一種生物膜表面唾液酸的染色和定量方法*

張柏惠 ， 楊曉倩 ， 鄒 翔 ， 曲中原 ， 崔琳琳 △， 郭守東 △

［1哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院（藥物工程技術(shù)研究中心），黑龍江哈爾濱150076；2濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院脂代謝與動脈粥樣硬化研究室，山東濰坊261053］

材料和方法

1 主要儀器試劑和材料

LEICA CM1850 冰凍切片機和DHG-9240A 型烘箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；BX51（Olympus）；Axio Vert.A1倒置顯微鏡（Zeiss）。NaIO4和熒光素-5-氨基硫脲（fluorescein-5-thiosemicarbazide，F(xiàn)TSC）購自Sigma-Aldrich；甘油購自北京諾博萊德科技有限公司；OCT（optimal cutting temperature）包埋液購自Tissue-Tek；青霉素、鏈霉素、磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）、伊紅、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）和吐溫20 購自索萊寶生物科技有限公司；四季青胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)液購自Gibco；蘇木精購自如吉生物科技公司。

2 動物和細胞

SPF 級8周齡雄性載脂蛋白E 基因敲除（apolipoprotein E-deficient，ApoE-/-）小鼠和 C57BL/6 小鼠各 6只，體重為（22±2）g，均購自北京華阜康生物科學(xué)有限公司，許可證編號為SCXK2014-0004。飼料購自購自北京華阜康生物科技有限公司。小鼠RAW 264.7巨噬細胞購自上海博耀生物技術(shù)有限公司；小鼠乳腺癌4T1 細胞和人肝母細胞瘤HepG2 細胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

3 主要方法

3.1 試劑配制方法 （1）PBS溶液：配制0.01 mol/L的 PBS，調(diào)節(jié) pH 值為 7.4，置于冰箱 4 ℃?zhèn)溆?；?）PBS-T 溶液：取配好的 PBS 以 500∶1 的比例加入吐溫20，搖勻；（3）FTSC 工作液：取配好的 PBS 將 FTSC 配制為 100 μmol/L 的 FTSC 工作液；（4）NaIO4工作液：用雙蒸水溶解NaIO4，配制成1 mmol/L 的NaIO4溶液；（5）DAPI 工作液：用 PBS 將 DAPI 配制成5mg/L 的工作液；（6）甘油工作液：用配好的PBS 將甘油原液配制成1 mmol/L 的工作液；（7）蘇木精儲備液A：1 g 蘇木精加入100 mL 無水乙醇，40 ℃微熱溶解；（8）蘇木精儲備液B：取30%的無水氯化鐵溶液4 mL 加入1 mL 濃鹽酸和 95 mL 蒸餾水混勻；（9）蘇木精工作液：在使用時將 A 液與 B 液 1∶1 混合，需過濾后使用，限4 h內(nèi)使用，4 h后工作液易被氧化變色。

3.2 細胞培養(yǎng) 細胞復(fù)蘇后采用25 cm2的培養(yǎng)瓶，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中采用含有10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)。實驗中，將滅菌后的蓋玻片置于6 孔板中，接種對數(shù)生長期的細胞，讓細胞在蓋玻片上貼壁，方便后續(xù)染色。

3.3 細胞染色條件優(yōu)化 HepG2 細胞生長到60%時，棄去培養(yǎng)液用PBS 輕輕潤洗3 次，每孔加入1.5 mL 的NaIO4工作液，在4 ℃冰箱靜置20 min。取1.5 mL 甘油工作液加到六孔板中，隨后用冷的PBS 潤洗3次。為探討不同時間對染色效果的影響，每孔內(nèi)加入 1 mL 的 FTSC 工作液分別染色 10、20、40 和 90 min，再用 PBS 輕洗 3 次。接下來，取適量的 DAPI 工作液滴加到細胞上，室溫避光靜置5 min，對細胞核進行復(fù)染，用PBS-T 潤洗3 次后拍片。觀察染色情況，選取最佳染色時間后，進行平行實驗以確定方法的可靠性。

3.4 優(yōu)化后的細胞染色 待細胞生長到60%時，棄去培養(yǎng)液用PBS 輕輕搖晃洗滌3 次，每孔各加入1.5 mL NaIO4工作液，在4 ℃冰箱靜置20 min。取1.5 mL甘油工作液加到6 孔板中。隨后用冷的PBS 輕洗3次。加入1 mL FTSC 工作液，避光反應(yīng)40 min，用PBS 輕洗3 次。取適量DAPI 工作液滴加到細胞上，室溫避光靜置5 min，對細胞核進行復(fù)染，用PBS-T輕洗3 次后拍片。圖像采用熒光倒置顯微鏡自帶的分析軟件獲得熒光強度值，進而量化唾液酸含量。在實驗中應(yīng)以僅加入FTSC 處理組作對照，用于排出可能的假陽性結(jié)果或用以扣除背景。

3.5 H2O2對細胞表面唾液酸的影響 對數(shù)生長期的細胞，接種到放置有蓋玻片的6 孔板中，隨機分為對照組和H2O2處理組（100 μmol/L H2O2），細胞培養(yǎng)24 h后進行染色分析。

學(xué)習(xí)少數(shù)民族民間樂器，主要是通過利用實物或者圖片以及欣賞樂器演奏音樂來認識。當幼兒聽到樂器演奏的音樂引起其興趣后，再利用實物或者圖片讓幼兒能夠?qū)菲鞯臉?gòu)造有初步的認識，幫助幼兒理解和記憶。選擇幼兒欣賞的音樂作品時，不但要使其符合當前的教學(xué)要求，同時還要使其與幼兒的理解能力及感知能力相符，并且在選擇音樂時還要能夠使用到相應(yīng)的樂器。所以，在選擇樂器時應(yīng)該選取那些音樂長度適中且結(jié)構(gòu)簡單并利于攜帶的。

3.6 動物飼養(yǎng) 該動物實驗得到濰坊醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會的批準。6 只C57BL/6 小鼠給予正常低脂飼料喂養(yǎng)，6 只ApoE-/-小鼠給予高脂飼料（含有21%脂肪和0.15%膽固醇）喂養(yǎng)。小鼠自由飲食，飼養(yǎng)8 周，環(huán)境濕度為45%～60%，飼養(yǎng)溫度為22 ℃。

3.7 動物取材ApoE-/-小鼠和C57BL/6 小鼠脊椎脫臼處死后解剖，在體視顯微鏡下用眼科鑷子和眼科剪剔除主動脈周圍的脂肪，取帶有主動脈弓2 mm 左右（即主動脈竇瓣膜的位置）的心臟，去除多余組織后切除心尖，使切口處與主動脈弓切面平行。用OCT 包埋液包埋，使主動根朝上，放入-80 ℃冰箱或液氮中速凍。剩余主動脈從中間縱向剖開，放入4%的多聚甲醛中固定2 h。C57BL/6小鼠肝臟和小腸樣本均裁切后采用OCT包埋液包埋，并速凍。

3.8 切片及唾液酸染色 使用LEICA CM1850切片機，在-18～-22 ℃環(huán)境下切片，厚度為5 μm。在切片上滴加4%的多聚甲醛固定2 min，放入蒸餾水稍作停留后取出，重復(fù)3次。取100 μL 的NaIO4工作液滴加到切片組織上，放于冰箱4 ℃靜置20 min。取甘油工作液0.5 mL，滴加到切片上。隨后用冷的PBS潤洗3 次，每次5 min。在組織上滴加FTSC 工作液，放入37 ℃培養(yǎng)箱靜置40 min，避光條件下用PBS 輕洗3 次，每次5 min。避光條件下，取適量DAPI 工作液覆蓋到組織切片上，室溫靜置5 min，隨后用PBS-T緩慢洗滌2 min，甘油封片后拍片。

3.9 實驗假陽性結(jié)果的考察 為排除實驗可能存在的假陽性結(jié)果，采用小鼠乳腺癌4T1 細胞和C57BL/6 小鼠小腸切片進行實驗。隨機分為4 組，分別為空白對照組、NaIO4組（不加FTSC 熒光染料）、FTSC 組（不加入NaIO4）和正常實驗組（按照優(yōu)化后條件，依次加入NaIO4和FTSC 染料）。以上各組均采用DAPI對核進行染色定位。

3.10 主動脈染色方法 取小鼠胸主動脈從中間縱向剖開后，浸泡到2 mL NaIO4工作液中，冰箱4 ℃靜置。30 min 后，取出主動脈并浸泡在3 mL 甘油工作液中，接著采用冷的PBS洗滌3次，每次5 min。將主動脈展平固定到載玻片上，在組織上滴加FTSC 工作液，放入37 ℃培養(yǎng)箱中避光靜置40 min，并在避光條件下用PBS 洗滌3 次，每次5 min。室溫避光滴加DAPI 工作液覆蓋主動脈內(nèi)表面10 min，用PBS-T 緩慢洗滌3次，每次3 min。最后采用顯微鏡拍照。

3.11 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色 組織切片，在4%的多聚甲醛中固定2 min，放入蒸餾水稍作停留后取出，重復(fù)3 次。采用蘇木精工作液染色10 s 后，迅速用自來水沖洗30 s 左右。自來水流速緩慢，沿切片上方空白處沖洗，不可直接沖到組織切片上。再采用蒸餾水稍作漂洗，待切片晾干后，采用伊紅染液染色10 s，蒸餾水涮洗5 下。最后，采用甘油明膠封片后拍照。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）的形式表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 染色條件的確立

采用NaIO4平行處理HepG2細胞，處理后的細胞與FTSC反應(yīng)不同時間后的熒光圖片如圖1所示。實驗結(jié)果顯示，HepG2 細胞與 FTSC 反應(yīng) 10 min，細胞膜表面的綠色熒光信號很弱；隨著FTSC 孵育時間的延長，細胞表面的綠色熒光顯著增強，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示FTSC 孵育20 min 時的熒光強度較孵育10 min時的熒光強度增加了約3 倍（P＜0.01），孵育40 分鐘時的熒光強度較孵育20 min 時的熒光強度增加了約31%（P＜0.01），但反應(yīng)40 min 時的熒光信號與孵育90 min 時的熒光強度無顯著性差異。因此，在考察的時點內(nèi)，F(xiàn)TSC 孵育時間為40 min 時效果最佳。在下述的細胞和組織切片的唾液酸染色過程中，如無特殊說明，F(xiàn)TSC的孵育時間均采用40 min。

Figure 1.Typical images and fluorescence intensity of HepG2 cells treated with FTSC for different time（scale bar=200 μm）.Sialic acids were labeled with FTSC（green），and nuclei were labeled with DAPI（blue）.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs 10 min group；##P＜0.01 vs 20 min group.圖1 HepG2細胞經(jīng)FTSC處理不同時間后的熒光圖片及熒光強度分析

為排除染色過程中可能存在的假陽性結(jié)果，我們采用小鼠乳腺癌4T1 細胞進行了平行比對實驗，實驗結(jié)果如圖2A 所示，空白對照組和僅采用NaIO4處理組未見明顯的綠色熒光信號，僅采用FTSC 孵育的細胞可見微弱的綠色熒光背景信號。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，采用優(yōu)化后的實驗條件進行唾液酸染色時的熒光信號是僅采用FTSC 處理組的16 倍左右（P＜0.01），是僅采用NaIO4處理組或空白對照組的40 倍左右（P＜0.01）。在C57BL/6 小鼠小腸切片的實驗中也得到了類似的結(jié)果（圖2B）。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，采用優(yōu)化后的實驗條件，小腸切片的熒光強度是僅采用NaIO4處理組或空白對照組的41 倍（P＜0.01），是僅采用FTSC處理組的9.3倍（P＜0.01）。

Figure 2.Images and fluorescence intensity analysis of sodium metaperiodate（NaIO4）-treated and untreated mouse breast cancer 4T1 cells（A）and small intestine sections of C57/BL/6 mice（B）.Sialic acids were labeled with FTSC（green），and nuclei were labeled with DAPI（blue）.The scale bar=200 μm.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group.圖2 高碘酸鈉處理和未處理對小鼠乳腺癌4T1細胞和C57/BL/6小鼠小腸切片染色的影響

2 H2O2對細胞表面唾液酸的影響

采用優(yōu)化后的染色方法，小鼠RAW 264.7 巨噬細胞膜表面的唾液酸呈現(xiàn)出強烈的綠色熒光，細胞核呈現(xiàn)出藍色熒光；H2O2處理組的熒光強度顯著低于未處理組（P＜0.01），見圖3。

Figure 3.Images and fluorescence intensity analysis of H2O2-induced desialylation of RAW 264.7 macrophages（scale bar=200 μm）.Sialic acids were labeled with FTSC（green），and nuclei were labeled with DAPI（blue）.The RAW 264.7 macrophages were treated with 100 μmol/L H2O2 for 24 h.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group.圖3 H2O2誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞去唾液酸化結(jié)果

在小鼠乳腺癌4T1 細胞和人肝母細胞瘤HepG2細胞中，我們也得到了類似的結(jié)果：H2O2處理可分別下調(diào)4T1 細胞和HepG2 細胞表面的熒光強度約31%和74%（P＜0.01），見圖4、5。

Figure 4.Images and fluorescence intensity analysis of H2O2-induced desialylation of mouse breast cancer 4T1 cells（scale bar=200 μm）.Sialic acids were labeled with FTSC（green），and nuclei were labeled with DAPI（blue）.The 4T1 cells were treated with 100 μmol/L H2O2 for 24 h.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group.圖4 H2O2誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌4T1細胞去唾液酸化結(jié)果

Figure 5.Images and fluorescence intensity analysis of H2O2-induced desialylation of human hepatoblastoma HepG2 cells（scale bar=200 μm）.Sialic acids were labeled with FTSC（green），and nuclei were labeled with DAPI（blue）.The HepG2 cells were treated with 100 μmol/L H2O2 for 24 h.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group.圖5 H2O2誘導(dǎo)的人肝母細胞瘤HepG2細胞去唾液酸化結(jié)果

3 組織切片染色

小鼠主動脈根部切片的實驗結(jié)果如圖6 所示。采用優(yōu)化后的條件進行唾液酸染色后，可清晰地觀察到C57BL/6 小鼠主動脈竇瓣膜結(jié)構(gòu)完整，主動脈壁、瓣膜及周邊組織均有唾液酸著色，其中主動脈壁染色最為鮮明；值得注意的是，ApoE-/-小鼠主動脈根部可清晰地觀察到動脈粥樣硬化斑塊的形態(tài)。上述組織形態(tài)與HE 染色所觀察到的組織形態(tài)高度一致。

Figure 6.Typical images of the aortic root sections from C57/BL/6 and ApoE-/- mice after sialic acid staining and HE staining（scale bar=200 μm）.Sialic acids were labeled with FTSC（green）and nuclei were labeled with DAPI（blue）.HE staining was performed to further evaluate the histological location and structural characteristics of the aortic root sections.The cardiac valves and the peripheral tissues，especially the aortic wall，were labeled as green fluorescence by FTSC in C57/BL/6 mice.Furthermore，the atherosclerotic plaques were labeled as green fluorescence by FTSC in ApoE-/- mice.圖6 小鼠主動脈根部切片的唾液酸染色和常規(guī)HE染色結(jié)果

C57BL/6 小鼠肝臟和小腸的切片經(jīng)唾液酸染色后，亦可觀察到其切片表面唾液酸著色鮮明，細胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰，見圖7。肝臟和小腸經(jīng)唾液酸染色后所觀察到的組織結(jié)構(gòu)特征亦與HE 染色圖片的組織形態(tài)高度一致。

Figure 7.Images of liver and small intestine sections from C57BL/6 mice after sialic acid staining and HE staining（scale bar=200 μm）.Sialic acids were labeled with FTSC（green），and nuclei were labeled with DAPI（blue）.HE staining was performed to further evaluate the histological location and structural characteristics of the sections.The structural characteristics of the liver and small intestine sections after sialic acid staining were consistent with those after HE staining.圖7 C57BL/6小鼠肝臟和小腸切片的唾液酸染色和常規(guī)HE染色結(jié)果

4 胸主動脈染色

如圖8 所示，經(jīng)唾液酸染色后，C57BL/6 和ApoE-/-小鼠的主動脈內(nèi)壁結(jié)構(gòu)完整，著色清晰。其中，C57BL/6 小鼠主動脈內(nèi)壁紋理清晰，細胞排列整齊有序；而ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)壁可見明顯的皺褶，紋理結(jié)構(gòu)紊亂無序。

Figure 8.Typical images of the inner wall of thoracic aortas from C57BL/6 and ApoE-/- mice（scale bar=100 μm）.Sialic acids were labeled with FTSC（green），and nuclei were labeled with DAPI（blue）.The cells arranged well in the inner aorta wall of the C57 BL/6 mice，whereas the cells were irregular in the inner aorta wall of the ApoE-/-mice.圖8 C57BL/6和ApoE-/-小鼠的胸主動脈內(nèi)壁唾液酸染色結(jié)果

討 論

唾液酸在組織內(nèi)和血漿中廣泛分布，其在疾病發(fā)生發(fā)展中易發(fā)揮著重要作用。有研究者認為血清唾液酸水平與炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)，可作為心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVD）的生物標志物［10-11］。在心肌梗死患者中，血清唾液酸濃度顯著高于正常人，而且血清唾液酸濃度隨著機體年齡的增大而上升［12］。此外，從人血液中分離獲得的一種唾液酸含量較低的脂蛋白可以誘導(dǎo)膽固醇在主動脈平滑肌細胞中積累［13］，而膽固醇在血管壁的聚集是導(dǎo)致斑塊形成的重要原因。糖尿病患者與健康人脂蛋白上的

唾液酸水平亦存在顯著差異［14］。目前，唾液酸與CVD 之間的關(guān)系仍存有不同見解，本課題組前期研究顯示外源性補充唾液酸可促進膽固醇逆向轉(zhuǎn)運，并顯著降低甘油三酯的水平［15-16］。病理狀態(tài)下的血清唾液酸水平升高可能是機體的一種補償機制，該推論尚待進一步確證。

鑒于唾液酸在生理和病理狀態(tài)下的重要功能，已有不同的研究團隊建立了不同的唾液酸定性和定量檢測方法。例如，研究者借助同位素標記和唾液酸在核磁共振中所呈現(xiàn)出的不同相關(guān)信號（H3-C2、H3-C1和C1-C2）可檢測細胞或蛋白表面的唾液酸［3］。Colsch 等［17］利用基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜技術(shù)可繪制小鼠腦冠狀切片中的唾液酸鞘糖脂的分布和定位情況。上述方法的確為唾液酸的定性和定量研究提供了可借鑒的技術(shù)手段，但實驗過程中需要高端的儀器和相應(yīng)的技術(shù)人員做支撐，且不易獲得直觀的圖像資料。我國南京大學(xué)的研究團隊采用糖納米粒和功能化量子點技術(shù)可高效計數(shù)細胞表面的唾液酸分子并將該標記方法應(yīng)用于細胞計數(shù)和細胞表面唾液酸的熒光分析［18］。此外，亦有研究團隊報道了將糖基（含疊氮、酮或炔基的非天然底物）插入到細胞糖蛋白中，再通過化學(xué)拼接手段實現(xiàn)報告基團對唾液酸化糖蛋白成像的技術(shù)。但上述該方法需要制備相應(yīng)的材料，不利于唾液酸染色和定量的便利性需求［19-21］。美國和英國研究者通過高碘酸鹽氧化使唾液酸分子C-7位成醛，將生成的醛基用氨氧基或酰肼生物素標記，然后用FITC 標記的親和素染色［6-7］。后來，我國西北大學(xué)的研究者則建立了輕度NaIO4氧化與FTSC 熒光探針結(jié)合的技術(shù)，進一步在細胞水平上簡化上述方法，并證明了簡化后的方法與前期報道［6-7］的染色效果相當［8］。

FTSC 是一種具有亮綠色熒光的生物標記分子，對活細胞無毒并在生理條件下對醛基具有較高的化學(xué)選擇性［22-23］。借助唾液酸的結(jié)構(gòu)特征，輕度NaIO4氧化可選擇性地將醛基引入到生物膜表面的唾液酸分子上［5-6］。從理論上來講，該染色方法不會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，前期文獻采用不表達唾液酸的Lec-2 細胞排除了該方法出現(xiàn)假陽性結(jié)果的可能性［8］。該方法的缺點之一在于：倘若樣本自身存在醛基，則存在與FTSC 結(jié)合產(chǎn)生假陽性結(jié)果的可能性；但上述假陽性結(jié)果可通過在實驗中僅加入FTSC處理組作為對照，并在統(tǒng)計分析中扣除背景以消除干擾。本研究借助前期報道［8］，在驗證其在細胞水平上簡便有效的基礎(chǔ)上，成功地對小鼠組織切片和主動脈內(nèi)膜表面的唾液酸分子進行了熒光標記。優(yōu)化后的實驗步驟可對細胞和組織表面的唾液酸進行熒光染色和量化分析，且不易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。該方法的另一缺點在于采用熒光定量分析的準確性方面，該缺點可采用多次平行實驗減小誤差，在細胞實驗中則可采用流式細胞術(shù)進行量化分析以減小誤差［8］。

氧化應(yīng)激與各種疾病密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，采用H2O2處理后的細胞，其細胞膜表面的唾液酸水平顯著降低。該研究結(jié)果與前期報道唾液酸在抗氧化方面的生物活性相一致［24-25］，也與H2O2可導(dǎo)致分子去唾液酸化相符合［9］。

本研究采用動脈粥樣硬化模型小鼠證實，輕度NaIO4氧化結(jié)合FTSC 可實現(xiàn)對主動脈竇瓣膜處生成的動脈粥樣硬化斑塊的熒光染色，且斑塊及周邊組織結(jié)構(gòu)清晰，與HE 染色的組織形態(tài)高度一致；同時觀察到在小鼠主動脈瓣膜壁上唾液酸的著色更為突出，表明唾液酸在血管壁的含量比周邊組織要高。本研究進一步的主動脈內(nèi)壁染色的結(jié)果亦表明，血管內(nèi)壁有較豐富的唾液酸分布。更為重要的是，通過唾液酸染色結(jié)果比對分析可清晰地觀察到ApoE-/-小鼠較C57BL/6 小鼠主動脈血管內(nèi)壁出現(xiàn)不規(guī)則的褶皺，這是動脈內(nèi)壁早期斑塊形成的典型特征。該實驗結(jié)果與ApoE-/-小鼠主動脈根部出現(xiàn)的動脈粥樣硬化斑塊表型一致。因此，本研究結(jié)果為檢測CVD基礎(chǔ)病變動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展過程提供了一種直觀、有效的技術(shù)手段。

此外，本研究結(jié)果證實，該方法可成功用于檢測肝臟和小腸組織的唾液酸分布狀態(tài)，且染色過程能很好地維持組織切片的原有形態(tài)。從技術(shù)層面上來講，該染色方法可對多種生物膜表面的唾液酸進行原位標記，具有應(yīng)用于各種細胞、組織和器官等含有唾液酸樣本中實現(xiàn)定性和定量分析的潛力。