人體淚液中尼古丁的Schirmer試紙采集及原位質(zhì)譜檢測(cè)

狄丹丹，王昭涵，胡 斌

(1.暨南大學(xué)質(zhì)譜儀器與大氣環(huán)境研究所，廣東 廣州 510632；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

煙草燃燒的煙霧中含有大量有害物質(zhì)，吸煙被證實(shí)能夠誘導(dǎo)多種人體疾病的發(fā)生[1-3]，空氣中的二手煙霧會(huì)對(duì)人體的呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的健康產(chǎn)生影響[4-5]。人的眼睛每天長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣環(huán)境中，在有煙草煙霧時(shí)，人眼不僅會(huì)感覺不適[6]，還可能誘導(dǎo)產(chǎn)生多種眼部疾病并造成視力下降[7-8]。人體淚液中含有大量的水、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞因子以及代謝物，這些成分除了保持眼球潤(rùn)滑和免疫的生理功能，還能反映人體的生理病理狀態(tài)及環(huán)境暴露情況[9]。因此，通過(guò)對(duì)淚液中煙草特征成分的直接分析檢測(cè)，可以快速評(píng)估煙草煙霧在人眼的暴露水平。然而，由于人體淚液分泌量在微升級(jí)，常規(guī)的樣品采集與化學(xué)分析方法面臨巨大挑戰(zhàn)[10]，亟需無(wú)創(chuàng)、微量、高靈敏度的分析方法。

質(zhì)譜(MS)技術(shù)具有靈敏度高、特異性好和信號(hào)響應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn)，尤其是原位質(zhì)譜(ambient mass spectrometry)技術(shù)的發(fā)展，在無(wú)需或僅需簡(jiǎn)單樣品預(yù)處理的條件下，可以實(shí)現(xiàn)包括人體體液在內(nèi)的復(fù)雜樣品的原位分析[11-12]。以紙、木簽、金屬針等固相基底材料為電噴霧電離探針的原位質(zhì)譜技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、樣本消耗量少、分析速度快、靈敏度高等特點(diǎn)[13-15]，極大地推動(dòng)了臨床人體體液分析技術(shù)的發(fā)展。醫(yī)用Schirmer試紙用于臨床檢驗(yàn)干眼癥，具有安全、無(wú)創(chuàng)、吸水性好等特點(diǎn)，可以快速收集和測(cè)定微量體積的淚液[16]。在前期工作中，本課題組結(jié)合Schirmer試紙的無(wú)創(chuàng)采集與紙噴霧質(zhì)譜技術(shù)的特點(diǎn)，發(fā)展了基于Schirmer試紙的紙噴霧質(zhì)譜(PSMS)技術(shù)，探索了淚液成分的無(wú)創(chuàng)采集與質(zhì)譜分析[17]。

本工作將進(jìn)一步微小化Schirmer試紙，實(shí)現(xiàn)人體在煙草煙霧環(huán)境暴露下微量淚液的精準(zhǔn)無(wú)創(chuàng)收集，并采用紙噴霧質(zhì)譜方法測(cè)定煙霧的標(biāo)志物尼古丁。考察Schirmer試紙噴霧質(zhì)譜檢測(cè)尼古丁的靈敏度、精密度、回收率、定量檢測(cè)線性范圍等分析性能，以及人體淚液中尼古丁含量與在煙草煙霧環(huán)境暴露時(shí)間的關(guān)系和尼古丁的滯留動(dòng)力學(xué)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Q Exactive四極桿-靜電軌道高分辨質(zhì)譜儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品，配有納升電噴霧電離源(nano-ESI)及Xcalibur3.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，在正離子模式下采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.2 主要材料與試劑

尼古丁(NC)及其內(nèi)標(biāo)物尼古丁-d4(NC-d4)標(biāo)準(zhǔn)溶液：美國(guó)Cerilliant公司產(chǎn)品；醫(yī)用Schirmer試紙：遼寧梅茲林藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；香煙(盒標(biāo)煙氣煙堿量(即尼古丁)為1.2 mg/支)：廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；甲醇(HPLC級(jí))：北京百靈威科技公司產(chǎn)品。

1.3 采樣方法

將購(gòu)買的醫(yī)用Schirmer試紙(寬度5 mm，長(zhǎng)度40 mm)剪成帶有尖端的細(xì)紙條(寬度2.5 mm，長(zhǎng)度30 mm，尖端尺寸<0.1 mm)，示于圖1a；將紙條尖端輕輕觸碰眼角吸取淚液進(jìn)行無(wú)創(chuàng)采樣，示于圖1b，根據(jù)紙條濕潤(rùn)長(zhǎng)度測(cè)定收集的淚液體積。將健康志愿者流出的淚液收集到1.5 mL離心管中用于制備加標(biāo)樣品。本實(shí)驗(yàn)受試者在簽署了知情同意書后參加關(guān)于煙草煙霧暴露的研究和淚液采集及分析。

注：a.細(xì)化Schirmer紙條；b.人體淚液采集；c.Schirmer紙噴霧質(zhì)譜示意圖；d.Schirmer紙噴霧質(zhì)譜實(shí)物裝置圖1 Schirmer紙噴霧電離質(zhì)譜測(cè)定淚液Fig.1 Schirmer PSMS analysis of human tears

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1電離條件 將收集的紙條樣品靜置干燥后置于nanoESI裝置，試紙尖端與質(zhì)譜儀入口間的距離約4.0 mm，采用優(yōu)化的試劑(1.0 μL甲醇)和高壓電(3 kV)直接產(chǎn)生電噴霧電離后通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定，示于圖1c，實(shí)物裝置示于圖1d。

1.4.2質(zhì)譜分析 質(zhì)譜離子傳輸管毛細(xì)管溫度150 ℃。使用全掃描(Full MS)和平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(PRM)模式，分辨率分別為70 000和17 500，至少記錄30 s，掃描速率4.8次/秒，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500；對(duì)于MS/MS實(shí)驗(yàn)，隔離窗口設(shè)置為0.4 u。測(cè)定樣品的質(zhì)譜圖以空白Schirmer試紙?jiān)诩兗状紬l件下為背景信號(hào)進(jìn)行扣減。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

使用淚液配制濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/L尼古丁工作液，采用噴霧試劑甲醇配制內(nèi)標(biāo)物尼古丁-d4(濃度為10.0 μg/L)。測(cè)定并計(jì)算尼古丁與尼古丁-d4的信號(hào)比值，每個(gè)濃度測(cè)定3次，取平均值，根據(jù)信號(hào)比值與尼古丁濃度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 分析性能測(cè)試

在淚液中添加尼古丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制尼古丁濃度分別為3.0、15.0、30.0 μg/L的加標(biāo)樣品，采用加內(nèi)標(biāo)的甲醇作為噴霧試劑，測(cè)定尼古丁與尼古丁-d4的信號(hào)比，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算重現(xiàn)性，并與工作曲線比對(duì)，計(jì)算回收率。逐級(jí)稀釋尼古丁加標(biāo)的淚液，測(cè)得該方法的檢出限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10)。

2 結(jié)果與討論

2.1 淚液采集及電離條件考察

采用修剪好的Schirmer試紙測(cè)定0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 μL不同體積的淚液在紙條上潤(rùn)濕的長(zhǎng)度，觀測(cè)到淚液體積與濕潤(rùn)長(zhǎng)度具有線性關(guān)系，可用于淚液體積的定量分析，示于圖2a。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，滴加1.0 μL淚液即可獲得細(xì)化后的Schirmer試紙超過(guò)5.0 mm的潤(rùn)濕長(zhǎng)度，具有較大的擴(kuò)散度，滴加1.0 μL甲醇即可完全滿足噴霧電離實(shí)驗(yàn)的要求，噴霧持續(xù)時(shí)間超過(guò)1 min，示于圖2a插圖。此外，考察了1.0 μL含有1 ng尼古丁的淚液在2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 kV不同噴霧電壓下的信號(hào)響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)噴霧電壓在3.0 kV時(shí)，質(zhì)子化尼古丁[M+H]+m/z163.122 7的信號(hào)響應(yīng)最強(qiáng)，示于圖2b。

注：a.淚量與試紙濕潤(rùn)長(zhǎng)度的關(guān)系(插圖為1.0 μL淚液的信號(hào)持續(xù)時(shí)間)；b.電離電壓的優(yōu)化圖2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of experimental parameters

2.2 淚液中尼古丁的檢測(cè)

首先，使用Schirmer試紙噴霧電離質(zhì)譜分析0.1 μg/L尼古丁與尼古丁-d4的甲醇溶液，獲得質(zhì)子化尼古丁的特征信號(hào)峰(尼古丁m/z163.122 7，尼古丁-d4m/z167.147 5)，示于圖3a。對(duì)尼古丁與尼古丁-d4離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，其主要的碎片離子分別示于圖3b、3c。然后，使用修剪后的Schirmer試紙分別對(duì)暴露于正常環(huán)境與煙草煙霧環(huán)境下的志愿者眼淚進(jìn)行無(wú)創(chuàng)采樣，對(duì)采集淚液的試紙條進(jìn)行直接質(zhì)譜分析，同時(shí)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描和m/z163.116 9離子的二級(jí)質(zhì)譜掃描。在正常大氣環(huán)境下，人體淚液中未檢測(cè)到尼古丁離子的特征信號(hào)及其碎片離子，示于圖4a；在暴露于煙霧的淚液中檢測(cè)到尼古丁的特征離子m/z163.122 7，并且其碎片離子與尼古丁標(biāo)準(zhǔn)品一致，示于圖4b。

圖3 尼古丁與尼古丁-d4的一級(jí)質(zhì)譜圖(a)，尼古丁(b)和尼古丁-d4(c)的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MS spectrum of nicotine and nicotine-d4 (a), MS/MS spectra of nicotine (b) and nicotine-d4 (c)

實(shí)驗(yàn)還考察了尼古丁的定量檢測(cè)性能，示于圖4c。尼古丁在0.5～50.0 μg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(R2=0.991 8)，測(cè)得淚液中的尼古丁檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別為0.1 μg/L(S/N≥3)和1.0 μg/L(S/N≥10)。

為進(jìn)一步評(píng)估方法的穩(wěn)定性，配制低、中、高3個(gè)濃度水平的尼古丁加標(biāo)淚液，分別為3.0、15.0、30.0 μg/L，按照上述優(yōu)化方法分析測(cè)定，每個(gè)濃度平行操作5次，計(jì)算回收率和穩(wěn)定性，結(jié)果列于表1?？梢?，使用Schirmer紙噴霧電離質(zhì)譜分析檢測(cè)淚液中的尼古丁具有較好的精確度和穩(wěn)定性。

表1 尼古丁的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 1 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the nicotine (n=5)

2.3 煙草煙霧環(huán)境暴露淚液分析

本實(shí)驗(yàn)考察了4名成年不吸煙志愿者(3名女性和1名男性，年齡均在22～25歲之間)的淚液在煙霧環(huán)境下的暴露情況。在無(wú)風(fēng)靜態(tài)環(huán)境下，距離志愿者眼睛約40 cm處點(diǎn)燃一支香煙，人眼暴露在煙草煙霧環(huán)境中0.5、1.0、3.0、5.0、8.0 min后，立即采用細(xì)化的Schirmer 試紙進(jìn)行無(wú)創(chuàng)采樣，滴加1.0 μL 10.0 μg/L尼古丁-d4的甲醇溶液進(jìn)行紙噴霧電離質(zhì)譜檢測(cè)，并根據(jù)淚液采集量(1.0 μL)及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)的尼古丁濃度，繪制暴露時(shí)間與尼古丁濃度的條狀圖，示于圖5a。人體淚液中尼古丁的濃度隨暴露時(shí)間的增加而增加，一支煙燃盡(約8.0 min)時(shí)，暴露在人淚液中的尼古丁濃度達(dá)到45.0 μg/L左右，暴露于眼睛的煙堿占煙草煙霧總煙堿的3.75×10-6%(根據(jù)盒標(biāo)煙氣煙堿含量1.2 mg/支)，表明煙草煙霧中尼古丁在人眼中有較高的環(huán)境暴露水平。

注：a.未暴露于煙草煙霧環(huán)境的淚液質(zhì)譜圖(插圖為m/z 163.116 9離子的二級(jí)質(zhì)譜圖)； b.暴露于煙草煙霧環(huán)境的淚液質(zhì)譜圖(插圖為m/z 163.122 7離子的二級(jí)質(zhì)譜圖)； c.尼古丁信號(hào)比與濃度的關(guān)系圖圖4 淚液中尼古丁的質(zhì)譜測(cè)定Fig.4 Schirmer PSMS detection of nicotine in human tears

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了人眼中尼古丁的滯留動(dòng)力學(xué)，在煙霧中暴露8 min后，即一支煙燃盡后，在暴露后的0、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0 min監(jiān)測(cè)淚液中尼古丁的含量變化，示于圖5b。結(jié)果表明，淚液中尼古丁的濃度隨時(shí)間增加而迅速下降，滯留動(dòng)力學(xué)呈指數(shù)衰減曲線下降，滯留半衰期t1/2約為4 min；在20.0 min后，淚液中的尼古丁將代謝完全(<5.0%)，表明淚液中尼古丁已經(jīng)從眼部轉(zhuǎn)移至其他部位。

注：a.煙草煙霧環(huán)境下暴露時(shí)間；b.暴露8 min后淚液中尼古丁的滯留動(dòng)力學(xué)圖5 暴露時(shí)間與滯留時(shí)間對(duì)淚液中尼古丁的影響Fig.5 Effects of exposure time and storage time on nicotine in tears

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用Schirmer試紙采集微量人體淚液，并結(jié)合紙噴霧質(zhì)譜分析，考察了該方法的分析性能，檢測(cè)了人眼暴露在煙草煙霧環(huán)境不同時(shí)間下淚液中尼古丁的濃度變化，并探索了淚液中尼古丁的滯留動(dòng)力學(xué)。結(jié)果表明，該方法活體無(wú)創(chuàng)、靈敏、快速，有望結(jié)合小型質(zhì)譜儀器用于現(xiàn)場(chǎng)分析[18]，為眼部疾病診斷與環(huán)境健康研究提供了有效的方法。