立的PDCoV熒光RT-RAA檢測方法具有良好的特異性。

圖4 熒光RT-RAA 方法特異性試驗結(jié)果

2.4 敏感性檢測

以不同拷貝數(shù)的陽性質(zhì)粒分別作為模板，以建立的PDCoV 熒光RT-RAA 方法進行擴增，檢測結(jié)果如圖5 所示。擴增的起峰時間隨著拷貝數(shù)降低逐漸延長，峰值高度也隨著拷貝數(shù)降低而降低，最低檢出限可達101copies/μL，說明熒光RT-RAA 檢測法具有較高的敏感性。

圖5 熒光RT-RAA 擴增不同拷貝數(shù)PDCoV 重組質(zhì)粒結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測與評價

臨床樣品結(jié)果（表2）顯示：熒光RT-RAA方法的陽性檢出率為17.6%，而RT-PCR 方法為13.2%，表明本研究建立的熒光RT-RAA 檢測法敏感性高于RT-PCR 法。

表2 臨床樣品檢測結(jié)果

3 討論

PDCoV 對我國生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重威脅，給養(yǎng)殖戶造成了嚴重經(jīng)濟損失。目前，該病毒在國內(nèi)的感染率僅次于PEDV[11]，而其導致的臨床癥狀又與PEDV、TGEV 相似，再加上存在混合感染[12]，更增加了防治PDCoV 感染的困難。因此，建立一種快速檢測PDCoV 的方法十分重要。目前沒有針對PDCoV 的商品化疫苗和治療藥物，因而快速、準確診斷，盡早發(fā)現(xiàn)并處理染病豬，是防控PDCoV流行的重要和有效手段[13]。

目前，抗原檢測包括常規(guī)RT-PCR、巢式RTPCR、熒光定量RT-PCR、免疫細胞化學分析、高通量測序等，而抗體檢測主要是間接ELISA 法[14]。但是這些方法需要使用復雜的儀器和設(shè)施齊全的實驗室，還需要實驗人員花費時間探索穩(wěn)定反應(yīng)體系，且反應(yīng)時間偏長。而臨床快速檢測需要便攜、操作簡單而且耗時短的檢測方法。相較于抗原、抗體診斷這類傳統(tǒng)檢測技術(shù)，熒光RT-RAA 方法具有快速、靈敏、操作簡單、周期短等優(yōu)點。

本研究建立了一種可用于PDCoV 檢測的熒光RT-RAA 方法。在對熒光RT-RAA 最適反應(yīng)條件的摸索過程中發(fā)現(xiàn)，39 ℃時擴增曲線出現(xiàn)最早，反應(yīng)時間最短，因而最佳反應(yīng)溫度確定為39 ℃；當引物和探針濃度均為10 μmol/L 時，熒光信號最強，擴增曲線出現(xiàn)最早，因而最佳工作濃度確定為10 μmol/L。該方法在39 ℃恒溫下30 min 內(nèi)即可完成檢測，最低檢測限為101copies/μL，且與其他豬源病毒無明顯擴增。采用該方法檢測68 份臨床樣品，發(fā)現(xiàn)熒光RT-RAA 敏感性率高于RT-PCR方法。

本研究建立的這種檢測PDCoV 的熒光RTRAA 檢測方法特異性強，靈敏度高，操作簡單，反應(yīng)速度快，這為今后PDCoV 快速檢測提供了有效方法。