膿毒性心肌病患者血漿microRNA表達(dá)譜差異的初步研究

洪澄英， 陳懷生， 陳友蓮， 劉曉君， 劉雪燕

（深圳市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，暨南大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)院，廣東深圳518020）

膿毒癥定義為由宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)引起的威脅生命的器官功能障礙［1］，嚴(yán)重威脅人類健康。研究顯示，在膿毒癥患者中，約60%可存在膿毒性心肌?。?］，其中約20%為重度心力衰竭，當(dāng)左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）≤0.40 時(shí)，其病死率可達(dá)70%［3］。而早期識別膿毒性心肌病，盡早給予相應(yīng)治療，是降低膿毒癥患者死亡率的關(guān)鍵之一。臨床上心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）等生物標(biāo)志物是檢測早期心肌損傷的重要標(biāo)志物［4］，但這些生物標(biāo)志物可能在重癥患者中顯示出局限性，尤其是合并基礎(chǔ)心臟病如冠心病的患者，其升高往往受多種因素影響，并不能作為膿毒性心肌病的早期診斷依據(jù)。血漿微小RNA（microRNA，miRNA）是一種小分子單鏈非編碼RNA，研究提示某些miRNA 可能在膿毒癥導(dǎo)致的心功能障礙患者中表達(dá)異常，具有潛在作用［5-7］，但關(guān)于膿毒癥心肌病miRNA 的研究目前仍較少，本研究通過檢測血漿miRNA 表達(dá)水平，分別對比其在健康人，膿毒癥心功能正?；颊呒澳摱拘孕募〔』颊咄庵苎械谋磉_(dá)情況，篩選出在膿毒癥導(dǎo)致心功能不全患者外周血中異常表達(dá)的miRNA 并進(jìn)行分析，以期尋找早期診斷膿毒性心肌病的生物標(biāo)志物。

材料和方法

1 研究對象

本研究經(jīng)深圳市人民醫(yī)院倫理委員會審議同意（編號LL-KY-2019507），根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)納入 2019 年 1 月～2019 年 12 月入住深圳市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科的患者14 例，根據(jù)心功能情況分為膿毒癥心功能正常組（8 例）和膿毒性心肌病組（6 例），同時(shí)招募健康志愿者6例作為健康對照（healthy control）組?；颊呒敖】抵驹刚吆炇鹬橥鈺?。

膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合第三版膿毒癥和膿毒癥休克定義的國際共識［1］，明確存在感染的患者，SOFA評分急性改變≥2分。

膿毒性心肌病組納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞18 周歲，符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，膿毒性心肌病目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用膿毒癥患者LVEF 下降（LVEF＜0.5）作為診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］。

排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜18 周歲；24 h 內(nèi)可能出院或死亡的患者；合并冠心病或急性心肌梗死患者；存在心腦血管基礎(chǔ)疾病患者；存在風(fēng)濕免疫疾病患者；存在嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者；存在血液系統(tǒng)疾病患者；孕產(chǎn)婦；晚期腫瘤患者；存在慢性肝病患者。

2 一般資料

根據(jù)患者的LVEF 情況，14 例患者分為心功能正常組（8 例）及膿毒性心肌病組（6 例），兩組患者年齡，SOFA 評分，APEACHEII 評分對比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），具體詳見表1。

表1 兩組患者入組時(shí)的一般資料Table 1.General data of patients in both groups at the time of enrolment（Mean±SD）

3 實(shí)驗(yàn)方法

所有患者根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)納入研究24 h 內(nèi)取靜脈血送本院檢驗(yàn)科查cTnI 和CK-MB，同時(shí)取靜脈血3 mL，貯存于全血RNA 靜脈真空采血管（BD 762165 PAXgen）。NanoDropTMOne/OneC 檢測 RNA 純度，Life Invitrogen Qubit?3.0 熒 光 定 量 儀 采 用 QubitTMRNA HS Assay Kit精確定量測量RNA；Agilent 4200 TapeS-tation 系統(tǒng)精確檢測RNA 的完整性。利用small RNA的3‘端及5’端完整磷酸基團(tuán)結(jié)構(gòu)，分別在兩端連接接頭，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PAGE 膠電泳分離純化目標(biāo)DNA片段，獲得特定大小small RNA文庫。質(zhì)量檢測后，進(jìn)行測序。參考基因組比對，進(jìn)行miRNA 分析，miRNA 表達(dá)和差異分析，取FDR＜0.05的高表達(dá)miRNA。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 生物標(biāo)志物情況對比

膿毒性心肌病組與膿毒癥心功能正常組兩組患者cTnI 和CK-MB 對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而膿毒性心肌病組LVEF 較膿毒癥心功能正常組顯著下降（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者生物標(biāo)志物及LVEF對比Table 2.Comparison of biomarkers and LVEF between the two groups（Mean±SD）

2 芯片檢測結(jié)果

獲得特定大小small RNA 文庫，質(zhì)量檢測后，進(jìn)行測序。參考基因組比對，進(jìn)行miRNA 分析，miRNA 表達(dá)和差異分析，取FDR 小于0.05 的高表達(dá)miRNA。應(yīng)用Cluster 3.0聚類分析，結(jié)果見圖1、2。

Figure 1.The cluster analysis diagram of healthy control group（n=6）and septic cardiomyopathy group（n=6）.圖1 健康對照組及膿毒性心肌病組聚類分析圖

Figure 2.The cluster analysis diagram of healthy control group（n=6）and normal heart function with sepsis group（n=8）.圖2 健康對照組及膿毒癥心功能正常組聚類分析圖

3 血漿miRNAs的表達(dá)情況

與健康對照組相比，膿毒癥心功能正常組有105種miRNAs 表達(dá)上調(diào)，而膿毒性心肌病組有45 種miRNAs 表達(dá)上調(diào)，兩組中表達(dá)明顯上調(diào)的20 種miRNAs 列表分別見表3、4。其中，膿毒癥心功能正常組及膿毒性心肌病組miR-122-5p表達(dá)上調(diào)均顯著高于其他的miRNA，見圖3、4。

表3 與健康對照組對比，膿毒癥心功能正常組表達(dá)上調(diào)的miRNAs前20種列表Table 3.The top 20 miRNAs up-regulated in normal heart function with sepsis group compared with healthy control group

表4 與健康對照組對比，膿毒性心肌病組表達(dá)上調(diào)的miRNAs前20種列表Table 4.The top 20 miRNAs up-regulated in septic cardiomyopathy group compared with healthy control group

Figure 3.The volcano plot of septic cardiomyopathy group（n=6）. Padj：adjusted P value；FC：fold change.圖3 膿毒性心肌病組火山圖

Figure 4.The volcano plot of normal heart function with sepsis group（n=8）. Padj：adjusted P value；FC：fold change.圖4 膿毒癥心功能正常組火山圖

3 同一miRNA 在膿毒癥心功能正常組與膿毒性心肌病組外周血漿中表達(dá)情況的對比

與健康對照組相比較，同一miRNA 在兩組中均表達(dá)上調(diào)，且膿毒性心肌病組較膿毒癥心功能正常組表達(dá)顯著升高的5 種miRNAs 分別為miR-122-5p，miR-122b-5p，miR-122-3p，miR-122b-3p 和 miR-885-5p，其中，與健康對照比較，在膿毒性心肌病患者中的miR-122-5p表達(dá)升高的倍數(shù)是膿毒癥心功能正常組患者的兩倍以上，見圖5。

Figure 5.The5miRNAs that were significantly up-regulated in septic cardiomyopathy group compared with septic normal heart function with sepsis group.圖5 膿毒性心肌病組較膿毒癥心功能正常組表達(dá)顯著升高的5種miRNAs

討 論

膿毒癥尤其是膿毒性休克時(shí)，潛在的炎癥過程通常伴有血液動力學(xué)障礙，從而導(dǎo)致組織灌注減少和細(xì)胞供氧減少，加劇了終末器官損害，而器官衰竭，尤其是心功能障礙是膿毒癥導(dǎo)致死亡的主要原因［9］。心肌收縮力受損，射血分?jǐn)?shù)降低，舒張期順應(yīng)性下降等是膿毒性心肌病的主要表現(xiàn)，其確切的病理生理過程目前仍不明確，亦沒有特效藥物能夠給予預(yù)防［10］，目前仍缺乏早期診斷膿毒性心肌病的有效生物學(xué)指標(biāo)。

某些miRNA 在健康的心臟組織中高度表達(dá)，可能在維持正常心臟功能中起作用（如miR-1，miR-16，miR-27b，miR-30d，miR-126，miR-133 和 miR-143等）［11］。由于膿毒癥導(dǎo)致的心功能障礙涉及到多種病理生理過程，可出現(xiàn)多種miRNA 表達(dá)水平失衡，多項(xiàng)研究提示異常表達(dá)的miRNA 在膿毒性心肌病發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用，可以幫助診斷，判斷預(yù)后。近期的一項(xiàng)研究顯示內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）引起的膿毒癥休克大鼠心肌中有78 種miRNA 存在差異表達(dá)，其中miR-155-3p 增加了2.8倍，miR-155-5p 上調(diào)了 1.9 倍［12］，抑制 miR-155 可減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠心功能障礙和細(xì)胞凋亡［6］，研究顯示，miR-155-5p 及miR-133-3p 在膿毒癥心肌損傷組患者血漿中表達(dá)顯著升高［13］，有助于早期診斷膿毒性心肌病。另外，目前體內(nèi)及體外的研究證實(shí)其他的幾種miRNA 的表達(dá)失調(diào)，如 miR-146a，miR-125b，miR-21-3p和miR-23b等可以加重炎癥和膿毒癥誘導(dǎo)的心臟功能障礙［14］；膿毒癥患者血漿 miR-499 水平與LVEF 負(fù)相關(guān)，與血cTnI 水平正相關(guān)，可反映膿毒癥合并心肌損傷病情的嚴(yán)重程度［15］。

本研究通過對比觀察膿毒性心肌病患者、膿毒癥心功能正?；颊吲c正常人群之間miRNAs 的差異表達(dá)譜，顯示與健康對照組相比，多種miRNA 在膿毒癥患者外周血漿中表達(dá)均顯著增高，但與上述國內(nèi)外研究結(jié)果不同的是，膿毒性心肌病組較膿毒癥心功能正常組表達(dá)升高顯著的5 種miRNA 分別為miR-122-5p，miR-122b-5p，miR-122-3p，miR-122b-3p和 miR-885-5p，miR-122 尤其是 miR-122-5p，其升高的倍數(shù)是膿毒癥心功能正?；颊叩膬杀兑陨?。而既往的研究顯示循環(huán)miR-122 是一種組織特異性RNA，幾乎占所有肝臟miRNA 的70%，在其他組織中的表達(dá)較少［16］，主要在肝癌術(shù)前及病毒性肝炎患者血清中升高［17］，其血清濃度的變化還與炎癥性疾病和膿毒癥引起的急性肝功能障礙有關(guān)［18-20］；與健康對照組相比，miR-122表達(dá)的改變可能被用作膿毒癥診斷的生物標(biāo)志物［21］，Rahmel 等［22］的研究顯示升高的miR-122 血清濃度有助于區(qū)別普通感染和膿毒癥，是30 d 死亡的早期和獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，miR-122的表達(dá)與膿毒癥患者平均動脈壓和去甲腎上腺素劑量之間存在顯著相關(guān)性，但目前尚未見miR-122 尤其是miR-122-5p 在膿毒性心肌病中的報(bào)道。另外，我們研究顯示的另一個(gè)重要意義是，當(dāng)傳統(tǒng)的臨床標(biāo)志物如cTnI 及CK-MB 無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)，miR-122 表達(dá)水平高低可能可以更早區(qū)分出膿毒癥患者被掩蓋的心功能下降，這些miRNA 有可能成為早期診斷膿毒性心肌病的生物標(biāo)志物。

因此，相較于傳統(tǒng)的臨床標(biāo)志物，miR-122 尤其miR-122-5p 在膿毒性心肌病患者血漿中表達(dá)顯著升高，可能成為早期診斷膿毒性心肌病的生物標(biāo)志物，有助于早期診斷。但本研究仍存在局限性，首先，本研究旨在初步了解膿毒性心肌病患者血漿miRNAs有無存在異常表達(dá)，僅納入膿毒癥心功能正?；颊?例及膿毒性心肌病患者6 例進(jìn)行血漿miRNAs 分析，盡管基礎(chǔ)病方面已排除了大量具有合并相關(guān)疾病的患者，且兩組患者年齡、SOFA 評分，APEACHEII 評分對比無顯著差異，盡可能排除了基礎(chǔ)病、年齡、疾病嚴(yán)重程度、器官功能損害情況等對血漿miRNA 表達(dá)的影響，但兩組標(biāo)本較少，未能將兩組患者的其它臨床資料與miRNA 進(jìn)行多因素風(fēng)險(xiǎn)分析，同時(shí)未能對不同嚴(yán)重程度膿毒性心肌病患者進(jìn)行分組研究，亦未能進(jìn)一步進(jìn)行ROC 曲線分析異常表達(dá)的miRNA 水平在膿毒性心肌病中的診斷價(jià)值；其次本研究未動態(tài)監(jiān)測異常表達(dá)miRNA 的水平變化，未能進(jìn)一步闡述其在患者病情發(fā)生發(fā)展中的動態(tài)改變。最后，異常表達(dá)的miRNA 參與膿毒癥心肌損傷的病理機(jī)制仍不清楚。我們的研究結(jié)果仍需要在具有大量隊(duì)列的前瞻性研究中得到驗(yàn)證，在未來的研究中，我們將擴(kuò)大樣本量，同時(shí)爭取從同一患者獲得多個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本來確定基因表達(dá)水平的動態(tài)改變，進(jìn)一步明確異常表達(dá)的miRNA 與膿毒性心肌病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性及可能的致病機(jī)制。