ICP-MS順次分析雞蛋殼中微量元素

朱騰高，陳 靜，吳德波，李發(fā)亮，徐加泉

(1.東華理工大學(xué)，江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點實驗室，江西 南昌 330013； 2.江西正譜奕和科技有限公司，江西 南昌 330000)

雞蛋殼的形成過程為成熟的卵泡進入輸卵管，輸卵管分泌的蛋白將卵黃包住，然后逐漸下行形成內(nèi)外殼膜，最后到達子宮部，子宮部利用自身代謝產(chǎn)生的CO2在碳酸酐酶的作用下與水結(jié)合成H2CO3，H2CO3解離產(chǎn)生CO32-，CO32-再與血液中的Ca結(jié)合形成CaCO3，CaCO3均勻的沉積于蛋殼膜上，形成堅硬的蛋殼[1]。蛋殼從外到內(nèi)依次為表皮層，柵層和突起層，以及纖維膜層[2]。表皮層是蛋殼最外面的包圍部分，主要由含鈣鹽較多的物質(zhì)組成；柵層為從內(nèi)部的突起層發(fā)散至表皮層，其形狀是板條狀晶體結(jié)構(gòu)；突起層為蛋殼內(nèi)層，蛋殼的晶體發(fā)育由此而起，一般為乳狀；在蛋殼的內(nèi)部還有纖維膜層，由蛋白質(zhì)網(wǎng)狀纖維組成。對于一般的雞蛋殼[3]，表皮層大約厚10 μm，起到防水層的作用，主要由蛋白質(zhì)類組成(90%)，其他物質(zhì)是碳水化合物和油脂。柵層和突起層主要由以蛋白質(zhì)為基體的復(fù)合材料組成，包括95%碳酸鈣、3.3%蛋白質(zhì)和1.6%水分。柵層較為致密和堅硬，以彈性較好的多孔質(zhì)為基體?？傮w來說，雞蛋殼的基本成分是CaCO3，含量大約為83%～85%，蛋白質(zhì)含量為15%～17%，并含有鋅、銅、錳、鐵、硒等微量元素[4]。分析雞蛋殼中微量元素，不僅可以判斷雞蛋的質(zhì)量，如是否重金屬超標(biāo)，還可以鑒別雞蛋的產(chǎn)地。另外，通過判斷雞蛋殼中微量元素的含量和種類，可以了解母雞攝入微量元素的情況及母雞的健康狀況。

目前，固體樣品中微量元素的分析通常采用強酸或強堿等化學(xué)試劑將樣品中相應(yīng)的組分提取出來，制備待測液，然后使用原子發(fā)射光譜法(AES)[5]、原子吸收光譜法(AAS)[6]或電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[7]離線檢測待測液，獲得元素組成及含量信息，但這些離線方法需要繁瑣的樣品預(yù)處理過程，分析效率和通量較低[8]。而激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜(LA-ICP-MS)[9]、X射線熒光[10]等方法雖然能實現(xiàn)固體樣品中微量元素的直接分析，但在定量分析方面存在不足。比如LA-ICP-MS的定量分析需要采用與待測樣品基體相匹配的標(biāo)準(zhǔn)樣品進行校正，對于許多待測樣品來說，獲得相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)非常困難。

本課題組基于前期常壓質(zhì)譜分析基礎(chǔ)[11-15]，發(fā)展了一種順次電離質(zhì)譜分析技術(shù)，即基于組分的理化性質(zhì)，調(diào)控試劑與樣品進行作用(包括萃取、反應(yīng)等)，對混雜樣品中的組分進行順次提取。同時，為了提高提取效率，可對體系施加超聲、微波、加熱等不同形式的能量。順次提取的組分經(jīng)不同的電離方式(如電噴霧電離源、電感耦合等離子電離源)電離后進入質(zhì)譜儀檢測。該技術(shù)具有僅需少量樣品預(yù)處理、分析速度快、檢測靈敏度高、樣品消耗量小等優(yōu)點，已實現(xiàn)了合金[16-17]、組織[18]、礦樣[19-20]等不同混雜樣品中有機及無機組分的順次電離分析。

為此，本研究將基于順次電離質(zhì)譜分析技術(shù)，建立一種可用于雞蛋殼中微量元素快速分析的質(zhì)譜方法。該方法將在ICP-MS前端耦合在線提取裝置，將微量待測雞蛋殼樣品放置于在線提取裝置中，先后采用水和稀硝酸分別對雞蛋殼中的微量元素進行提取，提取的組分實時在線傳輸至ICP-MS進行分析檢測，以獲取雞蛋殼中微量元素信息。本文將采用該方法對贛州鮮土雞蛋、贛州營養(yǎng)雞蛋、贛州草雞蛋、毛庵村毛氏雞蛋以及泰和土雞蛋不同部位(小頭、中部、大頭)中15種微量元素(Na、K、Mg、Cr、Mn、Fe、Zn、Cu、Pb、Al、Cd、As、Sn、Ni、Ti)水溶性組分和酸溶性組分進行分析。

1 實驗部分

1.1 儀器裝置

iCAP RQ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，配有Qtegra數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；順次電離在線洗脫裝置：江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點實驗室自制；UPHW-111-90T優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)：四川優(yōu)普超純科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

濃硝酸(質(zhì)量濃度65%，分析純)：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；二次去離子水(18.2 MΩ·cm)：由超純水系統(tǒng)制備；定量濾紙：杭州特種紙業(yè)有限公司產(chǎn)品；氬氣、氦氣(99.999%)：贛州輝浩氣體有限公司產(chǎn)品；塑料尖嘴鑷子：使用前用5%稀硝酸清洗。

取2.2 mL 65%硝酸，在攪拌下緩慢滴加至98 mL純凈水中，配制成2%稀硝酸；取5.5 mL 65%硝酸，在攪拌下緩慢滴加至95 mL純凈水中，配制成5%稀硝酸。

贛州鮮土雞蛋、贛州營養(yǎng)雞蛋、贛州草雞蛋、毛庵村毛氏土雞蛋、江西吉安泰和土雞蛋：購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.3 實驗條件

霧化氣流速1.1 L/min，輔助氣流速0.8 L/min，等離子氣流速14.0 L/min，透鏡電壓9.25 V，射頻功率1 550 W，模擬檢測器電壓-1 900 V，數(shù)字檢測器電壓1 000 V，動能歧視(KED)模式，其他條件由質(zhì)譜儀自動優(yōu)化獲得。

1.4 實驗過程

用干凈的尖嘴鑷子將雞蛋從中部戳開，倒出蛋黃和蛋清，注意避免污染雞蛋殼。用尖嘴鑷子分別取1 mm×1 mm小頭頂部、蛋殼中部(蛋殼高度一半處)、大頭頂部的雞蛋殼，需要去除雞蛋殼內(nèi)層的半透膜。

首先，根據(jù)所需分析的元素確定特征信號(m/z)；然后，搭建圖1裝置，淋洗液分別為超純水和5%硝酸，淋洗液流速0.3 mL/min，輸液管路內(nèi)徑0.3 mm，超聲功率120 W，加熱溫度60 ℃，2%稀硝酸以0.3 mL/min流速與提取后的金屬溶液進行在線混合，以提供ICP-MS檢測所需要的酸性條件。將取好的雞蛋殼樣品直接放置于順次電離在線洗脫裝置中，從0時刻開始，首先采用水溶液作為洗脫劑，對雞蛋殼進行在線淋洗，以提取樣品表面的微量元素組分，然后在線輸送至ICP-MS進行檢測，實時監(jiān)測水溶性微量元素組分信號，當(dāng)信號降至基線后，表示水溶性組分提取結(jié)束；然后將水溶液更換為5%稀硝酸溶液，繼續(xù)淋洗雞蛋殼，并通過ICP-MS實時監(jiān)測稀硝酸提取液，以檢測雞蛋殼中酸溶性微量元素組分信息，當(dāng)組分信號降至基線后，分析結(jié)束。

圖1 順次電離分析裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of sequential ionization analysis device

2 結(jié)果與討論

2.1 雞蛋殼不同部位微量元素分析

首先選取贛州鮮土雞蛋，根據(jù)順次電離分析流程，對雞蛋殼小頭、中部以及大頭3個不同部位上的Na、K、Mg、Cr、Mn、Fe、Zn、Cu、Pb、Al、Cd、As、Sn、Ni、Ti等15種微量元素水溶性組分和酸溶性組分進行分析。利用質(zhì)譜高通量的檢測特性，通過單次分析流程，可在10 min內(nèi)獲得單個樣品中15種微量元素的信息。由于不同雞蛋殼樣品及不同樣品的分析時長均存在一定的差異，整個分析過程大約耗時10 min。

雞蛋中部K元素的順次電離質(zhì)譜分析離子流圖示于圖2?？梢钥闯?，在50 s和400 s處有2個明顯的信號峰，根據(jù)實驗分析過程可知，其分別為水溶性和酸溶性鉀元素的信號峰。

圖2 贛州鮮土雞蛋蛋殼中部水溶性和酸溶性K組分的順次電離質(zhì)譜分析離子流圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of water-soluble and acid-soluble potassium on the middle part of the eggshell from Ganzhou fresh native eggs

贛州鮮土雞蛋蛋殼不同部位15種微量元素水溶性和酸溶性組分分析結(jié)果示于圖3?？梢钥闯?，Na是含量最豐富的元素，其次為Mg、Ti、K、Cr、Pb、Fe、Zn、Ni、Cu等元素，幾乎觀察不到Mn、Al、As、Cd、Sn等元素，而且對于大部分元素，酸溶性組分含量高于水溶性組分。在空間分布上，不同元素在小頭、中部和大頭3個部位的分布情況不同，如Na、K、Pb在小頭部位分布較多， Mg、Ti在中部的分布略多于小頭和大頭部位，而Cr、Fe在3個部位的分布幾乎相同?？梢?，不同微量元素在雞蛋殼不同部位的分布具有顯著差異。

圖3 贛州鮮土雞蛋蛋殼不同部位15種微量元素水溶性和酸溶性組分檢測結(jié)果(n=3)Fig.3 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell from Ganzhou fresh native eggs (n=3)

2.2 不同類型雞蛋蛋殼表面微量元素分析

為了進一步考察不同類型雞蛋蛋殼表面微量元素的分布情況，實驗選取了贛州營養(yǎng)雞蛋和贛州草雞蛋進行順次電離質(zhì)譜分析，結(jié)果示于圖4、圖5。從圖4可以看出，贛州營養(yǎng)雞蛋中Na依然是含量最高的元素，其次為Mg、Ti、Cr、Fe、K、Zn、Pb、Ni、Cu、Mn、Al等元素，而幾乎未檢測到Cd、As、Sn等元素。在形態(tài)分布上，不同元素具有不同的分布特征，對于Na、K、Mg、Zn、Pb，其水溶性組分大于酸溶性組分；而對于Cr、Fe、Ti，其酸溶性組分大于水溶性組分。在空間分布上，不同元素也具有顯著差別，Cr、Fe、Cu、Pb在小頭、中部和大頭部位分布差別不大；Na、K、Mg、Ti在中部分布最少，而在小頭和大頭部位分布較多，但差別不大。

圖4 贛州營養(yǎng)雞蛋蛋殼不同部位15種微量元素水溶性和酸溶性組分檢測結(jié)果(n=3)Fig.4 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell from Ganzhou nutritional eggs (n=3)

圖5 贛州草雞蛋蛋殼不同部位15種微量元素水溶性和酸溶性組分檢測結(jié)果(n=3)Fig.5 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell from Ganzhou grass eggs (n=3)

從圖5可以看出，贛州草雞蛋蛋殼中微量元素含量最高的依然是Na，其次為Zn、K、Mg、Fe、Ti、Pb、Cu等元素，而Cr、Mn、Al、Cd、As、Sn、Ni等元素的含量非常少。在形態(tài)分布上，Na、K、Zn以水溶性組分為主，Mg、Ti以酸溶性組分為主，F(xiàn)e的水溶性和酸溶性組分含量幾乎相同。在空間分布上，Na、K、Zn在小頭和中部分布較多，Mg在大頭部位分布較多，F(xiàn)e在中部分布較多，而Ti在小頭、中部和大頭3個部位的分布幾乎一樣。

通過對比圖3、4、5可以發(fā)現(xiàn)，這3種雞蛋雖然都產(chǎn)自同一地方，但由于養(yǎng)殖方式和喂食原料不同，雞蛋蛋殼中微量元素的含量、形態(tài)以及分布均有顯著差異。比如，草雞蛋中微量元素含量明顯高于另外2種雞蛋；鮮土雞蛋蛋殼中K主要以酸溶性組分存在，而營養(yǎng)雞蛋和草雞蛋蛋殼中K主要以水溶性組分存在；鮮土雞蛋蛋殼中Mg在中部分布最多，而在營養(yǎng)雞蛋和草雞蛋中，Mg在中部分布最少?？梢?，雞蛋蛋殼中微量元素信息具有非常明顯的“指紋”特性，利用這些特性可以有效區(qū)分同一產(chǎn)地不同種類雞蛋，在質(zhì)量監(jiān)控方面具有潛在的應(yīng)用價值。

2.3 不同產(chǎn)地雞蛋蛋殼表面微量元素分析

為了進一步考察不同產(chǎn)地雞蛋蛋殼中微量元素的差別，選取了毛庵村毛氏土雞蛋和江西吉安泰和土雞蛋進行分析，結(jié)果示于圖6、圖7。從圖6可以看出，毛庵村毛氏土雞蛋中Na依然是含量最高的元素，其次為Mg、Ti、Cr、Zn、K、Fe、Pb、Cu等元素，而Mn、Al、Cd、As、Sn、Ni元素含量非常少。在形態(tài)分布上，Na、K、Zn、Pb、Cu均以水溶性組分為主，Mg、Cr、Ti以酸溶性組分為主，而Fe的水溶性和酸溶性組分幾乎相同。在空間分布上，Na主要分布于大頭部位，Zn主要分布于小頭部位，Mg、Cr、Fe、Ti在中部的含量最低，而在小頭和大頭部位的分布相差不大。

圖6 毛庵村毛氏土雞蛋蛋殼不同部位15種微量元素水溶性和酸溶性組分檢測結(jié)果(n=3)Fig.6 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell of Maoancun Maoshi native eggs (n=3)

圖7 泰和土雞蛋蛋殼不同部位15種微量元素水溶性和酸溶性組分檢測結(jié)果(n=3)Fig.7 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell from Taihe native eggs (n=3)

從圖7可以看出，泰和土雞蛋蛋殼中Na依然是含量最高的元素，但是Ti、Mg、Cr、Fe等元素的比例相比于毛庵村毛氏土雞蛋和贛州土雞蛋都有明顯增加，Al、Cd、As等元素含量依然很低。在形態(tài)分布上，Mg、Cr、Fe、Pb、Ti均以酸溶性組分為主，而K、Zn以水溶性組分為主。在空間分布上，Na、K、Cr、Fe、Pb等在小頭、中部和大頭部位的含量相差不大，Mg、Zn在中部含量略高于兩端，Ti在大頭部位的分布最多。

對比圖3、6、7可以發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地同類雞蛋蛋殼中微量元素的含量、形態(tài)、分布具有顯著差異，不同雞蛋之間具有特征的微量元素信息“指紋”，利用這些指紋信息，可有效區(qū)分不同產(chǎn)地的同類型雞蛋。

2.4 顯著性差異表征

為了表征不同種類雞蛋之間結(jié)果的差異性，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示連續(xù)變量，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較5種雞蛋之間各元素含量的差異，所有的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均在IBM SPSS 22.0軟件上完成。5種雞蛋不同部位酸提取和水提取的顯著性差異表征結(jié)果示于圖8?？梢钥闯?，分析結(jié)果之間具有顯著差異，p值均小于0.001，表明由微量元素構(gòu)成的“指紋譜”可用于鑒別雞蛋的來源和品質(zhì)。

注：a.小頭(水)；b.中頭(水)；c.大頭(水)；d.小頭(酸)；e.中頭(酸)；f.大頭(酸)；*代表p<0.001圖8 5種雞蛋不同部位水提取及酸提取微量元素分析結(jié)果差異性Fig.8 Difference of the analytical results of the trace elements extracted from different parts of 5 kind of eggs

導(dǎo)致不同種類雞蛋蛋殼中金屬元素不同的因素很多。根據(jù)蛋殼的形成過程可知，其中的金屬元素主要來源于血液，而血液中的金屬元素主要來源于攝取的食物和水。其中，對于養(yǎng)殖雞，其差異主要取決于飼料和水；而對于放養(yǎng)雞，由于其食物來源較復(fù)雜，將具有較強的地域特色。此外，由于運動、光照等因素會影響金屬元素的吸收，也是導(dǎo)致血液中金屬元素含量不同的原因。實驗結(jié)果表明，贛州草雞蛋蛋殼中的微量金屬元素含量顯著高于其他種類雞蛋，這與其放養(yǎng)過程中食物的復(fù)雜性和運動有關(guān)，其在放養(yǎng)過程中會大量攝入環(huán)境中的食物和水，其金屬含量將高于飼料中的金屬含量，而且運動有助于提高食物的攝入量。

3 結(jié)論

本工作耦合在線提取與ICP-MS分析，發(fā)展了一種雞蛋殼中微量元素順次分析的質(zhì)譜方法。該方法具有樣品預(yù)處理少、分析速度快(10 min)、樣品消耗量小(1 mm×1 mm)、元素信息豐富(15種微量元素水溶性和酸溶性信息)等優(yōu)點。采用該方法成功獲得了贛州土雞蛋、贛州營養(yǎng)雞蛋、贛州草雞蛋、毛庵村毛氏土雞蛋、吉安泰和土雞蛋中15種微量元素含量、形態(tài)及分布信息。結(jié)果顯示，整合雞蛋蛋殼上微量元素的含量、形態(tài)和分布信息可構(gòu)建雞蛋“指紋譜”，該“指紋譜”與雞的飼料、水、運動、光照等因素有關(guān)，不同種類雞蛋的微量元素“指紋譜”具有顯著區(qū)別(p<0.001)，該“指紋譜”可為雞蛋種類鑒別和質(zhì)量鑒定提供參考。

致謝：感謝國家鎢與稀土產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督(贛州)檢驗中心為本工作提供的幫助。