綠豆Dof家族基因的生物信息學(xué)分析及鹽脅迫下的表達(dá)分析

張文慧，杜吉到，賀登美，谷心茹，黃 勇，國(guó)鳳雙

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

【研究意義】綠豆(Vignaradiate)，豆科作物，在我國(guó)有兩千多年的栽培歷史。由于綠豆具有藥用、保健、營(yíng)養(yǎng)等價(jià)值，近年來(lái)人們對(duì)綠豆的需求呈上升的態(tài)勢(shì)，但在我國(guó)北方一些綠豆主產(chǎn)區(qū)受土壤鹽漬化、干旱等環(huán)境條件限制，綠豆產(chǎn)量維持在較低水平。因此，對(duì)綠豆的轉(zhuǎn)錄因子基因家族基因進(jìn)行分析，明確基因家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、探究其在綠豆生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆方面的功能非常必要。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中能夠感受鹽堿、低溫、干旱等外界環(huán)境以及體內(nèi)細(xì)胞發(fā)育的信號(hào)，通過(guò)一系列的信號(hào)傳遞啟動(dòng)下游相關(guān)功能基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最后通過(guò)基因產(chǎn)物對(duì)各種信號(hào)在生理生化等方面做出適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)反應(yīng)，因此，轉(zhuǎn)錄因子激活或抑制下游相關(guān)基因的表達(dá)是植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)及調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)發(fā)育的重要過(guò)程。Dof(DNA binding with one finger)家族是一個(gè)具有典型鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族，是植物中特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子[1-3]。它的DNA結(jié)合域是由52個(gè)氨基酸組成的C2-C2型鋅指結(jié)構(gòu)，可以特異性的識(shí)別并結(jié)合下游基因啟動(dòng)子中核心序列為“T/AAAAG”的元件，激活或抑制下游基因的表達(dá)[4-5]。Dof蛋白的羧基端序列保守程度很低，不同成員之間差異很大，可以不同的方式調(diào)控蛋白互作，增加了Dof蛋白功能的多樣性[6-7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，Dof家族基因已經(jīng)在擬南芥、水稻、大豆、玉米、甜瓜、番茄等多種植物中被分離鑒定出來(lái)[8-12]。Dof基因?qū)χ参锏纳L(zhǎng)發(fā)育、碳水化合物的代謝、細(xì)胞的防御反應(yīng)、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、種子萌發(fā)等方面都具有調(diào)控作用[13]。研究表明，甜瓜CmDof6、CmDof10和CmDof17基因可以被 PEG 脅迫顯著誘導(dǎo)[11]；轉(zhuǎn)番茄基因SlCDF1和SlCDF3的擬南芥植株提高了對(duì)鹽和干旱脅迫的抗性[14]；過(guò)表達(dá)OsDof12基因的水稻株系在長(zhǎng)日照條件下會(huì)導(dǎo)致花期提前[15]；玉米Dof家族基因參與玉米的生理發(fā)育過(guò)程，并且對(duì)氮代謝調(diào)控起著重要作用[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)Dof家族進(jìn)行了研究的作物主要包括水稻、玉米、大豆、高粱等，對(duì)綠豆Dof基因的研究則未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究在綠豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對(duì)綠豆Dof家族基因進(jìn)行鑒定，通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)Dof基因的染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、鹽脅迫下的表達(dá)模式等進(jìn)行分析。此研究為進(jìn)一步探究Dof基因在綠豆生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆方面的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 綠豆Dof家族基因的鑒定和生物信息學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)是在對(duì)吉綠10號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜索Dof基因，獲得Dof基因的Gene ID，利用Gene ID在NCBI的綠豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索獲得Dof基因序列。利用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域查找軟件https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi確定Dof蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，使用Bioedit軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。通過(guò)網(wǎng)站http://web.expasy.org/protparam/分析Dof蛋白的理化性質(zhì)；通過(guò)網(wǎng)站https://www.genscript.com/wolf-psort.html和http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/分別預(yù)測(cè)ERF蛋白的亞細(xì)胞定位和磷酸化位點(diǎn)數(shù)目及種類(lèi)；通過(guò)網(wǎng)站http://meme-suite.org/tools/meme 對(duì)Dof蛋白motif進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用TBtools軟件構(gòu)建綠豆Dof家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、分析Dof基因結(jié)構(gòu)，并將系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、蛋白基序分析結(jié)果可視化作圖。

1.2 綠豆和擬南芥Dof蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化及鹽脅迫下的表達(dá)分析

從 TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.arabidopsis.org/)獲得擬南芥Dof蛋白序列，用MEGA7.0軟件的鄰接法對(duì)綠豆和擬南芥Dof蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，Bootstrap 值設(shè)置為 1000，其他參數(shù)均為默認(rèn)值。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中Dof家族基因的FPKM值分析Dof家族基因在鹽脅迫下6、12和24 h的表達(dá)模式，并用R語(yǔ)言繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆Dof家族基因的鑒定及理化性質(zhì)分析

圖1顯示，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中Dof家族基因的Gene ID在NCBI綠豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得41個(gè)綠豆Dof基因序列，用BioEdit軟件對(duì)Dof蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)41個(gè)綠豆Dof的結(jié)構(gòu)域高度保守，且均含有1個(gè)CX2CX21CX2C基序，可進(jìn)一步形成C2-C2單鋅指結(jié)構(gòu)。因此，可以確定搜索到的41條基因均為綠豆Dof家族基因。按照這些基因在染色體上的位置，依次命名為VrDof1～VrDof41。

圖1 綠豆Dof基因保守結(jié)構(gòu)域多序列比對(duì)

由表1顯示，對(duì)41條綠豆Dof家族基因在染色體上的位置及理化性質(zhì)等進(jìn)行分析，Dof基因不均勻的分布在除6號(hào)染色體外的1～11號(hào)染色體上，1號(hào)染色體只有1條Dof基因、2號(hào)染色體包含3條、3號(hào)染色體2條、4號(hào)染色體5條、5號(hào)染色體2條、7號(hào)染色體10條、8號(hào)染色體2條、9號(hào)染色體2條、10號(hào)染色體5條，11號(hào)染色體3條，還有6條Dof基因沒(méi)有被定位在染色體上；Dof基因的CDS分布范圍為498～1506 bp，編碼的氨基酸數(shù)目在165～501之間，包含氨基酸殘基數(shù)目最少的為VrDof29(165個(gè))，最多的是VrDof10(501個(gè))；分子量大小在19.23～54.60 Kd；等電點(diǎn)在5.44～9.99。

表1 綠豆Dof家族基因的基本信息

2.2 綠豆Dof蛋白的亞細(xì)胞定位和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

由表2顯示，41個(gè)綠豆Dof蛋白的磷酸化位點(diǎn)數(shù)目分布在5～28之間，不同蛋白磷酸化位點(diǎn)數(shù)目差異很大，從3種磷酸化位點(diǎn)的數(shù)目上看，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)數(shù)目最多，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)次之，酪氨酸最少。亞細(xì)胞定位方面，所有41個(gè)Dof蛋白都定位在細(xì)胞核里。

表2 綠豆Dof蛋白的亞細(xì)胞定位和磷酸化位點(diǎn)分析

2.3 綠豆Dof家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

參考Lijavetzky等(2003)對(duì)擬南芥和水稻Dof家族基因的分類(lèi)方法[8]，用MEGA7.0軟件對(duì)鑒定出的41條綠豆Dof蛋白序列和分布在Dof各組的25條擬南芥蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖2)。與擬南芥的分類(lèi)結(jié)果略有不同，綠豆Dof家族蛋白可以被分為A、B1、B2、C1、C2.1、C2.2、D1和D2共8個(gè)組，沒(méi)有Dof成員和擬南芥的C3組蛋白聚集在一起(圖1)。不同組間成員分布不均，聚集到D1組的成員數(shù)目最多，共有11個(gè)綠豆Dof蛋白，其次是B2 組，包含8個(gè)綠豆Dof蛋白，最少的是D2組，只包含1個(gè)綠豆Dof蛋白。另外，A組包含4個(gè)綠豆Dof蛋白、B1組包含5個(gè)、C1組5個(gè)、C2.1組4個(gè)、C2.2組3個(gè)。擬南芥共有36個(gè)Dof蛋白，分布在D1組的成員最多，其次是B1組，分別為7個(gè)和5個(gè)，在整個(gè)擬南芥Dof家族中占比為19.4%和13.9%，與綠豆相似，綠豆成員最多的也是D1組，占比為26.8%，高于擬南芥的比例，其次是 B2組，占比為19.5%。

圖2 綠豆和擬南芥Dof家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 綠豆Dof家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化和保守基序分析

通過(guò)TBtools軟件對(duì)綠豆Dof家族蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖3-A)與圖結(jié)果一致，將綠豆Dof基因分為8個(gè)組。通過(guò)MEME對(duì)綠豆Dof家族蛋白的保守基序進(jìn)行分析(圖3-B)，結(jié)果鑒定出15個(gè)保守基序。其中，Motif1是Dof家族蛋白的結(jié)構(gòu)域，為綠豆Dof家族成員共有，可形成C2-C2單鋅指結(jié)構(gòu)。A組成員包含Motif1、9、11和12；B1組包含Motif1、6、10、14、15，其中Motif6不存在于其它組，為B1組特有；B2組成員主要含有Motif1和Motif11；C1組成員含有Motif1、10、13、14、15，其中13為C1組特有；C2.1組成員含有Motif1、10、12；C2.2組成員含有Motif1、12；14；D1組成員含有Motif1、2、3、4、5、7、8、9、12，除了Motif1和Motif12外，其余的7種Motif均為D1組特有；D2組只有1個(gè)成員，與B2組類(lèi)似，只含有Motif1。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分類(lèi)來(lái)看，同一組別內(nèi)的成員含有的保守基序種類(lèi)、數(shù)目和排列順序相似，不同組別之間包含的基序不同，大多數(shù)組別都有區(qū)別于其它組別的基序。

圖3 綠豆Dof家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化(A)、基因結(jié)構(gòu)(B)及保守基序(C)分析

2.5 綠豆Dof家族基因的結(jié)構(gòu)分析

利用TBtools軟件對(duì)綠豆Dof家族基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(圖3-C)，聚類(lèi)在同一組中的Dof基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)。綠豆Dof家族基因的外顯子在1～3個(gè)之間，除VrDof1和VrDof15外顯子數(shù)目為3個(gè)外，其余基因的外顯子都為1～2個(gè)。綠豆Dof家族基因的內(nèi)含子在0～2個(gè)之間，VrDof1和VrDof15含有2個(gè)內(nèi)含子，19個(gè)Dof基因含有1個(gè)內(nèi)含子，其余20個(gè)基因不含有內(nèi)含子。

2.6 綠豆Dof家族基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式分析

在本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的綠豆在鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中查找Dof家族基因表達(dá)的FPKM值，利用R軟件的pheatmap軟件包繪制基因表達(dá)熱圖(圖4)。由于VrDof20在正常條件下和鹽脅迫下都沒(méi)有表達(dá)，因此對(duì)除VrDof20外的40個(gè)基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。從圖4中可以看出，不同Dof基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式存在差異，從不同基因表達(dá)情況的聚類(lèi)分析來(lái)看，同一組中的Dof基因表達(dá)模式存在一定程度的相似性。如VrDof27、VrDof8和VrDof11在系統(tǒng)進(jìn)化分析中都劃分在B1組，而且它們?cè)邴}脅迫下表達(dá)模式相似；VrDof35、VrDof6、VrDof15和VrDof22同屬于D1組成員，也有相似的表達(dá)模式；C2.2組的3個(gè)成員VrDof5、VrDof24和VrDof36表達(dá)模式相似。

CK：正常生長(zhǎng)條件；T6：NaCl脅迫6 h；T12：NaCl脅迫12 h；T24：NaCl脅迫24 h

3 討 論

本研究從綠豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選到41條完整的綠豆Dof家族蛋白用于生物信息學(xué)分析。目前在擬南芥和水稻中分別鑒定出Dof家族蛋白36和30條、大豆78條、玉米46條、甜瓜34條、番茄34條[8-12]，而粗山羊草中只鑒定出10條[16]，說(shuō)明不同物種間存在較大差異，綠豆Dof家族蛋白的數(shù)量居中。選擇擬南芥Dof家族蛋白和綠豆Dof蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，綠豆Dof家族蛋白的聚類(lèi)結(jié)果和擬南芥相似，可以分為A、B1、B2、C1、C2.1、C2.2、D1和D2共8個(gè)組，較擬南芥少了C3組，這一結(jié)果與Lijavetzky等(2003)對(duì)水稻Dof家族基因系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果相似，水稻中也沒(méi)有C3組Dof成員[8]。對(duì)綠豆Dof基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，這些Dof基因的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，都有1～3個(gè)外顯子和0～2個(gè)內(nèi)含子，這一結(jié)果與前人對(duì)甜瓜、馬鈴薯等的研究結(jié)果相似[11, 17]，說(shuō)明不同物種的Dof家族基因具有高度的保守性。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分類(lèi)來(lái)看，同一組別內(nèi)的成員含有的保守基序種類(lèi)、數(shù)目和排列順序相似，并且同組內(nèi)的成員在基因結(jié)構(gòu)上也具有較高的保守性，因此，推測(cè)它們執(zhí)行相似的生物學(xué)功能。

蛋白的磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的重要機(jī)制，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要作用，前人的研究結(jié)果表明ERF蛋白及其它轉(zhuǎn)錄因子蛋白都可以通過(guò)磷酸化提高植物的抗逆能力[18-19]。本研究中41個(gè)蛋白含有5～28個(gè)磷酸化位點(diǎn)，說(shuō)明每個(gè)Dof蛋白都可能被特定的蛋白激酶磷酸化，從而激活相關(guān)基因的表達(dá)。對(duì)41個(gè)蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們都定位于細(xì)胞核上，說(shuō)明綠豆Dof蛋白都是在細(xì)胞核中對(duì)下游基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以適應(yīng)外界的環(huán)境變化。

Dof基因是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、開(kāi)花調(diào)控、應(yīng)答逆境脅迫和碳氮代謝調(diào)控方面發(fā)揮重要作用[20]。在大豆中，過(guò)表達(dá)大豆GmDof11基因可以提高大豆植株的分枝數(shù)和百粒重，同時(shí)也增加了大豆籽粒的含油量及產(chǎn)量[21]；研究表明水稻OsDof12基因參與調(diào)控水稻植株結(jié)構(gòu)的建成[22]；擬南芥AtDof4.1基因是轉(zhuǎn)錄抑制子，在擬南芥的開(kāi)花和生殖器官的發(fā)育等方面起抑制作用[23]；擬南芥CDF3基因可以被高鹽、高溫和干旱等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，CDF3基因的過(guò)表達(dá)可以提高擬南芥對(duì)滲透脅迫、低溫等的抗性[24]；番茄的SlCDF1-SlCDF5基因與擬南芥的CDF基因?qū)儆谕椿?，可以被鹽、干旱、低溫等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明這些基因參與了番茄的非生物脅迫響應(yīng)，而且SICDF1和SICDF3基因可以提高擬南芥植株的抗旱能力[25]。本文對(duì)綠豆Dof基因在NaCl脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除了VrDof20沒(méi)有表達(dá)外，其余40個(gè)基因在正常情況和鹽脅迫條件下都有不同程度的表達(dá)，但表達(dá)模式并不相同，呈現(xiàn)出上調(diào)和下調(diào)兩種不同的模式，說(shuō)明綠豆Dof基因響應(yīng)鹽脅迫，但不同表達(dá)模式的基因?qū)}脅迫的調(diào)控機(jī)制可能存在差異。

前人的研究結(jié)果表明，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以對(duì)不同物種中的同類(lèi)基因的功能預(yù)測(cè)提供有價(jià)值的理論依據(jù)，即系統(tǒng)進(jìn)化中聚類(lèi)在同一組的基因在基因結(jié)構(gòu)、蛋白的保守基序、基因的表達(dá)模式等方面都是相對(duì)保守的，因此，同組中的基因可能具有相似的生物學(xué)功能[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥A組的Dof成員AtDOF5.4/OBP4(AT5G60850)對(duì)擬南芥的細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控的作用，我們可以根據(jù)這一結(jié)果可以預(yù)測(cè)綠豆A組與AtDOF5.4同源性高的基因在細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)方面的生物學(xué)功能[28]。擬南芥ATDOF5.8(AT5G66940)屬于D2組成員，對(duì)鹽和干旱脅迫有明顯響應(yīng)，過(guò)量表達(dá)ATDOF5.8提高了擬南芥對(duì)非生物脅迫的抗性[29]，而綠豆D2組成員VrDof16可以響應(yīng)鹽脅迫，推測(cè)VrDof16可能對(duì)非生物脅迫有抗性，但需通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。