基于高通量測序的龍膽草根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

高嵩 孫文松 于春雷 李玲 張?zhí)祆o

摘要：為了探究藥用植物種植年限對土壤根際真菌多樣性的影響和根際群落結(jié)構(gòu)的差異，從根系與土壤微生物關(guān)系角度為藥用植物的生產(chǎn)實踐提供理論基礎(chǔ)，采用Illumina Miseq測序平臺分析不同種植年限龍膽草根際土壤的真菌群落。結(jié)果表明，測序獲得的1541個OUT分屬于11門28 綱59目109科173屬。與未種植龍膽草的土壤相比，龍膽草土壤根際真菌群落的豐度和多樣性指數(shù)降低，并且隨著種植年限的增加，多樣性與生長年限呈負相關(guān)，根際真菌群落豐度和多樣性指數(shù)的下降趨勢明顯。種植年限影響根際真菌群落結(jié)構(gòu)的改變，種植2、3年龍膽草土壤根際真菌群落結(jié)構(gòu)相似，與種植1年的根際真菌群落結(jié)構(gòu)差距較大。隨著種植年限的增加，根際真菌優(yōu)勢種群由未種植中小球腔菌屬（Leptosphaeria）等有益菌屬為主轉(zhuǎn)變?yōu)榉N植3年的炭疽菌屬（Colletotrichum）、鐮刀菌屬（Fusarium）等致病菌屬?？梢钥闯?，種植龍膽草影響了根際真菌群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)，隨著種植的年限增加，有益菌屬豐度下降，致病菌屬豐度增加。

關(guān)鍵詞：龍膽草;根際土壤;真菌群落;高通量測序;多樣性

中圖分類號： S154.37文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）12-0190-06

收稿日期：2020-07-07

基金項目：國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（編號：CARS-21）;遼寧省科學(xué)事業(yè)公益性研究基金（編號：20180041）;遼寧省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（編號：2019DD144221）。

作者簡介：高 嵩（1982—），女，遼寧大連人，博士，助理研究員，主要從事中藥材道地性栽培生理研究。E-mail：gs_laas@126.com。

通信作者：孫文松，碩士，研究員，主要從事中藥材種質(zhì)收集保護、品種選育及標(biāo)準(zhǔn)化栽培研究。E-mail：sunwensong12@126.com。

龍膽草（Gentiana scabra Bunge）為龍膽科多年生草本植物[1]，以其根莖入藥，龍膽是我國傳統(tǒng)的中藥材，其味苦、性寒，歸肝、膽經(jīng)，有清熱燥濕、瀉肝膽實火的功效[2]。關(guān)龍膽是遼寧省撫順市清原滿族自治縣的國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，其產(chǎn)量占全國北龍膽藥材市場的83%[3]。

植物根際土壤中存在大量微生物，根系微生物通過植物根系分泌物、黏液和脫落的根細胞直接影響根系活力[4]。土壤微生物在土壤功能和植物健康中起著重要作用[5]，土壤中的微生物多樣性和群落組成與土壤傳播的疾病高度相關(guān)[6]。土壤微生物區(qū)系的改變會影響土壤的生態(tài)功能和作物的生長[7-9]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，被認(rèn)為是土壤質(zhì)量不可缺少的組成部分[10-11]。對于以根、根莖入藥的藥用植物，根際微生物對藥用植物的產(chǎn)量與質(zhì)量至關(guān)重要[12]。

目前，關(guān)于龍膽草藥材的研究主要集中在化學(xué)成分、生理生化、藥理藥效及分子生物學(xué)等方面[13-17]，有關(guān)龍膽草根際土壤微生物多樣性的研究較少。本研究以遼寧省撫順市清原滿族自治縣椽子溝村不同種植年限龍膽草的根際土壤為研究對象，采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)分析根際真菌群落的組成及多樣性差異，試圖挖掘龍膽草根際土壤中的有益真菌資源，為探討種植年限對藥用植物土壤微生物結(jié)構(gòu)和群落多樣性差異的影響提供參考，旨在從根系與土壤微生物互作關(guān)系方面入手為藥用植物的生產(chǎn)實踐提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)設(shè)置

本研究對象為遼寧省撫順市清原滿族自治縣椽子溝村（125°06′73.71″N，42°08′93.48″E）山地的栽培龍膽，共選取3塊樣地，即當(dāng)年種植龍膽草的樣地（R1）、種植龍膽草2年的樣地（R2）、種植龍膽草3年的樣地（R3），以距離采龍膽草樣品約50 m且未種植過龍膽草的土壤作為對照（CK）。該地區(qū)屬中溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫為5.3 ℃，無霜期為110～120 d，全年總?cè)照諘r數(shù)為2 419 h，年平均降水量為806.5 mm。在耕作與植物生長過程中進行正常水肥管理。

1.2 根際土壤樣品的采集

于2018年10月15日龍膽草盛花期在3塊樣地分別采集龍膽草根際土壤樣品。根際土壤采用“抖根法”取樣，先將植物根系從土壤中挖出，抖掉與根系結(jié)合松散的土壤，再用毛刷輕輕刷下根系表面土壤。按“S”形采樣方法，隨機選取5個點的樣品后混合。根際土樣用冰盒帶回實驗室并于 -80 ℃ 保存，用于土壤微生物DNA的提取及后續(xù)測試。

1.3 土壤DNA的提取和高通量測序

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法[18]提取土壤基因組DNA。使用Thermo fisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit定量和文庫檢測合格后進行上機測序。

1.4 菌群組成分析和差異分析

使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算 Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)等多樣性指數(shù);使用R軟件繪制稀釋曲線、Rank abundance曲線、物種累積曲線并使用R軟件進行Alpha多樣性指數(shù)的組間差異分析[19]。用Uparse軟件對所有樣品的全部Clean Reads進行聚類，默認(rèn)按97%的一致性將序列聚類成為OTUs，同時選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。用SPSS 2.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋曲線

稀釋曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度。當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量滿足試驗要求，能夠表征土壤樣品中微生物的多樣性[20]。分別隨機抽取真菌測序樣品的ITS1序列讀數(shù)，以其屬或種類數(shù)為縱坐標(biāo)、ITS1序列讀數(shù)為橫坐標(biāo)，獲得真菌的稀釋曲線。如圖1所示，當(dāng)測序量超過8 000讀長時，仍然會有新OTUs出現(xiàn)，但是曲線逐漸趨于平緩，說明測試量達到飽和，真菌群落結(jié)構(gòu)的置信度比較高，能夠比較真實地反映根際土壤中真菌群落的多樣性，即測序深度足以反映本試驗樣本所包含的真菌群落多樣性。

2.2 真菌群落豐富度多樣性統(tǒng)計分析

由表1可知，各樣品測序深度指數(shù)覆蓋率均在0.998以上，說明測序量足以覆蓋樣品的菌落組成。按97%相似性歸并后，4組樣品所含真菌OUT數(shù)量分別為599、419、382、324個，種植不同年限龍膽草的根際土壤OUT數(shù)量排序為CK（未種植）>R1（一年生）>R2（二年生）>R3（三年生）。利用Alpha多樣性分析土壤中真菌群落的豐富度和多樣性，得出不同種植年限龍膽草根際真菌群落豐富度（Richness）指數(shù)（Ace）、群落多樣性（Diversity）指數(shù)香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)存在并呈現(xiàn)如下規(guī)律：CK>R1>R2>R3。結(jié)果表明，對照土壤中的真菌多樣性比種植龍膽草的根際土壤豐富，可能是由于龍膽草根系對根際土壤真菌具有選擇性;隨著種植年限增加，多樣性指數(shù)均呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，說明種植龍膽草明顯降低了土壤真菌的多樣性，種植使土壤真菌群落的種類趨于單一化，且種類數(shù)量降低。

2.3 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

物種組成分析能夠反映樣品在分類學(xué)水平的群落結(jié)構(gòu)。4個處理不同年限龍膽草根際土壤中的真菌分屬于11門28綱59目109科173屬。如圖2所示，不同種植年限龍膽草根際土壤的最主要類群均為子囊菌門（Ascomycota），相對豐度排序為R2（66.38%）>R3（65.70%）>R1（56.53%）>CK（53.99%）;其次是擔(dān)子菌門（Basidiomycota），相對豐度在1%～5%之間。另外還有相對豐度約為30%左右的待定真菌（Fungi_unclassified）等類群在GenBank中沒有被明確分類。如圖3所示，散囊菌綱（Eurotiomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、圓盤菌綱（ Orbiliomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、錘舌菌綱（Leotiomycetes）等真菌組成了土壤群落中真菌綱的優(yōu)勢菌綱群，總相對豐度排序為R2（65.79%）>R3（65.26%）>R1（53.38%）>CK（50.95%）;另外還有待定真菌（Fungi_unclassified）等類群在GenBank中沒有被明確分類，其相對豐度排序為CK（46.96%）>R1（41.38%）>R2（33.06%）>R3（28.01%）。

2.4 不同年限土壤真菌菌群的分類學(xué)組成分析

使用R軟件，選取土壤真菌菌群豐度排名前35的屬，根據(jù)其在各個土壤處理中的豐度信息，從真菌菌群種類、土壤處理2個層面進行聚類，根據(jù)聚類結(jié)果對分類單元和樣品分別進行排序繪制成熱圖。通過聚類，能夠區(qū)分高豐度和低豐度的分類單元，紅色、藍色代表菌屬的豐度，越偏向紅色表明豐度越高，越偏向藍色表明豐度越低。

對不同年限龍膽草根際真菌在屬種水平上進行分析。如圖4所示，根據(jù)進化關(guān)系，真菌群落OUT在縱向上可以聚類為兩大類，根據(jù)變化趨勢可分為4類，菌群I在R1組的豐度最高，R2、R3組次之，CK組最低;菌群Ⅱ在R3組的豐度最高，R2、R1組次之，CK組最低。菌群Ⅰ、菌群Ⅱ聚為一類。菌群Ⅲ中CK組的豐度顯著高于其他3組，菌群Ⅳ在R2組的豐度最高。35個屬中有2個擔(dān)子菌門、1個毛霉門（Mucoromycota），其他均為子囊菌門。

隨著龍膽草種植年限的增加，土壤環(huán)境隨之改變，進而影響土壤真菌的種群數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)。由圖4可以看出，菌群Ⅰ中赤霉菌（Gibberella）、磚隔腔菌（Capronia）、Acrophialophora、傘狀霉屬（Umbelopsis），菌群Ⅱ中炭疽菌屬（Colletotrichum）、Saitozyma、擬球腔菌屬（Paraphaeosphaeria）和木霉屬（Trichoderma）均表現(xiàn)為隨種植年限增加菌群豐度增加，并且在種植至3年時炭疽菌屬成為優(yōu)勢菌屬。炭疽屬和擬球腔菌屬中的部分真菌為致病菌。菌群Ⅲ中的菌屬均表現(xiàn)為隨種植年限的增加而菌群豐度顯著減少，具體有小球腔菌屬（Leptosphaeria）、螺旋聚孢霉（Clonostachys）、水生真菌（Tetracladium）、油脂酵母（Lipomyces）、Calophoma、Cutaneotrichosporon、鏈格孢屬（Alternaria）、地絲霉屬（Geomyces）、莫勒盤菌（Moellerodiscus）、漆斑菌（Myrothecium）、淺色尾孢屬（Pallidocercospora）、青霉屬（Penicillium）、棒束孢屬（Isaria）、擬盾殼霉屬（Paraconiothyrium）、異莖點霉屬（Paraphoma）等。其中螺旋聚孢霉、異莖點霉屬為有益菌屬，具有抑菌作用。

為了尋找樣本之間優(yōu)勢物種的差異，使用R軟件vcd包ternaryplot命令進行Ternaryplot分析。選取不同種植年限龍膽草處理在種水平上平均豐度排名前10的物種，生成ternaryplot三元相圖。圖中3個頂點代表3個處理分組，圓圈代表物種，圓圈大小與相對豐度成正比，圓圈離哪個頂點越近，表示真菌群落種類在這個分組中的含量越高，以便直觀地查看不同種植年限龍膽草與未種植龍膽草土壤根際真菌優(yōu)勢物種在種水平上的差異。如圖5、圖6所示，CK組的優(yōu)勢菌屬為蟲花棒束孢（Isaria_farinosa）、羊毛狀青霉（Penicillium lanosum）和Mycosphaerella_polygoni-cuspidati，豐度較高，與R1、R2和R3組間差異顯著;R3組的優(yōu)勢菌組為隱球菌（Saitozyma podzolica）、鉤狀木霉（Trichoderma hamatum），其豐度較其他組高。值得關(guān)注的是，在R2組到R3組2組數(shù)據(jù)的比較中，茄鐮孢菌（Fusarium solani）表現(xiàn)為上升趨勢，最終成為R3組的優(yōu)勢菌株，而茄鐮孢菌（Fusarium solani）能夠在多種作物中引發(fā)真菌病害。

2.5 Beta多樣性分析

無度量多維標(biāo)定法（non-metric multi-dimensional scaling，NMDS）[21]是基于Bray-Curtis距離進行分析的非線性模型，根據(jù)不同種植年限龍膽草土壤中包含的真菌群落信息，以點的形式反映在二維平面上。通過點與點間的距離，反映樣本的組間、組內(nèi)差異等?；诓煌晗摭埬懖莞H真菌測序所得OTU水平的NMDS分析結(jié)果見圖7，同一組樣本使用同種顏色表示。當(dāng)Stress小于0.2時，說明NMDS可以準(zhǔn)確反映樣本間的差異程度。在整體情況下，不同組間具有明顯差異。CK組的位置與R1、R2和R3組之間的距離較遠， 并且分布在不同象限內(nèi)。各種植組內(nèi)數(shù)據(jù)點間的距離較近，且在同一區(qū)域內(nèi)，不同年限處理間的分布相對較均勻。以上結(jié)果說明，種植龍膽草能夠改變土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，并且隨著種植年限的增加，群落結(jié)構(gòu)逐漸改變。

基于Unweighted Unifrac距離進行PCoA（Principal Co-ordinates Analysis）分析，選取貢獻率最大的主坐標(biāo)組合進行作圖。處理間距離越接近，表示真菌群落組成結(jié)構(gòu)越相似，因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的處理聚集在一起，群落差異很大的樣本則遠遠分開。如圖8所示，不同年限龍膽草根際真菌群落變化與NMDS分析結(jié)果一致，CK組的位置與R1、R2和R3組之間的距離較遠。R3組表現(xiàn)出明顯的組內(nèi)聚集，表明同一處理的土壤樣品具有極相似的真菌群落結(jié)構(gòu)，并且二年生龍膽草土壤和三年生龍膽草土壤距離較近，說明二、三年生龍膽草土壤中的真菌群落結(jié)構(gòu)具有較高的相似性。一年生龍膽草處理與二、三年生龍膽草處理各點距離較遠，說明一年生和二、三年生龍膽草土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的相似性較低。

3 結(jié)論與討論

本研究使用高通量測序技術(shù)從遼寧省撫順市清原滿族自治縣不同年限龍膽草根際土壤中獲得真菌ITS1序列分別隸屬于11門28 綱59目109科173屬，稀釋曲線表明，測試量達到飽和，能夠比較真實地反映根際土壤中真菌群落的多樣性，測序深度足以反映該群落樣本所包含的真菌群落多樣性。

本研究通過對不同年限種植龍膽草和未種植龍膽草根際土壤真菌OUT數(shù)量及多樣性指數(shù)比對發(fā)現(xiàn)，未種植龍膽草土壤CK組中的真菌多樣性較種植龍膽草的根際豐富，而種植龍膽草土壤根系真菌群落多樣性指數(shù)隨年限增加呈明顯下降趨勢，種植3年的龍膽草多樣性指數(shù)最低，且豐度最低。植物根系對根際微生物具有選擇性將導(dǎo)致根際微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的顯著差異[13]。植物根系對根際土壤真菌具有一定的選擇性[22]，沒有種植苧麻的根際土壤真菌多樣性較種植苧麻的土壤豐富，不同根型苧麻對根際定殖的真菌類群仍存在選擇性[23]。研究結(jié)果表明，種植龍膽草年限增加影響了土壤真菌群落的多樣性和豐度，趨勢呈負相關(guān)，土壤真菌群落變得種類簡單且豐度降低，與前人的研究結(jié)果一致。

根際微域內(nèi)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與根系活動關(guān)系密切[24]，有研究發(fā)現(xiàn)，土壤根際真菌多樣性及群落構(gòu)成變化使真菌多樣性指數(shù)顯著降低，群落結(jié)構(gòu)失衡，可能導(dǎo)致西洋參根腐病發(fā)生[25]。生物炭添加使馬鈴薯根際土壤中擔(dān)子菌門數(shù)量呈下降趨勢，這可能會對植物生長有益[26]。連作土壤微生物環(huán)境由細菌型轉(zhuǎn)向真菌型[27-28]，人參、三七作為藥用植物中研究得較詳細的作物，基于真菌ITS1測序分析對連續(xù)種植過程中根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究結(jié)果表明，根際微生物群落結(jié)構(gòu)對于人參、三七可持續(xù)管理和生產(chǎn)至關(guān)重要[29-31]。隨著地黃種植年限的增加，其根際致病真菌尖孢鐮刀菌、木霉和黃曲霉等真菌種類和數(shù)量顯著增加[32-33]。本研究結(jié)果表明，隨著種植年限增加，龍膽草根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)改變差異顯著。差異分析結(jié)果顯示，炭疽菌屬和茄鐮孢菌由未種植時豐度極低的裝填轉(zhuǎn)變成為優(yōu)勢菌屬，其他種植3年的優(yōu)勢菌屬Saitozyma、Paraphaeosphaeria和木霉屬的豐度顯著高于其他處理根際土樣，炭疽菌屬和茄鐮孢菌在其他物種上已被證明為致病真菌，可能是龍膽草根腐病發(fā)生的病原菌，可能是由于這些真菌的積累導(dǎo)致藥用植物的質(zhì)量和品質(zhì)下降，這幾個屬的真菌可能對龍膽草葉枯病的發(fā)生具有重要意義，在后續(xù)研究中應(yīng)重點關(guān)注。

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