懷玉山高山馬鈴薯脫落酸和環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白基因的克隆和序列分析

尹明華，盧詠琪，羅懌文，潘巧玲，邱夢婷，蘇 格，譚佳思，涂 慧，蔡 紅，陳榮華

(1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001；2.上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 上饒 334001；3.上饒市薯芋類作物種質(zhì)保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 上饒 334001；4.上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，江西 上饒 334001；5.上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，江西 上饒 334700)

【研究意義】高山蔬菜是指在高山地區(qū)海拔較高的區(qū)域種植的蔬菜，生態(tài)、錯季、綠色、味美質(zhì)優(yōu)，深受廣大消費(fèi)者喜愛[1]。高山地區(qū)受海拔、地形以及地勢影響導(dǎo)致其生境比較惡劣，如強(qiáng)日輻射、紫外線強(qiáng)烈、晝夜溫差和濕度變化幅度較大、氣壓低、風(fēng)強(qiáng)、生長周期短等[2]。因此，高山蔬菜需要選擇抗逆好、抗病強(qiáng)、耐儲存、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的蔬菜品種。懷玉山高山馬鈴薯是種植于懷玉山區(qū)一種高山馬鈴薯，俗稱麻籽洋芋，為國家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品，只能適于高山地區(qū)種植，移種到平原地區(qū)容易造成品種變異，無法保證其原有的品質(zhì)和風(fēng)味[3]。懷玉山高山馬鈴薯是藥食兼優(yōu)的高山蔬菜。食用，營養(yǎng)全面，味甘可口；藥用，健脾利濕、降糖降脂[4]。2015年，馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略正式啟動，馬鈴薯成為我國第四大主糧作物。在此主糧化背景下，做大做強(qiáng)懷玉山高山馬鈴薯產(chǎn)業(yè)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】高山蔬菜在高海拔逆境脅迫誘導(dǎo)因子的作用下會產(chǎn)生、傳遞和翻譯高海拔逆境脅迫誘導(dǎo)信號，誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終產(chǎn)生一些誘導(dǎo)蛋白以全面提高其防御能力[5]。植物激素信號是通過一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)傳遞的，該網(wǎng)絡(luò)具有相當(dāng)大的串?dāng)_，有助于對環(huán)境響應(yīng)進(jìn)行所需的微調(diào)和調(diào)節(jié)，具生物活性的油菜素內(nèi)酯(BL)和脫落酸(ABA)在內(nèi)的油菜素類固醇激素(BR)主要參與植物的生長和發(fā)育以及植物的防御反應(yīng)[6]。脫落酸被認(rèn)為是控制植物對各種環(huán)境脅迫(包括水分虧缺、鹽分、傷害和低溫)適應(yīng)性反應(yīng)的常用介質(zhì)，脫落酸在重要的作用不僅是介導(dǎo)一些生理過程，如種子萌發(fā)和在不利環(huán)境條件下，在遺傳水平上也調(diào)節(jié)植物的適應(yīng)性反應(yīng)[7]，逆境脅迫發(fā)生時(shí)，ABA 與 ABA 結(jié)合蛋白快速結(jié)合，感知和傳遞環(huán)境信號，啟動植物體內(nèi)各種生理生化反應(yīng)，提高植物抗逆能力[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前在馬鈴薯克隆了“脫落酸、脅迫、成熟誘導(dǎo)基因”(Abscisic acid, stress, ripening inducible genes，ASR)[9-10]。關(guān)于馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白(abscisic acid and environmental stress inducible protein)未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究從構(gòu)建的懷玉山馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中挑選脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白基因序列，采用 RT-PCR技術(shù)克隆脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白基因的全長序列，并對脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白基因結(jié)構(gòu)和翻譯產(chǎn)物進(jìn)行生物信息學(xué)分析。此研究結(jié)果以期為進(jìn)一步研究脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白在懷玉山高山馬鈴薯在高山高海拔環(huán)境逆境脅迫中調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

懷玉山高山馬鈴薯試管苗(上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室提供)、Trizol 總 RNA 提取試劑、PCR 反應(yīng) 2 × GoldStarTaqMasterMix 購 自 北 京 康 為 世 紀(jì) 公司；M-MLV cDNA 第一鏈合成試劑、PrimeScript?RT Reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)、PMD18-T vector 及 SYBR?Premix ExTaqTM II 均購自TaKaRa 公司；Gel Extraction Kit 購自 Omega公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保存；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 總 RNA 的提取和 cDNA 第一鏈的合成

用Trizol 試劑提取懷玉山高山馬鈴薯試管苗的總 RNA，提取步驟按說明書進(jìn)行，使用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的濃度和完整性。以提取獲得的 RNA為模版，按照 M-MLV cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書合成 cDNA 第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄引物用 Oligo(dT)18 Primer：5′-GGCCACGC GTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具體步驟按說明書進(jìn)行。

1.3 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白基因基因的克隆

利用懷玉山高山馬鈴薯試管苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選到脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白基因基因的核心片段，運(yùn)用 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)基因特異性引物(F：ATGGCACAATACGGCAACCA；R：TCAATGCATCCCAGGGATCTT)。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；(95 ℃ 30 s；54 ℃ 30 s；72 ℃ 4 min 30 s)(35個循環(huán))；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的基因的條帶與 pMD19-T 載體連接并用熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，經(jīng)鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送往上海生工進(jìn)行測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

按照張林等[11]方法對懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白基因進(jìn)行氨基酸序列分析、理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測、功能分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷玉山高山馬鈴薯RNA 提取

由圖 1可以看出，RNA條帶清晰，無色素、蛋白、糖類等雜質(zhì)污染，28/23S亮度大于18/16S，濃度為602.00 ng/μL，總量為18.06 μg，RIN值=8.4，OD260/OD280=2.17，OD260/OD230=2.22，表明提取的RNA較為完整，質(zhì)量較高，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 懷玉山高山馬鈴薯總RNA電泳

2.2 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白基因cDNA序列

由圖2～4顯示，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)，懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白基因cDNA總長度為423 bp，G+C 含量為52.25%。

圖2 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白基因PCR擴(kuò)增

圖3 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白基因堿基組成

圖4 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白基因各堿基的比例

2.3 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白氨基酸序列

由圖5顯示，Protparam預(yù)測懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白由140個氨基酸組成，分子量14 534.01 Da，等電點(diǎn)7.07，為親水性蛋白。各氨基酸的數(shù)目和比例為Ala(A)(3，2.1%)、Arg(R)(5，3.6%)、Asn(N)(2，1.4%)、Asp(D)(7，5.0%)、Cys(C)(0，0.0%)、Gln(Q)(14，10.0%)、Glu(E)(9，6.4%)、Gly(G)(38，27.1%)、His(H)(7，5.0%)、Ile(I)(3，2.1%)、Leu(L)(1，0.7%)、Lys(K)(11，7.9%)、Met(M)(16，11.4%)、Phe(F)(0，0.0%)、Pro(P)(2，1.4%)、Ser(S)(7，5.0%)、Thr(T)(12，8.6%)、Trp(W)(0，0.0%)、Tyr(Y)(2，1.4%)、Val(V)(1，0.7%)、Pyl(O)(0，0.0%)、Sec(U)(0，0.0%)。帶負(fù)電殘基總數(shù)(Asp+Glu)為16，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為16。原子組成：碳(C)580，氫(H)942，氮(N)196，氧(O)210，硫(S)16；分子式：C580H942N196O210S16，原子總數(shù)：1944。消光系數(shù)：這種蛋白質(zhì)不含任何Trp殘基。經(jīng)驗(yàn)表明這可能導(dǎo)致計(jì)算消光系數(shù)的誤差超過10%。消光系數(shù)以M-1·cm-1為單位，在水中測量的280 nm處。外部系數(shù)2980，絕對值0.1%(= 1 g/L)0.205。估計(jì)半衰期所考慮序列的N端是M(Met)。估計(jì)半衰期為：30 h(哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞，體外)。>20 h(酵母，體內(nèi))。>10 h(大腸桿菌，體內(nèi))不穩(wěn)定指數(shù)：失穩(wěn)指數(shù)(II)計(jì)算為34.82，這將蛋白質(zhì)分類為穩(wěn)定的。

圖5 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白氨基酸序列

脂肪指數(shù)15.36，總平均親水性為-1.268。

2.4 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白親疏水性分析

從圖6可知，高峰值(正值)的區(qū)域表示疏水的區(qū)域，而負(fù)值的“低谷”區(qū)域是親水區(qū)域。疏水性結(jié)果分析表明，最大疏水值為0.3左右，在該多肽中說明該處的疏水性最強(qiáng)；親水峰最大值為-3左右，整個蛋白質(zhì)表現(xiàn)出高度的親水性，說明該蛋白為親水性蛋白質(zhì)。

圖6 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白親疏水值分布

2.5 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

由圖7顯示，GOR 預(yù)測顯示其二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋(Alphahelix，Hh，21.43%)、β-片層(Extendedstrand，Ee，24.29%)、無規(guī)則卷曲(Randomcoil，Cc，54.29%)構(gòu)成。從分布位點(diǎn)上來看，由圖8顯示，C端和N端含無規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋，且無規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋則散布于整個蛋白質(zhì)中。

圖7 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白二級結(jié)構(gòu)

藍(lán)色代表 α-螺旋；紅色代表β-片層；紫色代表不規(guī)則卷曲

2.6 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白三級結(jié)構(gòu)分析

由圖9顯示，SWISS-MODEL預(yù)測顯示懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白的三級結(jié)構(gòu)為單聚體。

圖9 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白三級結(jié)構(gòu)

2.7 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白亞細(xì)胞定位

圖10顯示，采用 Psort在線軟件對懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白基因的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果為定位于細(xì)胞核中的數(shù)量為10，細(xì)胞外的數(shù)量為2，細(xì)胞質(zhì)中的數(shù)量為1，質(zhì)膜中的數(shù)量為1，表明懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白主要存在細(xì)胞核中。

2.8 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

從圖11可見，懷玉山高山馬鈴薯與Solanumtuberosum(馬鈴薯)abscisic acid and environmental stress inducible protein TAS14-like、S.tuberosum(馬鈴薯)TAS14肽、S.tuberosum(馬鈴薯)abscisic acid and environmental stress inducible protein TAS14和Vibrioparahaemolyticus(副溶血性弧菌)hypothetical protein(假定蛋白)在一個大分支下，這說明懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白在進(jìn)化上與馬鈴薯和副溶血性弧菌的親緣關(guān)系較近，尤其是與馬鈴薯(S.ltuberosum)abscisic acid and environmental stress inducible protein TAS14-like在進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。

圖11 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 討 論

脫落酸(ABA)可以誘導(dǎo)一系列基因表達(dá)介導(dǎo)植物對環(huán)境的反應(yīng)壓力[12]。大麥(HordeumvulgareL.)的一個早期ABA誘導(dǎo)基因HVA22與其他ABA反應(yīng)基因如LEA(晚期胚胎發(fā)生豐富)和RAB(對ABA反應(yīng))基因幾乎沒有同源性，ABA和環(huán)境因素可誘導(dǎo)HVA22在營養(yǎng)組織中的表達(dá)壓力，如寒冷和干旱[13]。干旱脅迫下智利番茄葉片中鑒定出一個滲透脅迫和脫落酸應(yīng)答的內(nèi)切酶(EC 3.2.1.14)基因家族成員，966 bp全長cDNA(命名為pcht28)編碼一種帶有氨基末端信號肽的酸性幾丁質(zhì)酶前體，預(yù)測成熟蛋白含有229個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量24 943，pI值6.2。序列分析表明，pcht28與番茄和煙草中的Ⅱ類幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)具有高度同源性。pcht28蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)證實(shí)了它確實(shí)是一種幾丁質(zhì)酶。pcht28編碼的幾丁質(zhì)酶除了具有一般的防御功能外，還可能在水分脅迫下的植物發(fā)育或保護(hù)植物免受病原菌侵染方面發(fā)揮特殊作用[14]。脫落酸、脅迫和成熟誘導(dǎo)蛋白(ASR)是一類低分子量的植物特異性蛋白，芒果ASR基因的全長cDNA序列(MiASR)包含516個核苷酸的開放閱讀框(ORF)，編碼172個氨基酸殘基，可能參與芒果果實(shí)成熟和采后生理[15]。旱脅迫和脫落酸誘導(dǎo)的番茄基因le16包含單個開放閱讀框能夠編碼12.7 kDa的多肽，富含亮氨酸、甘氨酸和丙氨酸，等電點(diǎn)為8.7，氨基末端是疏水性的，具有信號序列的特征，其靶向多肽從細(xì)胞質(zhì)中輸出[16]。在擬南芥中，脫水反應(yīng)基因rd22的誘導(dǎo)是由脫落酸(ABA)介導(dǎo)的，rd22啟動子的67 bp DNA片段足以用于脫水和ABA誘導(dǎo)的基因表達(dá)，獲得了一個編碼MYC相關(guān)DNA結(jié)合蛋白的cDNA(rd22BP1)，編碼一個68 kd蛋白，具有典型的堿基區(qū)螺旋環(huán)螺旋亮氨酸拉鏈基序的DNA結(jié)合域。另外還獲取一個干旱和ABA誘導(dǎo)的基因可以編碼MYB相關(guān)蛋白ATMYB2，實(shí)驗(yàn)證明rd22BP1(MYC)和ATMYB2(MYB)蛋白在rd22基因的脫水和ABA誘導(dǎo)表達(dá)中都起轉(zhuǎn)錄激活作用[17]。利用噬菌體原位雜交技術(shù)，從干旱處理小麥幼苗cDNA文庫中克隆了一個水分脅迫誘導(dǎo)基因W89，全長cDNA 2392 bp，包含一個1896 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼631個氨基酸蛋白，保守區(qū)為DUF248(pfam03141)，W89與水稻脫水反應(yīng)蛋白BAD67956的同源性為66%[18]。經(jīng)低溫、干旱、鹽脅迫和傷害脅迫處理的紫花苜蓿幼苗，不經(jīng)高溫處理，會誘導(dǎo)產(chǎn)生與代表性cDNA相對應(yīng)的RNA(pUM90-1)，ABA和ABA類似物可以迅速誘導(dǎo)pUM90-1基因的表達(dá)，這些cDNA克隆可編碼一組可被ABA和多種環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)，并對應(yīng)于一個新的植物基因家族，即ABA和環(huán)境脅迫誘導(dǎo)基因[19]，并且其中一種苜蓿ABA和環(huán)境脅迫誘導(dǎo)基因的初級結(jié)構(gòu)被確定[20]。ABA和環(huán)境脅迫誘導(dǎo)基因Tas14在番茄儲存早期可以誘導(dǎo)表達(dá)，Tas14基因也被認(rèn)為是在ABA或環(huán)境脅迫下積累，可以與含有酸性磷脂的脂質(zhì)囊泡結(jié)合，清除羥自由基或?qū)χ|(zhì)膜具有抗過氧化保護(hù)作用[21]。馬鈴薯防御激素反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄參考圖譜也表明，ABA的應(yīng)用對馬鈴薯轉(zhuǎn)錄物豐度的影響最大，ABA共誘導(dǎo)492個基因，下調(diào)264個基因，植物中參與ABA途徑的基因被強(qiáng)烈上調(diào)，例如ABA和環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白TAS14(DMG400003530)上調(diào)1720倍[6]。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步充實(shí)了這個研究結(jié)果。在本研究中，懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白基因cDNA總長度為423 bp，G+C 含量為52.25%；懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白由140個氨基酸組成，分子量14 534.01Da，等電點(diǎn)7.07，為親水性蛋白；懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋(21.43%)、β-片層(24.29%)、無規(guī)則卷曲(54.29%)構(gòu)成；懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白的三級結(jié)構(gòu)為單聚體；懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白主要存在細(xì)胞核中；懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)蛋白在進(jìn)化上與馬鈴薯和副溶血性弧菌的親緣關(guān)系較近，尤其是與馬鈴薯(Solanumltuberosum)abscisic acid and environmental stress inducible protein TAS14-like在進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。