不同布魯氏菌血清學(xué)方法檢測(cè)牛羊血清抗體的比對(duì)

李盛瓊，侯 巍，莫 茜，袁東波，尹 杰，高 露，雷曉琴，陽(yáng)愛(ài)國(guó)

（1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川成都 610041；2.蒼溪縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川蒼溪 628400）

布魯氏菌?。ㄒ韵潞?jiǎn)稱布病）是由布魯氏菌屬細(xì)菌感染引起的一種人獸共患傳染病。動(dòng)物布病主要見(jiàn)于羊、豬、牛、犬，主要臨床表現(xiàn)為生殖器、胎膜發(fā)炎，以致流產(chǎn)、不育以及各種組織的局部病灶，給我國(guó)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失（每年因布病減少幼畜105 萬(wàn)～140 萬(wàn)頭）。全世界每年因人畜布病造成數(shù)十億美元的損失[1]。

由于牲畜的自由買賣，跨區(qū)域調(diào)運(yùn)，近年來(lái)布病疫情出現(xiàn)了一定的回升[2]，因此需要加強(qiáng)布病監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，監(jiān)視疫情變化，做好預(yù)防與診斷。布病的實(shí)驗(yàn)室診斷是布病研究的重點(diǎn)和難題。血清學(xué)診斷方法雖然存在一定的假陽(yáng)性、假陰性現(xiàn)象，但因其操作簡(jiǎn)單、試劑易保存、生物風(fēng)險(xiǎn)小、適用性廣，得以廣泛應(yīng)用。本研究采用試管凝集試驗(yàn)（SAT）、競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）、熒光偏振試驗(yàn)（FPA）3 種常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)方法，對(duì)已知感染情況的92 份牛血清、92 份羊血清進(jìn)行布魯氏菌抗體檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，比較這3 種血清學(xué)檢測(cè)方法的檢測(cè)性能，以期為布病血清學(xué)方法的選用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測(cè)試劑 布魯氏菌試管凝集試驗(yàn)抗原，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；布魯氏菌競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心；布魯氏菌熒光偏振檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自新疆恒利達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 血清樣本 血清樣本為本中心保存的已知感染情況的牛、羊血清，各92 份。

1.1.3 設(shè)備與耗材 96 孔酶標(biāo)儀，Bio-Rad 公司產(chǎn)品；37 ℃恒溫箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；單道微量移液器和多道微量移液器，Transferpette 公司產(chǎn)品；一次性移液器吸頭，Axygen 公司產(chǎn)品；熒光偏正儀（SynergyTMH1），美國(guó)Ellie 公司產(chǎn)品；硼硅玻璃試管，新疆恒利達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方法 SAT 按照GB/T18646—2018 進(jìn)行操作與判定，cELISA、FPA 按試劑操作說(shuō)明書進(jìn)行操作和結(jié)果判定。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)采用 Excel 處理，用 SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用假陽(yáng)性率、假陰性率、一致率和Kappa 值4 種分析指標(biāo)。假陽(yáng)性率，即在確診的陰性樣本中，用該方法檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)與確診陰性數(shù)的百分比；假陰性率，即在確診的陽(yáng)性樣本中，用該方法檢測(cè)陰性數(shù)與確診陽(yáng)性數(shù)的百分比；一致率，試驗(yàn)判定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)診斷結(jié)果相同數(shù)占總檢測(cè)數(shù)的比例；Kappa 值，是一致性統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，Kappa 值≥0.75 說(shuō)明兩種方法診斷結(jié)果一致性較好，0.4 ≤Kappa 值＜0.75 說(shuō)明一致性一般，Kappa 值＜0.4 說(shuō)明一致性不夠理想。

2 結(jié)果

2.1 牛血清樣品檢測(cè)

采用SAT、cELISA、FPA 對(duì)92 份已知感染情況的牛血清（47 份陽(yáng)性、45 份陰性）進(jìn)行檢測(cè)，比較其敏感性和特異性。結(jié)果（表1）顯示：通過(guò)Kappa 檢驗(yàn)，cELISA、FPA 的Kappa 值均大于0.75，SAT 的Kappa 值小于0.75；SAT 的假陰性數(shù)為12 份，假陰性率為25.53%，cELISA 和FPA 假陽(yáng)性數(shù)均為1 份，假陽(yáng)性率均為2.22%。

表1 牛血清樣品SAT、cELISA、FPA 血清學(xué)檢測(cè)檢測(cè)比較結(jié)果

2.2 羊血清樣品檢測(cè)

采用SAT、cELISA、FPA 對(duì)92 份已知感染情況的羊血清（13 份陽(yáng)性、79 份陰性）進(jìn)行檢測(cè)，比較其敏感性和特異性。結(jié)果（表2）顯示：3 種檢測(cè)方法的Kappa 值均大于0.75。SAT 和cELISA的假陰性數(shù)均為1 份，假陽(yáng)性率均為7.69%；cELISA 和FPA 的假陽(yáng)性數(shù)均為1 份，假陽(yáng)性率均為1.27%。

表2 羊血清樣品SAT、cELISA、FPA 血清學(xué)檢測(cè)檢測(cè)比較結(jié)果

3 分析與討論

實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果可為布病臨床診斷提供依據(jù)。如果因?qū)嶒?yàn)室診斷結(jié)果假陽(yáng)性率偏高而造成誤診，那么陰性畜的誤殺會(huì)造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失；如果因?qū)嶒?yàn)室診斷結(jié)果的假陰性率偏高而造成漏診，那么會(huì)為病原擴(kuò)散和疾病蔓延提供機(jī)會(huì)，且不利于布病凈化。無(wú)論是誤診還是漏診，都會(huì)造成養(yǎng)殖戶恐慌與經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全。

假陽(yáng)性率能反應(yīng)試驗(yàn)方法的特異性，假陽(yáng)性率越低，特異性越高。本試驗(yàn)對(duì)3 種血清學(xué)檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)牛羊血清的SAT 假陽(yáng)性率均為0，說(shuō)明該方法具有較高的特異性。假陰性率能反應(yīng)試驗(yàn)的敏感性，假陰性率越低，敏感性越高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，牛羊血清樣品的SAT 檢測(cè)結(jié)果假陰性率較高，說(shuō)明其敏感性較低。SAT 方法簡(jiǎn)便、特異性高，因此在臨床上得到廣泛應(yīng)用，也是我國(guó)布病確診的常用方法[3]。但SAT 方法結(jié)果判定需要20 h 以上，況且通過(guò)肉眼觀察比較渾濁度，易受人為因素干擾，因此不適于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用與大批量樣品檢測(cè)。敏感性不高是SAT 的主要缺陷，但因其具有較高的特異性，所以在幾個(gè)已宣稱為“無(wú)布病”國(guó)家的布病根除運(yùn)動(dòng)中得到了良好應(yīng)用。雖然SAT不再是OIE 推薦的牛布病檢測(cè)方法，但其依然被廣泛應(yīng)用于人類布病檢測(cè)[4]。

cELISA 具有較高的特異性，可以區(qū)分自然感染和免疫[5]。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，cELISA 的一致性、特異性、敏感性均有較優(yōu)表現(xiàn)。此方法操作簡(jiǎn)便，一次可完成大量樣品檢測(cè)，既可作為篩選試驗(yàn)應(yīng)用于動(dòng)物群體檢疫，也可作為布病確診試驗(yàn)，2018年被我國(guó)納入布病法定檢測(cè)方法。相對(duì)而言，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，cELISA 檢測(cè)結(jié)果更為可靠[6]。

FPA 試驗(yàn)結(jié)果顯示，其敏感性達(dá)到100%，特異性達(dá)到97%以上，表明FPA 作為篩選試驗(yàn)用于布病檢測(cè)有較好的應(yīng)用前景[7]。該方法敏感性較好，不容易造成漏檢，其一致性和特異性也表現(xiàn)較好；整個(gè)過(guò)程在單個(gè)試管的溶液內(nèi)進(jìn)行，無(wú)需沉淀和洗滌，分析時(shí)間只需幾分鐘。FPA 與ELISA 比較，反應(yīng)時(shí)間短，省去了洗板和孵育時(shí)間，但需要特定儀器進(jìn)行測(cè)定，不適合基層推廣。任燕斌[8]等統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PA 在臨界值為95 mP 時(shí)，其敏感性達(dá)到100%、特異性為99.6%，認(rèn)為可以把FPA檢測(cè)技術(shù)作為動(dòng)物布病診斷方法之一，且在田間條件下，作為動(dòng)物布病的篩選試驗(yàn)，可以快速、準(zhǔn)確診斷布病，避免二次抓捕動(dòng)物。

經(jīng)上，為了降低繁重的工作量，可以先采用價(jià)格低廉、操作比較簡(jiǎn)便的SAT 進(jìn)行篩選，再用特異性較好的cELISA 或FPA 復(fù)核，進(jìn)行聯(lián)合診斷較為理想。