基于顯微光譜法的雙殼類海洋生物中微塑料的檢測(cè)方法研究

賀雨田，楊 頡，隋海霞，杜振霞*，宋 雁

（1．北京化工大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，北京 100029；2．國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100022）

微塑料通常指粒徑小于5 mm的塑料纖維、薄膜或顆粒［1］，按形成方式可分為初級(jí)微塑料和次級(jí)微塑料。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球塑料產(chǎn)量超過1億噸，9%～21%的塑料廢物被回收或焚燒，其余的塑料垃圾經(jīng)填埋或隨意排放在環(huán)境中，成為微塑料的重要來源。微塑料在自然環(huán)境中廣泛存在，據(jù)報(bào)道，在水［2－3］、土壤［4－5］、空氣［6－7］、生物體［8－9］、飲用水［10］、茶包［11］等介質(zhì)中都檢出了微塑料。2019年的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，中國(guó)海洋表層水體漂浮垃圾平均個(gè)數(shù)為4 027個(gè)/平方千米。受塑料自身結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響，微塑料在自然環(huán)境中難以降解，并且由于具有高疏水性和較高的比表面積，其表面易吸附周圍環(huán)境污染物和病原體，甚至可能通過食物鏈傳遞、富集，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成威脅，產(chǎn)生的環(huán)境污染與毒害問題不容小覷［12－16］。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)微塑料的研究越來越重視。2014年的首屆聯(lián)合國(guó)環(huán)境大會(huì)上，海洋中的塑料垃圾問題被列入“十大緊迫環(huán)境問題”，并對(duì)微塑料提出了特別關(guān)注；2016年第二屆聯(lián)合國(guó)環(huán)境大會(huì)決議指出，塑料碎片對(duì)海洋環(huán)境和生物多樣性造成極大損害；2020年7月，九部委聯(lián)合印發(fā)《關(guān)于扎實(shí)推進(jìn)塑料污染治理工作的通知》，明確規(guī)定了塑料制品的使用和處理的禁限期限。

目前，根據(jù)粒徑大小，可將對(duì)微塑料檢測(cè)方法的研究分為對(duì)納米級(jí)別的微塑料（納米塑料）和微米級(jí)別的微塑料的研究。對(duì)于納米級(jí)微塑料，常使用拉曼鑷子［17］、掃描電鏡［11］和熱解/氣相色譜－質(zhì)譜［18］等方法進(jìn)行研究，如茶包浸出液［11］、回收塑料［19］釋放出的納米顆粒等。對(duì)微米級(jí)的微塑料，主要使用光譜法［20－22］、染色法［23－25］、質(zhì)譜法［18］和掃描電鏡［11］等方法進(jìn)行研究。此外，關(guān)于微塑料的研究還包括微塑料的前處理方式［26］等方面。報(bào)道中對(duì)微塑料的研究很多，但缺乏從前處理到檢測(cè)等系統(tǒng)性的研究。本研究以貽貝（評(píng)估海洋微塑料污染的生物）為例，從整體出發(fā)，對(duì)微塑料前處理方式、濾膜選擇和光譜檢測(cè)方法等進(jìn)行研究，探究了雙殼類海洋生物中微塑料的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 樣品、試劑與儀器

2 mm×3 mm微塑料（聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene glycol terephthalate，PET，農(nóng)夫山泉瓶）；聚酰胺（Polyamide，PA，茶包）；聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC，文件袋）；聚苯乙烯（Polystyrene，PS，刷子把）；聚丙烯（Polypropylene，PP，蘿卜汁瓶）；高密度聚乙烯（High density polyethylene，HDPE，酸奶瓶）），50～1 000μm微塑料（PP/PA/PS/PET/PVC/HDPE，中聯(lián)塑化科技有限公司）。貽貝（周邊商場(chǎng)，購置后用鋁箔紙包裹并于-20℃下保存）。

胰蛋白酶（1∶250）、硝酸（69%）、鹽酸、氫氧化鉀、雙氧水（30%）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)用水為超純水?；旌侠w維素濾膜（MCE，3μm，47 mm，上海興亞凈化材料廠），聚四氟乙烯濾膜（PTFE，3μm，47 mm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

超純水系統(tǒng)（Milli-Q Advantage A10，Merck Drugs&Biotechnology），隔膜真空泵（GM-0．33A）、玻璃抽濾裝置（天津津騰試驗(yàn)設(shè)備公司），電子天平（CP225D，Sartorius公司），真空干燥箱（DZF-6050，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

傅里葉變換紅外顯微成像系統(tǒng)（Thermo Scientific Nicolet 8700）：測(cè)量模式為顯微全反射（ATR）和普通ATR模式，光譜范圍4 000～500 cm－1，掃描次數(shù)16次，光譜分辨率8 cm－1，空間分辨率10μm。顯微共焦激光拉曼光譜儀（Renishaw in Via）：掃描模式extended，激發(fā)光源785 nm，光柵1 200 l/mm，Renishaw 1024 CCD探測(cè)器，光譜范圍3 200～100 cm－1，曝光時(shí)間10 s，累計(jì)次數(shù)1次。

1.2 質(zhì)量控制

為避免環(huán)境中帶來的污染，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)人員穿白色棉質(zhì)工作服并佩戴丁腈手套；所有器皿在使用前均用超純水清洗3次。

1.3 消解條件考察

1.3.1 消解試劑選擇 將貽貝（3～4個(gè)）解凍，攪碎并置于干燥箱中60℃下干燥，稱取4份0．3 g肉沫分別置于4個(gè)燒杯（50 mL）中，依次加入20 mL硝酸（69%）、氫氧化鉀（10%）、雙氧水（30%）以及胰蛋白酶溶液（2 mg/mL），并根據(jù)表1中的條件進(jìn)行消解，每組平行3次。

表1 不同消解試劑的消解方式Table 1 The digestion method of different digestion reagents

消解后，將雙氧水、胰蛋白酶溶液、氫氧化鉀（先用鹽酸（10%）中和至pH 7．0）用混合纖維素濾膜（3μm）過濾；硝酸用聚四氟乙烯濾膜（3μm）過濾。過濾時(shí)為防止生物組織附著在器壁上，用2 mL超純水分別清洗燒杯和過濾器3次。其后用表面皿半遮蓋濾膜，使其自然風(fēng)干4 h，之后每0．5 h稱重一次，待兩次恒重后記錄數(shù)據(jù)。

消解效率通過過濾前后濾膜質(zhì)量的變化與最初貽貝肉的質(zhì)量比計(jì)算：

η：消解效率；Ma：濾膜初始質(zhì)量；Mb：使用并干燥后的濾膜質(zhì)量；Mc：初始貽貝肉質(zhì)量。

1.3.2 消解時(shí)間優(yōu)化 使用氫氧化鉀（10%）溶液，在40℃下對(duì)0．3 g貽貝肉進(jìn)行水浴消解，消解時(shí)間分別為6、9、12、24、36、48 h，每組平行3次，消解后采用“1．3．1”方法處理，計(jì)算消解效率。

1.3.3 不同種類雙殼類生物的消解 選擇青蛤、白蛤、文蛤、花甲和青口貝5種不同的雙殼類生物在最佳消解條件下進(jìn)行消解，消解后采用“1．3．1”方法處理，計(jì)算消解效率。

1.4 消解試劑對(duì)微塑料的影響

選擇2 mm×3 mm的PP、PA、PS、PET、PVC、HDPE微塑料，稱重并采集其初始紅外和拉曼光譜數(shù)據(jù)，隨后分別用硝酸（69%）、氫氧化鉀（10%）和雙氧水（30%）溶液在表1條件下進(jìn)行消解。消解后，稱重并采集紅外、拉曼光譜數(shù)據(jù)。

1.5 光譜檢測(cè)

為了確證分析方法的可靠性，制備了陽性模擬樣品：將冰箱中3～4個(gè)貽貝解凍后攪碎并置于干燥箱中（60℃）干燥，稱取0．3 g肉沫置于燒杯（50 mL）中并添加上述6種微塑料共計(jì)30個(gè)顆粒（20～1 000μm），磁力攪拌使肉沫和微塑料混勻后加入20 mL氫氧化鉀（10%）溶液，在40℃下水浴36 h。隨后使用混合纖維素濾膜（3μm）過濾，過濾時(shí)用2 mL去離子水清洗燒杯和過濾器各3次，避免微塑料附著在玻璃器壁上。干燥后用紅外和拉曼光譜儀進(jìn)行定性定量檢測(cè)和微塑料粒徑考察，并計(jì)算回收率，每組平行3次。

1.6 回收率考察

借助紅外（或拉曼）儀器的顯微鏡觀察尋找微塑料，采集其光譜數(shù)據(jù)以確定是否為添加的微塑料顆粒，并通過計(jì)數(shù)的方式計(jì)算其回收率。

1.7 典型樣品檢測(cè)

選擇青蛤、文蛤、白蛤、花甲和青口貝5種不同種類的雙殼類生物，使用氫氧化鉀（10%）在40℃下消解36 h，消解后采用“1．3．1”方法處理，使用顯微拉曼進(jìn)行定性定量檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 消解條件的確定

介質(zhì)包覆問題是海產(chǎn)品中微塑料檢測(cè)的關(guān)鍵，通常的解決方法是對(duì)包覆微塑料的介質(zhì)進(jìn)行消解。結(jié)合文獻(xiàn)，選取胰蛋白酶（2 mg/mL）溶液、氫氧化鉀（10%）、雙氧水（30%）以及硝酸（69%）為消解試劑進(jìn)行考察。其中，氫氧化鉀已廣泛應(yīng)用于浮游生物、魚類、牡蠣等海洋生物的樣品前處理［27］，具有對(duì)微塑料影響小且消解效率高的特點(diǎn)。Thiele等也明確氫氧化鉀適用于雙殼類生物的消解，并確定在40℃下消解最佳［27］。因此，根據(jù)文獻(xiàn)結(jié)果確定了相應(yīng)的消解條件，見表1。在表1的消解條件下，上述4種試劑的消解效率依次為（72．11±2）%、（97．86±2）%、（56．54±2）%、（96．97±2）%。氫氧化鉀（10%）的消解效率最好，硝酸次之。酶雖然對(duì)微塑料不產(chǎn)生影響，但其消解效率較低。室溫下雙氧水的消解效率低且對(duì)微塑料有一定影響，高溫下使用雙氧水消解時(shí)對(duì)微塑料影響過大［28］。由于使用硝酸消解后，PA被完全溶解，PET和PVC質(zhì)量明顯增加，PET形變彎曲且所有微塑料表現(xiàn)為不同程度的泛黃（圖1）；而使用氫氧化鉀（10%）消解后微塑料的質(zhì)量及其紅外和拉曼光譜基本不變，不影響微塑料的定性定量檢測(cè)。因此，采用氫氧化鉀（10%）對(duì)雙殼類海洋生物進(jìn)行消解。

圖1 硝酸消解前（A）后（B）微塑料的變化Fig．1 Changes of microplastics before（A）and after（B）digestion by nitric acid

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用氫氧化鉀（10%）在40℃下水浴消解36 h后，消解效率趨于平穩(wěn)，因此選擇氫氧化鉀（10%）于40℃下消解36 h。該條件下5種雙殼類生物的消解效率均高于97%，證實(shí)了消解方法的適用性。

2.2 過濾膜的選擇

金屬膜、氧化鋁膜或添加金屬鍍層的濾膜表面平整、不易彎曲變形且不產(chǎn)生紅外和拉曼譜線干擾，可用于拉曼和紅外光譜測(cè)定。但金屬膜和氧化鋁膜成本昂貴，添加金屬鍍層的濾膜需使用相應(yīng)設(shè)備進(jìn)行制備，難以作為常規(guī)用膜。進(jìn)行光譜檢測(cè)時(shí)，普通濾膜因反光透光能力弱，在紅外光譜中的噪音干擾大，不適用于反射和透射模式的檢測(cè)；而玻璃纖維素、混合纖維素、不銹鋼篩網(wǎng)的拉曼光譜背景譜線較為平整［29］，可用于紅外全反射（ATR）模式和拉曼光譜檢測(cè)?？紤]到過濾速度，應(yīng)選擇親水性好、水通量大且不易堵塞的混合纖維素膜或不銹鋼濾膜。但不銹鋼濾膜不透光且對(duì)光的反射不固定，只適用于紅外ATR成像和拉曼的檢測(cè)，因此使用混合纖維素濾膜的效果最佳。此外，濾膜孔徑越小可保留的微塑料粒徑越小，濾膜上的殘留物質(zhì)也越多，過濾速度越慢，因此需根據(jù)具體情況選擇合適的孔徑。因本研究顯微紅外和顯微拉曼可檢出的微塑料粒徑在3μm以上，故選用3μm的混合纖維素膜。

2.3 光譜檢測(cè)與回收率

微塑料常用的檢測(cè)方法有熱裂解氣相色譜－質(zhì)譜、染色法、光譜法等。其中，熱裂解氣相色譜－質(zhì)譜能對(duì)微塑料進(jìn)行定性定量檢測(cè)，但單次檢測(cè)量過小，更適用于納米微塑料；染色法能輔助檢測(cè)，但容易高估生物體內(nèi)的微塑料存在且無法定性分析，同時(shí)將生物體內(nèi)的微塑料和其他組織分開染色仍是一個(gè)考驗(yàn)。因此光譜法仍是最適于海洋生物中微塑料的檢測(cè)方法。光譜法可分為普通模式和成像模式兩種，其中成像模式下，顯微紅外成像適用于粒徑10μm以上的微塑料顆粒檢測(cè)［30］，并且若配置焦平面陣列可增加單次檢測(cè)面積，減少檢測(cè)時(shí)間；顯微拉曼則適用于粒徑1μm以上微塑料顆粒的檢測(cè)，且能檢出的微塑料數(shù)量高于顯微紅外［30］。但成像模式過于耗時(shí)且需搭配相應(yīng)的成像模塊，因此本研究在普通模式下進(jìn)行探索。

顯微紅外是微塑料分析的常用光譜檢測(cè)方法之一，一般可分為透射、反射和ATR 3種測(cè)試模式。微塑料的定性檢測(cè)過程中，使用金屬濾膜、氧化鋁濾膜可進(jìn)行反射、透射和成像模式的檢測(cè)，使用濾膜添加金屬鍍層也可在反射模式下檢測(cè)。而普通濾膜無法使光反射或透射，需采用ATR模式進(jìn)行測(cè)試。ATR模式可分為顯微ATR和普通ATR模式兩種。在顯微ATR模式下進(jìn)行微塑料檢測(cè)時(shí)，若微塑料表面平整，可與顯微ATR晶體緊密接觸，即可采集到樣品的紅外譜圖。當(dāng)濾膜凹凸不平或微塑料呈翹曲懸空狀態(tài)時(shí)，單點(diǎn)顯微ATR晶體很難與微塑料緊密接觸，導(dǎo)致無法采集信號(hào)，且單點(diǎn)ATR晶體所產(chǎn)生的壓力會(huì)破壞較易碎的微塑料。壓樣面積較大的ATR組件可使晶體與微塑料充分接觸，有效避免上述現(xiàn)象對(duì)檢測(cè)的影響，如PerkinElmer Spotlight 400的ATR組件。由于研究中ATR配件采樣面積小，其表面晶體較難與微塑料緊密接觸，無法采集到較好的紅外光譜圖，因此本研究借助顯微鏡，用鑷子取出顆粒，使用普通ATR進(jìn)行檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)采用在樣品臺(tái)側(cè)面補(bǔ)光的方式，可方便發(fā)現(xiàn)膜上的小顆粒。通過普通ATR檢出了所研究的6種微塑料（圖2），其粒徑分布為75～300μm。受微塑料尋找和顆粒轉(zhuǎn)移的限制，目前檢測(cè)粒徑下限為75μm。

圖2 普通ATR模式下檢出的微塑料Fig．2 Microplastics detected under ordinary ATRA．HDPE；B．PVC；C．PS；D．PP；E．PET；F．PA

顯微拉曼也是常用的微塑料光譜檢測(cè)方法之一。將待測(cè)濾膜置于樣品臺(tái)上，調(diào)節(jié)樣品臺(tái)位置聚焦并利用顯微鏡尋找微塑料顆粒，在普通單點(diǎn)掃描模式下采集待測(cè)樣品的拉曼光譜，檢出的6種微塑料及其拉曼光譜見圖3，其粒徑分布為15～300μm。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用拉曼檢測(cè)膜上的微塑料，當(dāng)測(cè)定小于15μm的顆粒時(shí)，因?yàn)V膜上殘留生物組織產(chǎn)生的熒光背景干擾或小顆粒拉曼散射太弱，將導(dǎo)致待測(cè)微塑料樣品無法檢出。因此，使用顯微拉曼單點(diǎn)檢測(cè)的粒徑下限為15μm。

圖3 顯微拉曼單點(diǎn)檢測(cè)模式下檢出的微塑料Fig．3 Microplastics detected in single-point detection mode of Raman microscopy A．HDPE；B．PS；C．PA；D．PP；E．PET；F．PVC

由于過濾時(shí)微塑料易附著在過濾器底部邊緣，造成微塑料顆粒的丟失，影響回收率。結(jié)果表明，添加的顆粒粒徑小于500μm時(shí)，回收率為70%；添加的顆粒粒徑大于500μm時(shí)，回收率可達(dá)100%；混合添加50～1 000μm的微塑料時(shí)回收率達(dá)83．3%。通過人工操作將微塑料從器壁轉(zhuǎn)移到膜上，回收率可達(dá)90%以上。

2.4 典型樣品檢測(cè)

通過拉曼光譜對(duì)疑似微塑料的顆粒進(jìn)行分析，青蛤、文蛤中平均有3．2個(gè)纖維狀物質(zhì)檢出，白蛤、花甲和青口貝中平均有2．5個(gè)透明物質(zhì)檢出，但均不是微塑料，可能是購買的貽貝所處環(huán)境微塑料污染輕微導(dǎo)致其未攝入微塑料顆粒。

3 結(jié) 論

本研究通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于海洋生物中微米級(jí)微塑料的檢測(cè)，采用氫氧化鉀在40℃下消解36 h最佳。在微塑料粒徑大且樣品量少的情況下，可使用顯微紅外ATR、成像模式和顯微拉曼單點(diǎn)檢測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)（可滿足75μm以上顆粒的檢測(cè)）；而微塑料粒徑小但樣品量少的情況下，用顯微拉曼單點(diǎn)檢測(cè)模式進(jìn)行測(cè)試的效果較好（可滿足15μm以上顆粒的檢測(cè)）。根據(jù)文獻(xiàn)［30－33］，對(duì)粒徑更小或樣品量大的情況，建議使用配有較好成像配件的顯微紅外或顯微拉曼儀器在成像模式下進(jìn)行檢測(cè)。