一例七彩山雞異刺線蟲感染的臨床診斷及其分子生物學鑒定

黃瀟航，彭佳佳，李詩藝，賀金峪，王詩晨，黃志堅，黃 瑜，殷光文

（1.福建農(nóng)林大學動物科學學院，福建省動物藥物工程實驗室，福建福州 350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州 350013）

七彩山雞（Phasianus colchicus）是我國飼養(yǎng)規(guī)模較大的特種經(jīng)濟禽類，具有體型大、生長快、產(chǎn)蛋多、抗病力強等特點[1]。半舍飼養(yǎng)是七彩山雞較為常見的養(yǎng)殖模式，能夠為山雞提供充足的活動空間，更好地模擬野外環(huán)境，但也容易造成食源性寄生蟲感染的問題。

異刺線蟲是雞及常見人工繁育雉科鳥禽常見的消化道寄生蟲。國內已經(jīng)報道了包括白冠長尾雉[2]、孔雀[3]等多種圈養(yǎng)雉科鳥類異刺線蟲病的臨床案例。張敏等[4]在對紅腹角雉異刺線蟲病臨床病理研究中發(fā)現(xiàn)，病禽盲腸病理表現(xiàn)為出血嚴重，固有層大量單核細胞浸潤，形成慢性彌漫性盲腸炎等病變，在臨床上具有較大的生產(chǎn)危害。在臨床診斷上，可通過活體蟲卵形態(tài)學鑒定，但檢測結果容易與雞蛔蟲卵混淆，因此需要對蟲卵進行分子生物學鑒定。

本研究就一例家養(yǎng)七彩山雞疑似感染寄生蟲病例進行病因判定，通過臨床癥狀觀察和病理剖檢，運用光學顯微鏡對蟲體進行形態(tài)學觀察后進行分子生物學鑒定，以期為該類寄生蟲病的臨床鑒別與診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例介紹

福建省某居民庭院飼養(yǎng)的七彩山雞出現(xiàn)精神不振、慢性消瘦、采食量下降、腹瀉等癥狀，起初懷疑為球蟲感染，使用三字球蟲粉治療但效果不佳，隨后發(fā)生死亡，后推斷可能為消化道蠕蟲病。

1.2 臨床診斷

對死禽進行剖檢，檢查呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等部位，觀察肝、心等部位是否存在明顯的病理形態(tài)學變化，檢查食道、胃、腸等消化器官內是否有寄生蟲。刮取出現(xiàn)明顯病變部位的腸道內容物做生理鹽水涂片，觀察是否存在寄生蟲感染。采集患病山雞病理組織樣品，使用5%的甲醛溶液浸泡固定后，送往福州都拜特生物科技公司進行蘇木精-伊紅染色切片（HE）的制備與觀察。

1.3 分子生物學鑒定

使用DNA FAST KIT 試劑盒（美國MP Biomedicals 生物公司生產(chǎn)）提取目的蟲體基因組，參照文獻[5] 報道的線蟲通用引物（NEMF1：5'-CGCAAATTACCCACTCTC-3'；S3：5'-AGTCAAATTAAGCCGCAG-3'）擴增分離株18S rRNA。聚合酶鏈式擴增反應體系為25.0 μL：ddH2O 8.5 μL，TaqMix 酶 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板2.0 μL；反應程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。通過電泳篩選陽性條帶后進行切膠回收測序，與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的生物信息進行比較。擴增條帶使用膠回收試劑盒回收純化后，送往福州鉑尚生物公司測序。

2 結果與分析

2.1 臨床剖檢

臨床病理剖檢發(fā)現(xiàn)，除腸道出現(xiàn)較為明顯肉眼眼觀病變外，肝、心等未見明顯病變；對肺、肝、腸等臟器進行涂片觀察，未觀察到原蟲；對腸道進行觀察，發(fā)現(xiàn)直腸充血腫大（圖1-A），盲腸分叉部位出現(xiàn)黑腫，腸壁上可觀察到有蟲體蠕動，盲腸內容物中有大量白小短棒狀線蟲（圖1-B），腸內壁有線蟲穿孔寄生（圖1-C）。以上說明消化道線蟲的寄生感染對病禽消化道造成了較為嚴重的損害，從而導致病禽消化系統(tǒng)出現(xiàn)問題。

圖1 臨床病理剖檢圖

2.2 蟲體外觀

蟲體外觀為白色短線狀蟲體，長度為0.85～1.36 cm。部分蟲體在盲腸內形成盤曲狀（圖2-A）；在盲腸部分內容物中可觀察到大量蟲體，在生理鹽水中活動性較強（圖2-B）。光鏡下可觀察到蟲體頭端略向一側彎曲（圖2-C），頭部及吻部形態(tài)粗大，食道較粗（圖2-D）。雄蟲尾刺細長，末梢尖銳，后有膨大部位（圖2-E）；雌蟲體內可觀察到大量蟲卵，外觀為橢圓形，內部含有分化的細胞結構（圖2-F）。結合病變部位和寄生蟲形態(tài)學初步判斷，病禽感染的消化道線蟲為異刺線蟲。

圖2 蟲體的形態(tài)特征

2.3 病理組織學觀察

盲腸內可以觀察到大量的嗜酸性粒細胞（黃色箭頭），黏膜層可見多處上皮細胞壞死脫落，核碎裂（圖3-A）；小腸病理組織切片中，固有層多見腸腺間距增寬（綠色箭頭），局部可見少量淋巴細胞浸潤（圖3-B）。綜上，病理切片結果表明線蟲寄生對七彩山雞消化道造成了較為嚴重的機械損傷，并伴有炎性反應。

圖3 腸道病理組織切片觀察結果

2.4 分子生物學鑒定

2.4.1 PCR 擴增產(chǎn)物鑒定 18S rRNA 擴增條帶為750～1 000 bp，陽性條帶明顯。陰性對照使用高壓過的蒸餾水（ddH2O）添加引物體系加樣，未出現(xiàn)條帶擴增（圖4）。綜上，成功擴增獲得七彩山雞異刺線蟲（ZZ 株）目的片段。

圖4 凝膠電泳成像圖

2.4.2 序列分析與比較 ZZ 株18S rRNA 序列分析顯示，長度大小為760 bp，擴增獲得的18S rRNA 堿基中A、T、C、G 含量依次為26%、28%、27%、19%。通過DNAstar 7.0 分析軟件與NCBI 數(shù)據(jù)庫中異刺線蟲等蟲種的18S rRNA 序列對比發(fā)現(xiàn)，ZZ 株同源性與雞異刺線蟲（Heterakis gallinarum）DQ503462.1 蟲株最為接近，除了存在5 個位點的堿基缺失外，其余堿基排序一致，提示18S rRNA 在異刺線蟲種群遺傳上的保守性。通 過NCBI 數(shù)據(jù)庫的BLAST 比對發(fā)現(xiàn)，ZZ 株的18S rRNA 序列同源性也最接近于雞異刺線蟲DQ503462.1 蟲株，其次是雞異刺線蟲MK844591.1蟲株、蛔蟲（Ascaridia nymphii）LC057210.1 蟲株，同源性依次為99.61%、99.47%、99.08%，同時也與其他蟲種具有較高的基因相似性。進化樹構建與分析結果（圖5）顯示，分離獲得的ZZ 株18S rRNA 同源性與雞蛔蟲（EF180058.1）、鴿蛔蟲（LC057210.1）等盡管存在超過90%的相似性，但在進化樹分支構建上卻與它們形成了明顯的群落間分支。ZZ 株的18S rRNA 與國內報道的雞異刺線蟲DQ503462.1、MK844591.1 蟲株聚于一支。

圖5 禽異刺線蟲18S rRNA 進化樹

3 討論

異刺線蟲會造成禽類盲腸部腫大、壞死等癥狀，嚴重寄生時蟲體產(chǎn)生的毒素等也會導致宿主中毒，同時存在誘發(fā)組織滴蟲病的可能[6]。此外，異刺線蟲多量寄生造成的腸道機械性損傷還可繼發(fā)細菌感染，嚴重危害禽類的生產(chǎn)性能，甚至群體健康。本次剖檢發(fā)現(xiàn)，線蟲蟲體鉆入寄生部位引起腸道出血等癥狀，臨床病變提示腸炎。病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)，七彩山雞異刺線蟲寄生感染導致其腸道出現(xiàn)大量的炎性灶浸潤、嗜酸性粒細胞增殖，在盲腸切片中可以觀察到蟲體，但在心、肝、脾、肺等部位的病理變化并不顯著。這提示七彩山雞異刺線蟲感染的危害主要體現(xiàn)在對消化系統(tǒng)的損傷，這也是導致七彩山雞死亡的主要原因。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，異刺線蟲卵與蛔蟲卵存在較高的相似度，在寄生蟲知識儲備不足的情況下容易發(fā)生混淆。分子生物診斷技術近年來受到動物分類學界廣泛關注，其中18S、12S 等遺傳區(qū)間因其序列特點而被應用于蠕蟲等病原生物的種群遺傳演化上。本研究在傳統(tǒng)臨床診斷基礎上，進一步對分離獲得的七彩山雞消化道內線蟲18S rRNA進行分子生物學鑒定，發(fā)現(xiàn)其與雞源異刺線蟲DQ503462.1、MK844591.1 蟲株同源性較高，與雞蛔蟲等其他禽類線蟲分屬于不同的進化樹分支。國內對禽異刺線蟲的診斷案例以形態(tài)學鑒定為主，而分子鑒定和病理學研究較少。本研究在傳統(tǒng)診斷基礎上，從病理組織學、分子生物學方面綜合鑒定確診了七彩山雞的異刺線蟲感染，為該地特種禽殖提供了寶貴的異刺線蟲病診斷資料。

異刺線蟲感染對七彩山雞具有較大的危害，在日常的飼養(yǎng)管理過程中，尤其是具有戶外散養(yǎng)經(jīng)歷的種群個體，應該給予適當?shù)尿屜x預防。在國內禽類異刺線蟲病臨床防治上，左旋咪唑等傳統(tǒng)驅蟲藥等對異刺線蟲具有較好的驅殺效果[7]。在臨床治療中，除了應該考慮線蟲本身造成的宿主損傷外，還應考慮對可能發(fā)生的細菌繼發(fā)性感染、組織滴蟲病進行同步防治。在養(yǎng)殖管理方面，應該形成良好的驅蟲防疫觀念，根據(jù)各個飼養(yǎng)場地的實際情況定期驅蟲，加強禽舍衛(wèi)生管理，減少放養(yǎng)、混養(yǎng)等。這些措施對防控該病能夠起到一定的積極作用。